Identification of antibacterial substances from Bacillus amyloliquefaciens HE and analysis of antibacterial characteristics
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摘要:
为明确解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) HE发酵液中的活性成分及抗菌特性，根据解淀粉芽孢杆菌发酵液抑菌活性稳定性，用PCR检测脂肽合成相关的基因，再采用UPLC-Q-TOF-MS对活性物质进一步分析；用二倍稀释法测定脂肽对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，并从显微结构上来探讨其抗菌作用。稳定实验表明该菌株产生抑菌活性物质对高温、酸、碱和蛋白酶具有一定的耐受性；4对引物的扩增产物经过克隆、测序和BLAST分析，表明解淀粉芽孢杆菌HE基因组含有ituA、fenB、sfP、mycB的脂肽合成相关基因；液质联用分析发现脂肽粗提物中含有Surfactin、Iturin和Fengycin这3类脂肽类抗生素；抑菌圈法测定抗菌脂肽对嗜水气单胞菌的MIC和MBC均为137.97 μg·mL−1；显微特征表明脂肽可以导致嗜水气单胞菌细胞膜塌陷和孔洞。该研究结果可为解淀粉芽孢杆菌活性代谢产物结构鉴定和安全性评价提供参考。
Abstract:To investigate the antibacterial substances from Bacillus amyloliquefaciens HE and antibacterial characteristics, we synthetized the genes related to lipopeptides synthesis by PCR detection according to the stability of B. amyloliquefaciens fermentation broth, and further analyzed the active substances by UPLC-Q-TOF-MS. Then we applied the inhibition zone method to determine the minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC) of lipopeptide against Aeromonas hydrophila, whose antimicrobial activity was discussed from the microscopic structure. The antimicrobial active substances were stable against high temperature, acid, acid-base and protease. The PCR with four primer pairs were cloned and sequenced. The BLAST analysis shows that the ituA, fenB, sfP and mycB genes existed in the genome of B. amyloliquefaciens HE. Three kinds of lipopetides (Surfactin, Iturin and Fengycin) were identified in the antimicrobial extract by mass spectrum analysis. The MIC and MBC of antimicrobial lipopetides against A. hydrophila were both 137.97 μg·mL−1 by inhibition zone method. The microscopic characteristics indicate that lipopeptides can cause membrane collapse and holes in A. hydrophila cells. The results provide references for the structural identification and safety evaluation of active metabolites of B. amyloliquefaciens.
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茎柔鱼 (Dosidicus gigas) 是东太平洋重要经济头足类，在北半球加利福尼亚寒流和南半球秘鲁寒流海域资源丰富，主要作业渔场有加利福尼亚湾、厄瓜多尔、秘鲁和智利近岸及外海[1-7]。我国2006年最先开始在智利外海对茎柔鱼资源开展调查，平均日产量超过5 t[8]。年龄和生长是头足类渔业生物学的重点研究内容，而一直以来，耳石被认为是研究头足类年龄和生长的最有效的硬组织材料[9]。刘必林等[10]通过分析耳石生长纹, 研究了鸢乌贼的年龄和生长, 并初步划分其种群结构。Yatsu[11]利用耳石轮纹分析柔鱼年龄组成，进而利用捕捞日期推算孵化日期。近年来，研究人员不断尝试采用角质颚[12]、内壳[13]和眼睛晶体[14]等其他硬组织来代替耳石。角质颚逐渐成为研究头足类的首选材料，与耳石相比其更易提取，形态学参数测量更为便捷，生长纹更易观察[15]。尽管耳石是头足类年龄和生长研究最有效的硬组织材料，然而角质颚中的周期性生长纹为该方面研究提供了有力的补充，尤其在耳石无法获取的场合下，角质颚可用来代替耳石。此外，角质颚的主要成分是不可逆生长的蛋白质和几丁质，具有较好的信息保存性[16]。
角质颚为头足类口球内的一对几丁质硬组织，具有形态结构稳定、耐腐蚀等生物学特性，它包含了大量生物学和生态学信息，可揭示头足类的年龄与生长、种群结构、摄食习性、洄游路线、栖息环境以及在海洋生态系统中所处的生态位等重要信息[15]。角质颚被认为是用来鉴定头足类生长和年龄的另一可靠的硬组织，具有易获取、研磨方便、后期处理简单等优点，因此被看作是耳石的有力补充[17]。本文对智利外海角质颚微结构进行观察，通过喙部生长纹的计数鉴定角质颚日龄，并据此估算茎柔鱼的生长，以期为我国开展头足类相关研究奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料来源
2010年4—6月在东南太平洋智利外海75°03'W—79°21'W、24°50'N—29°25'N采集茎柔鱼样品148尾 (图1)，样本在实验室解冻后测定胴长 (Mantle length, ML)、体质量 (Body weight, BW)、性别、性腺成熟度以及角质颚喙部长 (Upper rostrum length, URL)，胴长、体质量、喙长分别精确至1 mm、1 g、0.1 mm。取出耳石和角质颚，用清水洗净，分别保存于75%乙醇中。
1.2 角质颚微结构观察与日龄鉴定
依据刘必林等[16]方法对角质颚上颚进行剪裁、包埋、切割、研磨、抛光，将制作好的角质颚切片在Olympus显微镜下以400×观察拍照，用Photoshop 7.0进行图像拼接处理。角质颚上颚喙部截面由背侧的头盖和腹侧的脊突两部分组成，周期性的生长带明显，每一条生长带由明、暗两条生长纹组成。沿头盖部腹缘与脊突部背缘相交的A点向喙部顶端C点计数生长纹数目 (图1)，并通过3次独立计数确定茎柔鱼角质颚生长纹数目。角质颚生长纹数目与耳石日龄进行配对样本t检验，两者无显著性差异 (P>0.05)，茎柔鱼角质颚生长纹与耳石日龄相当[18]，因此角质颚生长纹数具有日周期性，生长纹个数即为日龄。使用Digimizer图像处理软件测量研磨平面AB和BC的距离，由AB和BC长度之和除以生长纹数目计算生长纹的平均宽度。
1.3 建立生长方程
采用线性、幂函数、指数、对数、逻辑斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz等7个生长模型来拟合茎柔鱼体长的生长[19]，其中赤池信息准则 (Akaike information criterion , AIC) 值最小的为最适生长模型[20]。AIC计算公式为：
$${\rm{AIC }} = {\rm{2k}} + n\ln (\frac{{{\rm RSS}}}{n})$$ 式中k为模型的参数数量，n为样本数量，RSS为剩余平方和。
Δi与wi计算公式如下[21]：
$$ {\Delta _{{i}}} = {\rm{ AIC - AI}}{{\rm{C}}_{{i}}} $$ $$ {{{w}}_i} = \frac{{{{\exp }^{ - 0.5{\Delta _i}}}}}{{\displaystyle\sum\nolimits _{i = 1}^j{{\exp }^{ - 0.5{\Delta _i}}}}} $$ 式中AICi为拟合模型中AIC值最小的生长模型，即为最适生长模型。但AIC在小样本、样本相对自变量个数较小时会出现高估模型参数的情况[22]，因此通过不同拟合生长方程与最适生长模型之间的差值Δi和权重wi来辅助生长模型选择，Δi< 2，模型选择具有实际意义[21,23]。
1.4 生长率的计算
对雌雄个体进行方差分析，结果显示，雌雄个体胴长的绝对生长率和相对生长率均无显著差异 (P>0.05)。因此，所有样本按30天组间距计算胴长和体质量的瞬时生长率 (Instantaneous growth rate, IGR, %·d−1) 和绝对生长率 (Absolute daily growth rates, AGR, mm·d−1或g·d−1)，具体计算公式如下：
$${\rm{IGR = }}\frac{{\ln {{{{S}}_2}}- \ln{{S_1}}}}{{{{{t}}_2} - {{{t}}_1}}} \times 100$$ $${\rm{AGR}} = \frac{{{{{S}}_2} - {S{_1}}}}{{{t_2} - {t_1}}}$$ 式中S1、S2分别为开始 (t1) 和结束 (t2) 时胴长。
2. 结果
2.1 角质颚微结构
智利外海茎柔鱼角质颚上颚喙部截面由头盖和脊突两部分向前延伸组合而成，头盖部的腹缘与脊突部的背缘相交于A点，脊突腹缘与喙前缘相交于B点，头盖背缘与喙前缘相交于C点，头盖与脊突的相交线AB称作内轴 (图1)。周期性的生长纹明显，每一条生长纹由明、暗两条生长纹组成，头盖与脊突部的生长纹交汇于内轴成“<”形，生长纹后端逐渐平行于脊突背缘 (图1)。截面喙部顶端生长纹最窄 (图2-a)，然后向内轴前连接点处逐渐变宽 (图2-b)，至内轴中部达到最宽 (图2-c)，然后再向内轴后连接点处慢慢变窄 (图2-d)。此外，一些样本的截面可见明显的标记轮 (图2-e，图2-f) 和异常结构 (图2-g，图2-h)。样本角质颚上颚生长纹宽度为9.9~18.3 μm，平均宽度(12.4±1.8) μm。
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图 2 茎柔鱼角质颚上颚喙部微结构图a、b、c和d分别显示截面喙部顶端、内轴前连接点、内轴中部和内轴后连接点处生长纹；e和f箭头所指为标记轮；g和h椭圆所包含的是异常结构Figure 2. Microstructure of rostrum sagittal section of upper beaka, b, c and d show the difference in the width of increments at tip, anterior joint, midal and posterior joint of inneral rostral axix; e and f show stress checks as indicated by arrows; g and h show abberant structures as indicated by ellipses2.2 年龄组成与孵化日期
智利外海茎柔鱼年龄最小的样本为219 d，其胴长355 mm、体质量1 450 g；年龄最大的为412 d，其胴长529 mm，体质量4 612 g。雌性日龄介于219~432 d，优势日龄组为301~360 d，占总体的67.4%；雄性日龄介于222~405 d，优势日龄组为301~360 d，占总体的68.2% (图3)。样本孵化日期为2009年3—11月，主要为6—7月 (图4)。
2.3 生长模型与生长率
对胴长和角质颚日龄数据采用线性、幂函数、指数、对数、逻辑斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz拟合，根据赤池信息准则 (表1)，茎柔鱼胴长呈显著的幂函数生长 (图5)，其关系式为ML=28.87Age0.472 3。雌性茎柔鱼胴长的平均IGR和AGR分别为0.14 % ·d−1和0.60 mm·d−1；雄性茎柔鱼胴长的平均IGR和AGR分别为0.11 %·d−1和0.47 mm·d−1 (表2)。
表 1 线性、幂函数、指数、对数、逻辑斯蒂、von Bertalanffy和Gompertz 7个生长方程进行茎柔鱼胴长-日龄拟合度检验Table 1. Parameters of linear, power, exponential, logarithmic, logistic, von Bertalanffy and Gompertz models fitted to ML-age for D. gigas模型
EquationR2 AIC Δi wi 线性 Linear 0.555 8 840.12 0.51 0.19 幂函数 Power 0.557 4 839.61 0 0.24 指数 Exponential 0.552 8 841.05 1.44 0.12 对数 Logarithmic 0.556 9 839.77 0.16 0.22 逻辑斯蒂 Logistic 0.556 2 841.99 2.38 0.07 von Bertalanffy 0.556 1 842.01 2.4 0.07 Gomoertz 0.556 5 841.88 2.27 0.08 注：粗体表示最适模型 Note: The optimum model is in bold. ![]()
图 5 茎柔鱼胴长与角质颚日龄关系Figure 5. Relationship between mantle length and beak determined age of D. gigas表 2 智利外海茎柔鱼胴长瞬时生长率和绝对生长率Table 2. Mantle length IGR and AGR of D. gigas in open sea of Chile日龄等级
Age level雌性 Female 雄性 Male 样本数
Number of samples胴长
Mantle length/mm瞬时生长率
IGR/%·d−1绝对生长率
AGR/mm·d−1样本数
Number of samples胴长
Mantle length/mm瞬时生长率
IGR/%·d−1绝对生长率
AGR/mm·d−1211~240 1 355 − − 1 353 − − 241~270 7 397 − − 2 409 − − 271~300 13 418 0.17 0.71 8 428 − − 301~330 40 437 0.15 0.64 10 442 0.11 0.47 331~360 22 452 0.11 0.50 20 456 0.11 0.48 361~390 6 469 0.12 0.55 1 475 − − 391~420 2 500 − − 2 483 − − 421~450 1 529 − − − − − − 3. 讨论
Clarke[24-25]首次报道了头足类角质颚中的生长纹结构，而后又对强壮桑椹乌贼 (Moroteuthisingens) 角质颚生长纹进行了专门地研究，Perales-Raya和Hernández-González[26]详细报道了真蛸 (Octopus vulgaris)角质颚喙内部的生长纹结构，Liu等[17]首次报道了头足类角质颚喙内部的生长纹结构。本研究观察发现，智利外海茎柔鱼角质喙部具有周期性的生长纹，每条生长带由明、暗两条生长纹组成，头盖与脊突部的生长纹交汇于内轴成“<”形，这与秘鲁外海茎柔鱼角质颚喙部的生长纹结构一致[27]。研究还发现，智利外海茎柔鱼角质颚喙部顶端生长纹最窄，中部最宽，这与柔鱼[18]、真蛸的研究结果一致[28]。此外，在一些茎柔鱼角质颚样本的中发现了明显的标记纹，以往的研究认为它们的形成与头足类特殊的生活史事件 (如孵化、交配、产卵) 以及突发事件 (温度波动、捕食者攻击) 等密切相关[29-30]。
研究认为鱿鱼类角质颚生长纹与耳石日龄无明显差异[17]，因此具有日周期性，即“一日一纹”。依据角质颚生长纹，目前已有我国南海北部的中国枪乌贼[31]、西北太平洋的柔鱼[32]和秘鲁外海的茎柔鱼[27]的年龄得到了鉴定。本研究显示智利外海茎柔鱼的角质日龄介于210~412 d，其寿命约为1年，这与耳石日龄结果基本相符，有研究表明智利和秘鲁茎柔鱼寿命大多介于1~1.5年，只有很少的大型鱿鱼能活到1.5~2年[7,33]。而在已有的研究中，存在茎柔鱼胴长约 1.2 m个体样本[34]，但本研究的样本基本处于未成熟阶段，在此生长阶段并未出现这么大的个体样本，年龄获取结果覆盖不全面。Perales-Raya[28]等通过对角质颚喙部的生长纹分析，认为中东大西洋毛里塔尼亚海的真蛸寿命也为1年左右。根据角质颚生长纹推算孵化日期为2009年3—11月，主要为6—7月，符合茎柔鱼全年产卵的习性[35]。然而不同地理区域温度、盐度等环境因子不同其产卵高峰期可能不同，例如已有研究表明，秘鲁外海产卵高峰期为1—3月[5]，哥斯达黎加外海产卵高峰期为1—2月[36]，厄瓜多尔外海产卵高峰期为10—11月[3]。
一般情况下，对于不同种群、地理区域以及不同发育阶段的茎柔鱼其生长情况不同 [37]。Cuccu等[38]在2013年通过利用角质颚上颚侧壁中的生长纹估算出了地中海撒丁岛海域野生真蛸的年龄结构。Hernández-López 等[39]利用实验室饲养法测量了大加那利岛真蛸上角质颚侧壁生长纹，估算出真蛸年龄介于2~13个月，真蛸幼体的腹胴长、体质量与日龄均呈指数关系，而成体腹胴长、体质量与日龄均呈对数关系。本研究发现智利外海茎柔鱼胴长呈显著的幂函数生长，这与之前根据耳石的研究结果也不完全相同[30]，该研究报道称，智利外海茎柔鱼春、秋生群胴长与日龄分别呈线性和幂函数关系。一般情况下，对于不同种群、地理区域以及不同发育阶段，茎柔鱼的生长情况不同[40]，在本研究中样本并没有包括所有生活史阶段，因此生长方程仅适用于本样本所包含的日龄范围。一般认为，头足类仔稚鱼阶段的生长速率大于成体阶段，雌性的生长速率要快于雄性。本研究发现，智利外海雌性茎柔鱼胴长的生长率大于雄性 (雌性IGR和AGR分别为0.14 % ·d−1和0.60 mm·d−1，雄性IGR和AGR分别为0.11 %·d−1和0.47 mm·d−1)，同时该生长率也明显小于仔稚鱼阶段[41]。
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图 1 不同pH (A)、温度 (B)、蛋白酶 (C) 和有机试剂 (D) 对抗菌物质的影响
方柱上不同小写字母表示组间差异显著 (P<0.05)
Figure 1. Effects of different pH (A), temperature (B), protease (C) and organic reagent (D) on antimicrobial substances
Lowercase letters on the bar indicate significant difference among groups (P<0.05).
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图 3 脂肽提取物对嗜水气单胞菌的抑菌效果
Figure 3. Antibacterial effect of lipopeptides extract on A. hydrophila
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图 4 脂肽提取物的UPLC-Q-TOF-MS的MS谱图
Figure 4. MS spectra of antibacterial crude extracts by UPLC-Q-TOF-MS
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图 5 脂肽对嗜水气单胞菌生长曲线的影响
bl. 对照组，a、b、c、d分别于第0、第2、第4和第6 小时加入1倍MIC脂肽；e、f、g分别于第4、第6和第8小时加入3倍MIC脂肽
Figure 5. Effect of lipopeptide on A. hydrophila growth curve
bl. control; a, b, c, d. 1×MIC lipopeptide was added at 0th, 2nd, 4th, 6th hour, respectively; e, f, g. 3×MIC lipopeptide was added at 4th, 6th, 8th hour, respectively.
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图 6 嗜水气单胞菌的扫描电镜图
A. 对照组细胞；B、C、D分别为1 MIC的脂肽处理3 h
Figure 6. Scanning electron microscopic results of A. hydrophila
A. control; B, C and D were treated with 1 MIC lipopeptide for 3 h
表 1 引物序列设计
Table 1 Primer sequence design
基因
gene引物
primer序列 (5'−3')
sequence产物大小/bp
product sizemycB MYCB-F ATGTCGGTGTTTAAAAATCAAGTAACG 2 024 MYCB-R TTAGGACGCCAGCAGTTCTTCTATTGA fenB FENB-F CTATAGTTTGTTGACGGCTC 1 400 FENB-R CAGCACTGGTTCTTGTCGCA sfp SFP-F ATGAAGATTTACGGAATTTA 675 SFP-R TTATAAAAGCTCTTCGTACG ituA ITUA-F ATGTATACCAGTCAATTCC 1 150 ITUA-R GATCCGAAGCTGACAATAG 
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表 2 脂肽提取物的UPLC-Q-TOF-MS分析
Table 2 Analysis of lipopeptides extracts by UPLC-Q-TOF-MS
出峰时间/min
retention time质量测定值 (m/z)
measured mass离子结形式
parention脂肽类型
lipopeptide type7.55~8.55 1 029.6117 [M+H]+ C13 Iturin A 9.48~12.20 1 043.507 1、1 057.6278、
1 071.6470、1 085.543 2[M+H]+ C14-17 Iturin A或C14 -17 Mycosubtilin 12.29~13.48 1 435.694 8、1 449.706 9 [M+H]+ C14 -15 Fengycin A 15.19~16.48 1 463.719 1、1 477.731 9、
1 491.743 3[M+H]+ C16-18 Fengycin A或C14-16 Fengycin B 17.65 1 505.755 8 [M+H]+ C17 Fengycin B 24.48~25.53 1 008.592 13、1 022.606 52、
1036.584 52[M+H]+ C13-15 Surfactin A或C14-16 Surfactin B或C13-15 Surfactin C 26.38 1 050.633 91 [M+H]+ C16 Surfactin A或C16 SurfactinC
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