Identification of antibacterial substances from Bacillus amyloliquefaciens HE and analysis of antibacterial characteristics
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摘要:
为明确解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HE发酵液中的活性成分及抗菌特性，根据解淀粉芽孢杆菌发酵液抑菌活性稳定性，用PCR检测脂肽合成相关的基因，再采用UPLC-Q-TOF-MS对活性物质进一步分析；用二倍稀释法测定脂肽对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，并从显微结构上来探讨其抗菌作用。稳定实验表明该菌株产生抑菌活性物质对高温、酸、碱和蛋白酶具有一定的耐受性；4对引物的扩增产物经过克隆、测序和BLAST分析，表明解淀粉芽孢杆菌HE基因组含有ituA、fenB、sfP、mycB的脂肽合成相关基因；液质联用分析发现脂肽粗提物中含有Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素；抑菌圈法测定抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为137.97 μg·mL−1；显微特征表明脂肽可以导致嗜水气单胞菌细胞膜塌陷和孔洞。该研究结果可为解淀粉芽孢杆菌活性代谢产物结构鉴定和安全性评价提供参考。
Abstract:To investigate the antibacterial substances from Bacillus amyloliquefaciens HE and antibacterial characteristics, we synthetized the genes related to lipopeptides synthesis by PCR detection according to the stability of B. amyloliquefaciens fermentation broth, and further analyzed the active substances by UPLC-Q-TOF-MS. Then we applied the inhibition zone method to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of lipopeptide against Aeromonas hydrophila, whose antimicrobial activity was discussed from the microscopic structure. The antimicrobial active substances were stable against high temperature, acid, acid-base and protease. The PCR with four primer pairs were cloned and sequenced. The BLAST analysis shows that the ituA, fenB, sfP and mycB genes existed in the genome of B. amyloliquefaciens HE. Three kinds of lipopetides (Surfactin, Iturin and Fengycin) were identified in the antimicrobial extract by mass spectrum analysis. The MIC and MBC of antimicrobial lipopetides against A. hydrophila were both 137.97 μg·mL−1 by inhibition zone method. The microscopic characteristics indicate that lipopeptides can cause membrane collapse and holes in A. hydrophila cells. The results provide references for the structural identification and safety evaluation of active metabolites of B. amyloliquefaciens.
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鲟是鲟形目鱼类的总称，为世界上最古老的鱼类之一[1]，具有较高的经济价值[2]。西伯利亚鲟 (Acipenser baerii) 和施氏鲟 (A. schrenckii) 均属于鲟形目、鲟科、鲟属。西伯利亚鲟俗称“尖吻鲟”，在国内仅分布于新疆额尔齐斯河流域[3]；施氏鲟俗称“七粒浮子”，是我国最早开发利用的鲟类之一[4]，具有生长速度快、抗病力强等优点。目前，养殖纯种鲟普遍存在生长速度慢、病害频发、鱼子酱品质较低等缺点[5]。研究表明，鲟属之间的杂交所获得的杂交种在生长和繁殖方面通常显示出一定的优势[6]。因此，鲟鱼杂交种越来越受到生产者的青睐。本试验采用的杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 具有生长速度快、养殖病害少、适温范围广、运输应激小等优点[7]，近年来已成为我国主要的人工养殖淡水鲟类，市场前景十分广阔。
研究鱼类早期发育对鱼类人工繁殖和苗种培育具有重要意义[8]，并且是构建鱼类人工繁育体系的基础。掌握鱼类早期发育的特点可以有效提高苗种成活率，如徐秋艳[9]在养殖西杂鲟时，分别从亲鱼选择与培育、人工催产与授精、苗种培育以及亲鱼产后护理等方面阐述了提高苗种成活率的具体措施，对于扩大种群资源具有重要意义[10]。
目前，众多学者已对西伯利亚鲟[11]、中华鲟 (A. sinensis)[12]、施氏鲟[13]、匙吻鲟 (Polyodon spathula)[14]、小体鲟 (A. ruthenus)[15]、施杂鲟 (施氏鲟♀×西伯利亚鲟♂)[16] 等多种鲟鱼的胚胎发育进行了研究，但对于杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 的胚胎发育过程以及早期仔鱼发育情况，尚缺乏较为详尽的研究报道。本研究对杂交鲟胚胎发育及早期仔鱼生长进行了系统观察，并详细记录了各阶段的形态特征，旨在丰富杂交鲟繁殖生物学基础研究，为进一步发掘鲟鱼的繁殖性能提供基础数据和技术支撑，以期推动鲟鱼养殖业的可持续发展。
1. 材料与方法
1.1 亲鱼来源
试验所用亲鱼选自四川润兆渔业有限公司。其中母本西伯利亚鲟80尾，10龄以上，体质量为 (47.55±5.85) kg，全长为 (130.00±7.67) cm；父本施氏鲟11尾，8龄以上，体质量为 (12.35±0.95) kg，全长为 (103.00±2.00) cm。所选亲鱼体质健壮，外表光滑无伤，生长发育状况良好。人工催产期间水温为 (16.60±0.60) ℃。
1.2 方法
1.2.1 亲鱼选择与成熟度鉴定
生殖期的雌鱼体表黏液较多，生殖孔红肿外翻 (图1-a)，腹部膨大且按压会回弹；而生殖期的雄鱼从外观上没有明显的特征 (图1-b)，外表难以鉴别。目前普遍采用穿刺法判断卵细胞的成熟度：雌鱼成熟卵卵径 >2.8 mm，灰黑色、圆粒形、有弹性且两级分化明显，动物极一端出现色素环，中央有白色极斑 (图1-c)。卵母细胞的成熟度主要根据极化指数 (Polarization Index，PI值) 判断，PI值是指卵核到动物极卵膜内侧 (即图1-d中AB) 与卵长径 (动物极到植物极的卵径，即图1-d中AC) 的比值，PI值越小，表示卵细胞的成熟度越好[17]。将卵子用开水煮5 min，固定后用刀片沿着动物极中心轴切开，正放于载玻片上，在体视显微镜 (Olympus, SZX16) 下观察并测量细胞核的极化程度 (图1-d)，选择PI值 <0.1的雌鱼作为催产亲鱼。雄鱼成熟度的鉴别同样采用穿刺法，以采集到白色块状物判断其成熟度。
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图 1 亲鱼雌雄与成熟度鉴定注：a为生殖期的雌鱼生殖孔；b为生殖期的雄鱼生殖孔；c为成熟卵细胞 (动物极观)；d中AC为卵长径，AB为卵核到动物极卵膜内侧长度，PI=AB/AC。Figure 1. Identification of male and female parent fish and maturityNote: a. The genital orifice of a female fish; b. The genital orifice of a male fish; c. The mature egg cell (animal view) ; in figure d, AC represents the egg length diameter, while AB represents the length from the egg nucleus to the inner side of the animal's polar oval membrane, PI=AB/AC.1.2.2 催产及人工授精
采用促黄体素释放激素A2 (LHRH-A2, 4~10 μg·kg−1) 和马来酸地欧酮 (DOM, 1~5 mg·kg−1) 的混合药物作为催产剂，所有雌鱼在注射时使用胸鳍基部2次注射法，第1次注射全部剂量的10%~20%，第2次注射剩余剂量；雄鱼采用1次注射法，在雌鱼注射第2针时同时注射，注射剂量为雌鱼的一半，注射部位与雌鱼注射部位一致。雄鱼的效应时间为6~8 h，雌鱼效应的时间为8~20 h。
挤出精、卵后采用干法授精，每4万~7万粒卵加入1~2 mL精液，加入清水激活精子，搅拌均匀后静置5 min，漂洗2~3次以去除黏液和多余的杂质。再利用滑石粉持续脱黏1 h左右后放入孵化筛中进行孵化[18]，孵化期间水温为16.3~17.1 ℃，平均溶解氧 (DO) 质量浓度为9.0 mg·L−1，pH 为7~8，每天早晚用塑料吸管挑出死卵。
1.2.3 胚胎发育和仔鱼生长观察
胚胎发育观察：每次随机选取同批次的受精卵30粒，在体视显微镜下观察胚胎发育各个时期的形态特征变化，并记录发育时间、温度和发育特征。受精卵阶段每隔10~20 min取样观察，卵裂阶段和囊胚阶段每隔1~2 h取样观察，原肠胚阶段到出膜阶段每隔2~4 h取样观察。参考已有的方法[13-14,19-20] 并根据显微镜下观察到的特征，对胚胎发育过程进行分期，以50%以上个体出现同一新特征时作为发育到一个新时期的起始时间。
早期仔鱼观察：以同批次孵化出膜的仔鱼为观察对象，每日随机选取10尾，观察记录仔鱼形态变化和器官发育情况。按照公式计算卵黄囊体积：卵黄囊体积=卵黄囊长径×(卵黄囊短径)2×π/6[21]。
1.3 繁殖效率评价指标
催产率、受精率和孵化率的计算公式分别为：催产率=产卵鱼数/催情鱼总数×100%，受精率=原肠中期活卵数/产卵总数×100%，孵化率=水花鱼苗/受精卵总数×100%。
数据经Excel 2021、Graphpad Prism 9.1和Adobe Photoshop CC 2023等软件整理并作图，结果以“平均值±标准误 ($\overline { x}\pm s_{\overline { x}} $)”表示。
2. 结果
2.1 人工繁殖情况
2022年3—4月，共催产11批杂交鲟 (母本80尾，父本11尾)，平均催产率为100%，受精率为 (80.08±8.57)%，孵化率为 (63.69±10.71)%。其中，4月30日催产的第11批受精率最高，达到90.33%，孵化率最高的是3月30日催产的第8批，达到77.53%，3月31日催产的第9批受精率和孵化率最低，分别为65.58%和26.47% (表1)。
表 1 2022年3—4月杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 人工繁殖情况Table 1. Artificial breeding of hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂) during March–April 2022批次
Batch催产日期
Spawning date雌鱼
Number of female/尾雄鱼
Number of male/尾催产水温
Spawning water temperature/℃催产率
Spawning rate/%第1批 1st batch 2022-03-01 12 1 16.00 100.00 第2批 2nd batch 2022-03-08 6 1 16.20 100.00 第3批 3rd batch 2022-03-09 8 1 16.10 100.00 第4批 4th batch 2022-03-11 9 1 16.20 100.00 第5批 5th batch 2022-03-12 9 1 16.70 100.00 第6批 6th batch 2022-03-23 7 1 16.90 100.00 第7批 7th batch 2022-03-24 10 1 16.70 100.00 第8批 8th batch 2022-03-30 5 1 16.60 100.00 第9批 9th batch 2022-03-31 7 1 16.80 100.00 第10批 10th batch 2022-04-20 4 1 17.00 100.00 第11批 11th batch 2022-04-30 3 1 17.20 100.00 平均值 Mean 7 1 16.58 100.00 批次
Batch产卵数
Number of eggs/
万粒受精数
Number of
fertilized eggs/万粒受精率
Fertilization
rate/%出苗数
Number of
fry hatched/万粒孵化率
Hatching
rate/%第1批 1st batch 176.00 140.80 80.00 78.00 55.40 第2批 2nd batch 90.80 61.49 67.72 33.00 53.67 第3批 3rd batch 90.00 81.17 90.19 58.20 71.70 第4批 4th batch 96.00 66.22 68.98 26.85 50.54 第5批 5th batch 118.05 99.28 84.10 73.13 73.66 第6批 6th batch 109.20 97.90 89.65 60.00 61.29 第7批 7th batch 128.00 103.56 80.91 75.70 73.09 第8批 8th batch 112.80 93.04 82.48 72.13 77.53 第9批 9th batch 118.80 77.91 65.58 20.62 46.47 第10批 10th batch 77.60 62.84 80.98 11.92 70.84 第11批 11th batch 39.60 35.77 90.33 24.60 66.41 平均值 Mean 105.20 83.63 80.08 48.56 63.69 2.2 胚胎发育时序及特征
参照其他工作者的研究结果，根据实际观察到的胚胎发育顺序及形态特点，将杂交鲟胚胎发育分为7个阶段，共34个时期 (表2、图2)。在水温 16.3~17.1 ℃的条件下，经124~134 h孵化出膜，发育总积温为 2 083~2 251 h·℃。
表 2 杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 胚胎发育Table 2. Embryonic development of hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂)胚胎发育阶段
Embryonic
development发育时期
Development
stage受精后时间
Time after
fertilization发育时间
Development
time水温
Water
temperature/℃积温
Accumulative
temperature/(h·℃)受精卵阶段 Fertilized egg 两极转动期 Pole conversion period 0 0 17.00 0 卵周隙形成期 Perivitelline space formation 30 min 30 min 17.10 8.55 胚盘隆起期 Blastodisc stage 1 h 30 min 1 h 17.00 17.00 卵裂阶段 Cleavage stage 2细胞期 2-cell stage 3 h 30 min 2 h 17.00 34.00 4细胞期 4-cell stage 4 h 30 min 1 h 17.10 17.10 8细胞期 8-cell stage 5 h 30 min 1 h 16.90 16.90 16细胞期 16-cell stage 6 h 30 min 1 h 16.90 16.90 32细胞期 32-cell stage 7 h 30 min 1 h 16.90 16.90 多细胞期 Multicellular stage 9 h 30 min 2 h 16.80 33.60 囊胚阶段 Blastula stage 囊胚初期 Initial blastula stage 11 h 30 min 2 h 16.70 33.40 囊胚中期 Mid-blastula stage 12 h 30 min 1 h 16.70 16.70 囊胚晚期 Late blastula stage 14 h 30 min 2 h 16.70 33.40 原肠胚阶段 Gastrula stage 原肠初期 Initial gastrula stage 18 h 3 h 30 min 16.70 58.45 原肠早期 Early gastrula stage 22 h 4 h 16.90 67.60 原肠中期 Midgastrula stage 26 h 4 h 16.70 66.80 大卵黄栓期 Big yolk plug stage 29 h 3 h 16.90 50.70 小卵黄栓期 Small yolk plug stage 31 h 2 h 16.60 33.20 隙状胚孔期 Lyriform blastopore formation 36 h 30 min 5 h 30 min 16.30 89.65 神经胚阶段 Neural stage 神经胚早期 Warly neurula stage 43 h 6 h 30 min 16.50 107.25 宽神经板期 Wide neural plate formation 44 h 30 min 1 h 30 min 16.50 24.75 神经褶靠拢期 Neural fold closing stage 49 h 4 h 30 min 16.90 76.05 神经胚晚期 Late neurula stage 51 h 30 min 2 h 30 min 16.80 42.00 神经管闭合期 Neural tube closing stage 52 h 30 min 1 h 16.80 16.80 器官形成阶段 Organogenesis stage 眼囊形成期 Eye sac formation 54 h 1 h 30 min 16.70 25.05 尾芽形成期 Caual bud appearance 59 h 30 min 5 h 30 min 16.70 91.85 尾芽分离期 Caual bud separating stage 66 h 30 min 7 h 16.70 116.90 短管心脏期 Shorttubular heart formation 69 h 30 min 3 h 16.40 49.20 长管心脏期 Longtubular heart formation 71 h 30 min 2 h 16.50 33.00 听板形成期 Otic placode appearance 76 h 4 h 30 min 16.50 74.25 肌肉效应期 Stage of muscular effect 79 h 3 h 16.40 49.20 心跳期 Stage of heart beating 95 h 30 min 16 h 30 min 16.40 270.60 尾达头部期 The tail touches the head 104 h 30 min 9 h 17.00 153.00 出膜阶段 Hatching stage 出膜前期 Hatching prophase 118 h 13 h 30 min 16.80 226.80 出膜期 Hatching stage 124~134 h 6 ~16 h 16.80 100.8~268.8 ![]()
图 2 杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 胚胎发育过程注：A-1、A-2. 两极转动期；B. 卵周隙形成期；C. 胚盘隆起期；D、E、F. 2细胞期、4细胞期、8细胞期；G-1、G-2. 16细胞期 (动物极观)、16细胞期 (植物极观)；H-1、H-2. 32细胞期 (动物极观)、32细胞期 (植物极观)；I. 多细胞期；J. 囊胚初期；L. 囊胚中期；M. 囊胚晚期；N. 原肠初期；O. 原肠早期；P. 原肠中期；Q. 大卵黄栓期；K. 小卵黄栓期；S. 隙状胚孔期；T-1、T-2. 神经胚早期；U-1、U-2. 宽神经板期；V. 神经褶靠拢期；W. 神经胚晚期；X. 神经管闭合期；Y. 眼囊形成期；Z. 尾芽形成期；AA. 尾芽分离期；AB-1、AB-2、AB-3. 短管心脏期；AC-1、AC-2. 长管心脏期；AD-1、AD-2. 听板形成期；AE-1、AE-2. 肌肉效应期；AF. 心跳期；AG. 尾达头部期；AH. 出膜前期；AI. 出膜期；AJ-1. 尾部先出膜方式；AJ-2. 头部先出膜方式。Figure 2. Embryonic development of hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂)Note: A-1, A-2. Bipolar rotation stage; B. Perioval gap formation stage; C. Placental uplift; D, E, F. 2-cell stage, 4-cell stage, 8-cell stage; G-1,G-2. 16 cell stage (Animal polar stage), 16-cell stage (Plant polar stage); H-1, H-2. 32 cell stage (Animal polar stage), 32 cell stage (Plant polar stage); I. multicellular stage; J. early blastocyst stage; L. mid-blastocyst stage; M. late blastocyst stage; N. Primary gastrul stage; O. Early gastrul stage; P. Mid-gastrul stage; Q. Large yolk suppository stage; K. Small yolk suppository stage; S. Gap embryonic stage; T-1, T-2. Early neuroembryonic stage; U-1, U-2. Wide neural plate stage; V. Neural fold convergence stage; W. Late neuroembryonic stage; X. Neural tube closure stage; Y. Eye capsule formation stage; Z. Tail bud formation stage; AA. tail bud isolation stage; AB-1, AB-2, AB-3. short tube cardiac stage; AC-1, AC-2. long tube heart stage; AD-1, AD-2. Listening plate formation stage; AE-1, AE-2. Muscular effector phase; AF. Heartbeat phase; AG. Tail reaching head stage; AH. Premembrane exit; AI. Membrane release phase; AJ-1. Tail first membrane exit method; AJ-2. Head first membrane exit method.2.2.1 受精卵阶段
杂交鲟的受精卵为沉性卵，卵膜3层，卵径 (2.50±0.56) mm，灰黑色，不透明，卵黄丰富。受精卵的动物极始终朝上，植物极朝下，动物极中央出现明亮的极性斑 (图2-A-1、2-A-2)；受精后30 min，中央极性斑消失，卵周隙扩大 (图2-B)。受精后1 h，原生质向动物极集中，隆起形成胚盘 (图2-C)。
2.2.2 卵裂阶段
受精后3 h 30 min，胚盘开始分裂，动物极被分裂形成2个大小相等的细胞 (图2-D)；1 h后，再次分裂为4个等大的分裂球 (图2-E)，前两次卵裂的分裂面互相垂直，受精后5 h 30 min~7 h 30 min，依次进行第3、第4、第5次卵裂 (图2-F—2-H-2)，最终形成32个排列不规则且大小不一的细胞，每次形成的分裂面都与上一次的分裂面垂直，细胞间的轮廓比较清晰。2 h后动物极被分裂成多个不规则细胞，并出现色素，植物极被完全分裂，为多细胞期 (图2-I)。
2.2.3 囊胚阶段
随着卵裂的继续进行，分裂球变得更小。受精后11 h 30 min，动物极中央色素深、外沿色素浅，细胞变小，且细胞核分裂同步，细胞界限清晰 (图2-J)；1 h后，动物极细胞继续变小，细胞间隙逐渐明显 (图2-L)；2 h后，细胞越来越小且界限模糊，形成囊胚腔 (图2-M)。
2.2.4 原肠胚阶段
囊胚层细胞继续沿卵黄囊外周向植物极端下包，受精后18 h，赤道处出现一条深色素带 (图2-N)，为原肠初期。受精后22 h，色素带下延超过赤道产生一个短而浅的狭缝状胚孔 (图2-O)；4 h后，外胚层覆盖胚胎表面的2/3 (图2-P)，为原肠中期；受精后29 h，植物极的卵黄栓像一个大塞子嵌在胚环内 (图2-Q)，为大卵黄栓期；2 h后，植物极的卵黄栓似小塞子嵌在胚环内 (图2-R)，为小卵黄栓期。
2.2.5 神经胚阶段
受精后36 h 30 min，卵黄栓消失，胚孔靠近呈现隙状 (图2-S)；受精后43 h，可见背部形成神经板，隙状胚孔处形成神经沟，脑部出现神经褶 (图2-T、2-U)，进入神经胚早期；1 h 30 min后，神经板周围可以看到“马蹄”形神经褶，神经板中央出现神经沟 (图2-U-1、2-U-2)，为宽神经板期；受精后49 h，神经褶靠拢，神经板下陷变窄，出现排泄系统原基 (图2-V)，即为神经褶靠拢期；受精后51 h 30 min，头部神经褶靠近，躯干部出现排泄系统原基 (图2-W)，即为神经胚晚期；1 h后，神经板闭合形成神经管，头部分化出前、中、后3个脑泡，头和尾部明显，躯干部可见直线肌节 (图2-X)，为神经管闭合期。
2.2.6 器官形成阶段
受精后54 h，前脑出现2个眼突，即眼原基，中脑出现第1对咽弧原基 (图2-Y)，为眼囊形成期；受精后59 h 30 min，脑室稍隆起，侧板达到头部前端，排泄系统分化出肾小管原基，尾部扁平 (图2-Z)，为尾芽形成期；受精后66 h 30 min，侧板融合一侧出现心脏原基，头部可见3对月牙型咽弧原基，尾芽突出呈棒状，尾尖略游离卵黄囊 (图2-AA)，为尾芽分离期；受精后69 h 30 min，心脏呈短管状，较短，略超过头部 (图2-AB-1、2-AB-2、2-AB-3)，为短管心脏期；2 h后心脏呈长管状，略弯曲，视泡明显 (图2-AC-1、2-AC-2)，为长管心脏期；受精后76 h，心脏呈小“C”型，椭圆形听板出现 (图2-AD-1、2-AD-2)，称为听板形成期；受精后79 h，头尾开始摆动，肌肉颤动，尾的末端接近心脏，有微弱搏动，出现嗅板和听泡 (图2-AE-1、2-AE-2)，为肌肉效应期；受精后95 h，心脏呈大“C”形，心脏搏动有节律性，血液呈乳白色，肌肉能收缩，尾端接触心脏，尾端游离胚胎1/3，可大幅摆动 (图2-AF)，称为心跳期；9 h后尾端接触头部，鳍褶变宽，出现肛门原基，胚胎在膜内经常转动，出现黑色素颗粒，眼呈新月形 (图2-AG)，为尾达头部期。
2.2.7 出膜阶段
受精后118 h，尾端略过头部，卵黄囊上血管明显，心跳加快，胚胎剧烈扭动，此时卵膜极易破裂 (图2-AH)，为出膜前期；受精后124~134 h，尾的末端达到间脑，鳃盖形成，血液循环到达尾部，仔鱼陆续出膜 (图2-AI)，为出膜期。出膜方式有尾部先出膜 (图2-AJ-1) 和头部先出膜 (图2-AJ-2) 2种。
2.3 早期仔鱼生长发育
杂交鲟早期仔鱼发育可分为3个阶段[18]：内源营养期，即从仔鱼刚出膜 (0 d) 到仔鱼开口摄食 (7 d)；混合营养期，即从具有开口摄食能力 (7 d) 到卵黄囊完全被吸收 (10 d)；10 d后完全摄食外源营养，进入外源营养期。
如图3所示，初孵仔鱼全长 (10.61±0.58) mm，卵黄囊约占全长的2/3。头部比较小，紧贴于卵黄囊。卵黄囊分为前后两部分，前半部分为圆球状，后半部分为短棒状，此时眼部黑色素颗粒较少。1日龄仔鱼的头部上抬与身体保持水平，口腔开始分化，卵黄囊体积逐渐变小，眼部黑色素颗粒增多；2日龄仔鱼的口腔和消化系统进一步分化，卵黄囊体积明显变小，眼部黑色素明显增多，体色素增多，可见肠道以及肠内出现少量黑色素栓；3日龄仔鱼的卵黄囊体积持续变小，尾部出现黑色素颗粒，游泳能力逐渐增强，但无法控制平游，只能做上下垂直运动；4日龄仔鱼的卵黄囊呈条状，全身分布不规则的黑色素颗粒，可见清晰的红色血液循环路径；5日龄仔鱼的头部变宽，脑部变大，背鳍和尾鳍开始分开，胸鳍出现；6日龄仔鱼的背鳍和尾鳍进一步分开，体色加深，体内黑色栓排出，池底可见大量黑色素栓，大部分仔鱼聚集在池底或沿壁活动，此时能平稳水平游动；7日龄仔鱼的头部前伸，背鳍和尾鳍完全分开，脊索向上弯曲，卵黄囊仅剩一小部分，此时仔鱼全长增长到 (17.17±0.64) mm，且可以自主摄取外界食物，但效果较差，容易死亡。
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图 3 杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 卵黄囊期仔鱼发育特征注：0—7分别表示出膜日龄；拍摄方位：头朝前，左侧观。Figure 3. Developmental characteristics of hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂) larvae at yolk sac stageNote: 0–7 represent age at film emergence respectively; Location: Head forward, left view.如图4所示，杂交鲟卵黄囊期仔鱼从初孵到卵黄完全吸收共历时10 d，卵黄囊吸收曲线V=12.53e−0.562t (r2=0.967 4)，呈指数衰减型函数。仔鱼消耗卵黄的能力随生长发育阶段不断加强，在第7天开口并进入混合营养期，到第10天时卵黄被完全吸收，进入外源营养期，混合营养期仅持续3 d。
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图 4 杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 卵黄囊期仔鱼卵黄吸收过程Figure 4. Process of yolk sac absorption in hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂)通过拟合生长曲线，杂交鲟卵黄囊期仔鱼全长与日龄的关系符合指数增长型函数 (图5)，生长方程为L=10.964e0.065 6t (r2=0.978 9, 1≤t≤8)。杂交鲟卵黄囊期仔鱼体质量与日龄的生长方程为M= −0.000 2t2+0.002 9t+0.012 9 (r2=0.983 6, 1≤t≤8)。
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图 5 杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 卵黄囊期仔鱼全长、体质量与日龄的关系Figure 5. Relationship between total length, body mass and age of day of hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂) at yolk sac stage3. 讨论
3.1 影响杂交鲟人工繁殖效率的因素
研究鲟鱼人工繁殖技术，掌握影响繁殖效率的重要因素，对于解决我国鲟鱼苗种供应问题、拓展我国鲟鱼产业的深度、保护野生鲟鱼种质资源等方面具有重要意义[22]。人工繁殖的效率受诸多因素的影响，如催产药物、水温、DO以及亲鱼质量等[23]。目前鲟类人工繁殖常用的催产剂有LHRH-A2、鲤鱼脑垂体、DOM等[19,24]。
本试验人工催产杂交鲟所采用的试剂及方法与朱华等[25] 总结出的人工催产俄罗斯鲟 (A. gueldenstaedtii) 的最佳剂量与注射方式基本一致，而罗江等[26] 总结出人工催产中华鲟的剂量与本研究相比较低，这可能与亲鱼的体质量以及成熟度有关。DO是影响人工繁殖效率的重要因素之一，鲟鱼对DO要求较高，水中DO下降会阻碍其生长、繁殖等[9]。本试验中，杂交鲟孵化期间水中的平均DO质量浓度为9.00 mg·L−1，高于肖鑫鑫等[27] 在催产杂交鲟 (达氏鳇Huso dauricus ♀×施氏鲟A. schrenckii ♂) 时的水平，表明DO充足。除了这两个因素之外，鱼类在产卵期间对水温也极为敏感，对于冷水鱼，水温突然升高会导致产卵停止或流产[28]，进而影响繁殖。本试验催产及孵化期间的水温保持在 (16.60±0.60) ℃，符合鲟鱼的最佳繁殖条件。
本试验催产时间处于鲟鱼的最佳繁殖季节[29]，水温适宜，且DO充足，理论上其繁殖效率应该偏高。但结果显示杂交鲟的平均受精率为80.08%，平均孵化率为63.69%；且在温差不超过0.3 ℃、催产时间间隔1 d的情况下，2022年3月30日催产的第8批和2022年3月31日催产的第9批的受精率和孵化率相差较大。而肖鑫鑫等[27]在对杂交鲟进行人工繁殖的试验中，在水温 16.00~17.20 ℃的条件下，其平均受精率达到82.90%，平均孵化率达到70.44%，高于本试验平均值，并且所催产的五批杂交鲟中没有出现受精率和孵化率相差较大的情况。有研究指出，曾经产过卵的亲鱼，其性腺发育与未产过卵的亲鱼存在差异，若同时催产会导致受精率和孵化率较低[30]，因此本试验繁殖效率较低的原因可能在于部分亲鱼在筛选时已产过卵，但这需要进一步的研究验证。
3.2 杂交鲟与其他鲟类胚胎发育的异同
如表3所示，杂交鲟与母本西伯利亚鲟胚胎发育的过程基本相似，呈“偏母遗传”特性，这与施氏鲟♀×西伯利亚鲟♂[20]、达氏鳇♀×施氏鲟♂[27]、鲇Silurus asotus ♀×南方鲇S. meridionalis ♂[31] 等杂交种的胚胎发育与母本相似的研究结果一致。与西伯利亚鲟的不同之处表现在：杂交鲟的平均卵径较大[32]；出膜前期杂交鲟尾的末端到达延脑，而西伯利亚鲟尾的末端到达间脑靠后。整体来看杂交鲟比西伯利亚鲟发育更快，表现出杂种优势。
表 3 杂交鲟 (西伯利亚鲟♀×施氏鲟♂) 与其父母本、反交组合胚胎发育特征的比较Table 3. Comparison of embryonic developmental characteristics of hybrid sturgeon (A. baerii ♀×A. schrenckii ♂) with its parents and inbred combinations项目
Item本试验杂交鲟
A. baeri ♀×A. schrenckii ♂西伯利亚鲟[11]
A. baeri施氏鲟[13]
A. schrenckii反交组合[20]
A. schrenckii ♀×A. baeri ♂卵径
Egg diameter/mm3.0~3.3 2.9~3.2 3.2~3.8 3.4~4.5 原肠中期
Mid-gastrula stage动物极覆盖胚胎表面的2/3 动物极覆盖胚胎表面的2/3 动物极覆盖胚胎表面的3/4 动物极覆盖胚胎表面的2/3 心跳期
Stage of heart beating心脏呈“C”形，心脏有节律搏动时尾末端到达心脏 心脏呈“C”形，心脏有节律搏动时尾末端到达心脏 心脏呈“S”形，心脏有节律搏动时尾末端未到达心脏 心脏膨大呈“S”形，心脏有节律搏动时尾末端未到达心脏 出膜期
Hatching stage尾的末端达到延脑 尾的末端达到间脑 尾的末端达到或略过头部 尾的末端超过头部 初孵仔鱼规格
Size of first hatchlings/mm9.2~10.7 8.9~9.5 9.4~10.0 发育水温
Developmental water temperature/℃16.3~17.1 15.5~18.0 16.0~17.0 18.5 发育时间
Developmental time/h124~134 133~145 114~146 120~130 积温
Temperature accumulation/h·℃2 083~2 251 2 173~2 369 1 856~2 108 2 054~2 405 与父本施氏鲟相比：受精卵均为沉性，但发育到原肠中期时，杂交鲟胚胎的动物极覆盖表面2/3，而施氏鲟胚胎的动物极覆盖表面3/4；发育到心跳期时，杂交鲟心脏呈“C”形，施氏鲟心脏呈“S”形；心脏有节律搏动时杂交鲟尾末端到达心脏，而施氏鲟尾末端未到达心脏；相同条件下，施氏鲟胚胎发育所需的时间较短，总积温较低[13]；出膜前期，杂交鲟尾的末端到达延脑，而施氏鲟尾的末端仅达到或略过头部；刚孵出的杂交鲟比刚孵出的施氏鲟的个体稍大，这与郭长江[33]的研究结果一致：鲟科鱼类出膜前期，其胚胎尾部末端所到达的位置与出膜仔鱼的体长成正比。
与反交组合 (施氏鲟♀×西伯利亚鲟♂) 相比，杂交鲟卵径较小，其他不同之处与父本的不同一致[30]。
3.3 杂交鲟卵黄囊期仔鱼的混合营养期
鱼苗从具有开口摄食能力到完全依赖外源性营养的时期称为混合营养期[34]。在此阶段，仔鱼可以开口摄食，但卵黄囊并没有被完全吸收，主要完成口、眼、消化道、血液循环系统和鳍的初步发育，并且基本可以实现平游[35]。不同鱼类的混合营养期长短不同。研究表明，达氏鳇9日龄开口，第13天时卵黄囊完全消失，混合营养期持续4 d[33]；匙吻鲟卵黄囊期仔鱼在6日龄左右开口，10日龄左右卵黄完全消失，混合营养期持续4 d[34]；施杂鲟出膜第7天开口，第9天卵黄囊吸收完毕，混合营养期持续2 d[16]；黄条鰤 (Seriola aureovittata) 3日龄开口，10日龄卵黄和油球消耗完毕，混合营养期持续7 d[36]；黑龙江三角鲂 (Megalobrama terminalis) 出膜第4天开口，出膜第6天卵黄被完全吸收，混合营养期持续2 d[37]。本研究中杂交鲟在出膜第7天开口，第10天卵黄被完全吸收，混合营养期仅持续3 d，与施杂鲟的情况相似。有学者指出，当仔鱼的卵黄囊被吸收殆尽时，必须马上建立主动摄食能力以完成内源性营养向外源性营养的转换，来维持早期正常的新陈代谢和生长发育[38]。本研究中仔鱼混合营养期与具有开口摄食能力的时间基本一致，说明杂交鲟在消耗卵黄的同时也在建立摄食外源性营养的能力。研究表明仔鱼从开口摄食到饥饿不可逆点的时间越长，适应开口饵料的能力越强[39]。
4. 结论
综上所述，本试验杂交鲟的平均催产率为100%，受精率为 (80.08±8.57)%，孵化率为 (60.96±15.12)%。在水温16.30~17.10℃条件下，杂交鲟由受精卵到孵化出仔鱼需要124~134 h，发育总积温为2 083~2 251 h·℃。通过观察杂交鲟胚胎发育各阶段的特征变化，将杂交鲟胚胎发育过程分为7个阶段、34个时期；卵黄囊期仔鱼在出膜第7天开口，第10天卵黄被完全吸收，混合营养期持续3 d；将杂交鲟与其父母本以及反交组合的胚胎发育过程比较发现，杂交鲟的发育特征与母本西伯利亚鲟相似，具有“偏母遗传”特性。本研究系统记录并完善了杂交鲟胚胎发育及早期仔鱼生长各个阶段的变化特征，为其高质量育种提供了科学依据。
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图 1 不同pH (A)、温度 (B)、蛋白酶 (C) 和有机试剂 (D) 对抗菌物质的影响
方柱上不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)
Figure 1. Effects of different pH (A), temperature (B), protease (C) and organic reagent (D) on antimicrobial substances
Lowercase letters on the bar indicate significant difference among groups (P<0.05).
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图 3 脂肽提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果
Figure 3. Antibacterial effect of lipopeptides extract on A. hydrophila
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图 4 脂肽提取物的UPLC-Q-TOF-MS的MS谱图
Figure 4. MS spectra of antibacterial crude extracts by UPLC-Q-TOF-MS
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图 5 脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响
bl. 对照组，a、b、c、d分别于第0、第2、第4和第6 小时加入1倍MIC脂肽；e、f、g分别于第4、第6和第8小时加入3倍MIC脂肽
Figure 5. Effect of lipopeptide on A. hydrophila growth curve
bl. control; a, b, c, d. 1×MIC lipopeptide was added at 0th, 2nd, 4th, 6th hour, respectively; e, f, g. 3×MIC lipopeptide was added at 4th, 6th, 8th hour, respectively.
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图 6 嗜水气单胞菌的扫描电镜图
A. 对照组细胞；B、C、D分别为1 MIC的脂肽处理3 h
Figure 6. Scanning electron microscopic results of A. hydrophila
A. control; B, C and D were treated with 1 MIC lipopeptide for 3 h
表 1 引物序列设计
Table 1 Primer sequence design
基因
gene引物
primer序列 (5'−3')
sequence产物大小/bp
product sizemycB MYCB-F ATGTCGGTGTTTAAAAATCAAGTAACG 2 024 MYCB-R TTAGGACGCCAGCAGTTCTTCTATTGA fenB FENB-F CTATAGTTTGTTGACGGCTC 1 400 FENB-R CAGCACTGGTTCTTGTCGCA sfp SFP-F ATGAAGATTTACGGAATTTA 675 SFP-R TTATAAAAGCTCTTCGTACG ituA ITUA-F ATGTATACCAGTCAATTCC 1 150 ITUA-R GATCCGAAGCTGACAATAG 
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表 2 脂肽提取物的UPLC-Q-TOF-MS分析
Table 2 Analysis of lipopeptides extracts by UPLC-Q-TOF-MS
出峰时间/min
retention time质量测定值 (m/z)
measured mass离子结形式
parention脂肽类型
lipopeptide type7.55~8.55 1 029.6117 [M+H]+ C13 Iturin A 9.48~12.20 1 043.507 1、1 057.6278、
1 071.6470、1 085.543 2[M+H]+ C14-17 Iturin A或C14 -17 Mycosubtilin 12.29~13.48 1 435.694 8、1 449.706 9 [M+H]+ C14 -15 Fengycin A 15.19~16.48 1 463.719 1、1 477.731 9、
1 491.743 3[M+H]+ C16-18 Fengycin A或C14-16 Fengycin B 17.65 1 505.755 8 [M+H]+ C17 Fengycin B 24.48~25.53 1 008.592 13、1 022.606 52、
1036.584 52[M+H]+ C13-15 Surfactin A或C14-16 Surfactin B或C13-15 Surfactin C 26.38 1 050.633 91 [M+H]+ C16 Surfactin A或C16 SurfactinC
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