Molecular characterization and expression pattern analysis of a defensin (HdDef1) from small abalone (Haliotis diversicolor)
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摘要:
防御素(defensin)是最重要的抗菌肽(AMPs)之一，参与先天免疫防御反应。该研究通过RNA-seq和RACE技术从杂色鲍(Halitotis diversicolor)中克隆到一种新的防御素基因(命名为HdDef1)。HdDef1 cDNA的开放阅读框(ORF)为201 bp，编码66个氨基酸，编码蛋白由18个氨基酸的信号肽和48个氨基酸的成熟肽组成。HdDef1的成熟肽具有AMPs的特征，如分子量较低、净正电荷(+1)、高疏水残基率(45%)。同时，成熟肽的6个半胱氨酸以C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C模式排列，并通过3个二硫键(C1-C4、C2-C5和C3-C6)稳定α-螺旋/β-折叠基序(CSαβ)。此外，通过与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)防御素在三维结构上的相似性及其系统进化关系比对表明，HdDef1是节肢动物防御素家族的新成员。荧光定量PCR显示，HdDef1转录本在肠、头、鳃、肝胰腺、外套膜和足中均有表达，其中肝胰腺具有最高的表达水平。哈维弧菌(Vibrio harveyi)感染后，肝胰腺中HdDef1 mRNA被显著诱导表达。结果表明，HdDef1可能在杂色鲍抵抗病原的免疫防御反应中发挥重要作用，但其在蛋白水平的抗菌活性还需要进一步研究。
Abstract:Defensin is one of the most important antimicrobial peptides (AMPs) that participate in invertebrate innate immunity against invading pathogens. In the present study, a novel defensin was identified in small abalone (Haliotis diversicolor) that was denoted as HdDef1 by using RNA-seq and RACE techniques. The HdDef1 cDNA contained a 201 bp open reading frame (ORF) encoding 66 amino acids including a signal peptide of 18 amino acids and a mature peptide of 48 amino acids. The mature peptide of HdDef1 shared common features of AMPs, such as lower molecular mass, net positive charge (+1) and high hydrophobic residue ratio (45%). In addition, six cysteines in the mature peptide were arranged in the pattern of C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C and stabilized the α-helix/β-sheet motif (CSαβ) with three disulfide bonds (C1-C4, C2-C5 and C3-C6) in the predicted tertiary structure. Moreover, by comparision with the similar three-dimensional structure of Anopheles gambiae defensin and phylogenetic analysis, it is suggested that HdDef1 might be a new member of the arthropod defensin family. Quantitative real-time PCR analysis reveals that HdDef1 transcripts were expressed constitutively in intestine, head, gill, hepatopancreas, mantle and foot, with the highest level in hepatopancreas. After being challenged with Vibrio harveyi, HdDef1 transcripts were induced significantly in hepatopancreas. The results indicate that HdDef1 might have an important function in host defense against invasive pathogenic bacteria, but its antimicrobial activity at protein level needs further study.
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Keywords:
- Haliotis diversicolor /
- HdDef1 /
- gene cloning /
- tissue distribution /
- immune challenge
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浮游动物在河口生态系统结构和生源要素循环中起重要作用，其动态变化影响许多鱼类和无脊椎动物的种群生物量[1-3]，它们通过捕食作用还控制浮游植物生物量[4-6]。浮游动物的种类组成、数量的时空变化对河口生态系统结构、功能运转、渔业资源和环境都产生重要影响[7]。因此，浮游动物的种类组成和群落结构等调查数据对了解河口生态系统的结构和功能有重要作用。
珠江有8个入海口，位于东经113°33′至114°09′，北纬22°12′至22°45′之间，水域面积达2 210 km2，水文环境复杂，终年受沿岸冲淡水和南海表层咸水的交替影响，是受人类活动干扰严重的水域。近年来，随着珠江三角洲地区经济的飞速发展，珠江口水域的水文、水质及生态研究成为热点领域，但对河口咸淡水交汇锋面处的浮游动物状况研究鲜有报导。文章研究了珠江口8大入海口咸淡水交汇处浮游动物的种类组成和数量的空间分布，试图了解受咸淡水交替影响的浮游动物种群结构与分布特征。为深入研究珠江口的生产力水平、生态系统结构和环境质量状况提供基础资料，以期为珠江口生物资源的合理开发和河口环境的治理及保护提供参考。
1. 材料和方法
1.1 采样站位的布设
研究站位布设如图 1所示。S1~S8站位分别位于虎门，蕉门，洪沥门，横门，磨刀门，鸡啼门，虎跳门和崖门。
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图 1 珠江口调查站位分布S1.虎门；S2.蕉门；S3.洪沥门；S4.横门；S5.磨刀门；S6.鸡啼门；S7. 虎跳门；S8. 崖门Fig. 1 Distribution of sampling stations in Pearl River EstuaryS1. Humen; S2. Jiaomen; S3. Honglimen; S4. Hengmen; S5. Modaomen; S6. Jitimen; S7. Hutiaomen; S8. Yamen1.2 采样与分析
采样时间为2006年8月24日至30日。浮游动物采集参照参考文献[8]，大型甲壳类浮游动物定性样品用13号浮游生物网，由底至表垂直拖曳得到，小型及微型浮游动物定性采用浮游植物定性定量样品；定量样品采用HQM-1型有机玻璃采水器，取表层(离水面0.5 m)和底层(离水底0.5 m)水样各1 L混合后用25号浮游生物网过滤，并用5%的甲醛溶液固定，带回实验室镜检。
种类鉴定依据《甲壳动物学》等相关资料[9-15]。其中桡足类、枝角类、轮虫类和原生动物鉴定到种，其它浮游动物如异足类、糠虾类、多毛类、被囊类、水母类等鉴定到类。
新鲜样品带回实验室后，立即用已知重量的玻璃纤维膜过滤，再用6.5%的等渗甲酸铵溶液漂洗，并用滤纸将标本吸到没有水痕的程度，迅速在电子天平上先称其湿重；然后将它们放入烘箱(约60℃)中烘干24 h，放入干燥器中自然冷却至室温，最后在电子天平上称其干重(此文生物量数据均采用干重)。
1.3 数据处理
浮游动物的多样性指数、均匀度指数和优势度采用以下计算公式：
Shannon-Weaver多样性指数(H)
$$ H=-\sum\limits_{i=1}^S\left(n_i / N\right) \log _2\left(n_i / N\right) $$ 式中，S为种数；ni为i种的个体数；N为总个体数。
$$ \text { 均匀度指数 }(J) \quad J=H / \log _2 S $$ 式中，H为Shannon-Weaver多样性指数；S为种数。
$$ \text { 优势度 }(Y) \quad Y=\left(n_{\mathrm{i}} / N\right) \times f_{\mathrm{i}} $$ 式中，ni为第i种的丰度，N为浮游动物总丰度，fi是该种在各站位中出现的频率。
2. 结果
2.1 浮游动物的种类组成
调查期间共鉴定浮游动物57种，桡足类最多，为20种，其次为轮虫类和枝角类，分别为18和8种，此外，被囊类2种，原生动物、多毛类、异足类、水母类、糠虾类各1种，桡足类幼虫和长尾类幼虫以及未知种类2种。
其中枝角类的长额象鼻溞(Bosmina longirostris)，轮虫类的萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus)和镰状臂尾轮虫(B.falcatus)为8个站位均出现的种类。
2.2 浮游动物及主要类别种类丰富度的平面分布
浮游动物种类最高值出现在S1站位，为29种。最低值出现在S5站位，只有19种(图 2)。
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图 2 调查期间各站位浮游动物的种类丰富度Fig. 2 Distribution of zooplankton taxa abundance at each station各站位桡足类的种数总和为20种。种类最高值出现在S8站位，为12种。最低值出现在S4站位，只有6种(图 2)。
各站位枝角类的种数总和为8种。种类最高值出现在S1站位，为6种。最低值出现在S8站位，只有1种(图 2)。
各站位轮虫类的种数总和为18种。种类最高值出现在S1站位，为10种。最低值出现在S5和S8站位，都只有5种(图 2)。
2.3 浮游动物总种类及桡足类、轮虫类、枝角类密度的空间分布
调查期间浮游动物8个站位密度的均值为12 086 ind · m-3，最高值出现在S1站位，为28 013 ind · m-3，最低值出现在S3站位，为2 288 ind · m-3(图 3)。
桡足类8个站位密度的均值为5 431 ind · m-3，最高值出现在S5站位，为13 342 ind · m-3，最低值出现在S3站位，为292 ind · m-3(图 3)。
枝角类8个站位密度的均值为708 ind · m-3，最高值出现在S1站位，为2 128 ind · m-3，最低值出现在S3站位，为146 ind · m-3(图 3)。
轮虫类8个站位密度的均值为3 144 ind · m-3，最高值出现在S1站位，为12 322 ind · m-3，最低值出现在S5站位，为292 ind · m-3(图 3)。
2.4 浮游动物生物量的空间分布
调查期间浮游动物8个站位生物量均值为61.78 mg · m-3。最高值出现在S5站位，实值为132.95 mg · m-3，最低值出现在S3站位，实值为10.03 mg · m-3(图 4)。
2.5 浮游动物群落优势种
根据各调查站位浮游动物种类出现的频率和相对丰度，得出主要种的优势度(表 1)。
表 1 珠江口浮游动物优势种Table 1 Dominant species of zooplankton in Pearl River Estuary优势种 dominant species 优势度 dominance 中华异水蚤 Acartiella sinensis 0.224 披针纺锤水蚤 Acartia southwelli 0.019 矮小拟镖剑水蚤 Paracyclopina nana 0.017 广布中剑水蚤 Mesocyclops leuckarti 0.017 右突新镖水蚤 Neodiapt omus schmackeri 0.012 球状许水蚤 Schmackeria forbesi 0.006 中华窄腹剑水蚤 Limnoithona sinensis 0.003 火腿许水蚤 Schmackeria poplesia 0.001 指状许水蚤 S.inopinus 0.001 萼花臂尾轮虫 Brachionus calyciflorus 0.156 镰状臂尾轮虫 B.falcatus 0.064 前节晶囊轮虫 Asplanchna priodonta 0.033 剪形臂尾轮虫 B.forficula 0.015 长额象鼻溞Bosmina longirostris 0.040 按照Y≥0.02来确定优势种。由上表可见，桡足类的中华异水蚤，枝角类的长额象鼻溞以及轮虫类的萼花臂尾轮虫、前节晶囊轮虫和镰状臂尾轮虫为主要优势种。这与其他一些河口有些差别[16]，主要原因在于此次采样点的布设比较靠近口内，盐度较低。
2.6 多样性指数和均匀度
Shannon-Wiener多样性指数(H)和均匀度是一种反映生物群落种类组成和结构特点的数值指标。珠江口8个站位浮游动物多样性指数和均匀度的变化见表 2。
表 2 珠江口浮游动物的多样性指数和均匀度Table 2 Diversity index and evenness of zooplankton in Pearl River EstuaryS1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 种数taxa number 28 24 20 19 16 20 18 17 多样性指数diversity index 3.2280 3.5303 3.1482 3.1733 2.1251 3.0142 2.6406 2.4797 均匀度evenness 0.6715 0.7699 0.7284 0.7470 0.5312 0.6974 0.6332 0.6066 S1、S2、S3和S4站位的多样性指数和均匀度较高，而S5、S6、S7和S8站位的多样性指数和均匀度相对较低，反映了前4个站位的浮游动物群落组成比后4个站位要复杂些，浮游动物种数普遍多于后4个站位，这主要是由于后4个站位的浮游动物优势种相当显著，种间数量分布不均匀所造成的。
3. 讨论
3.1 珠江口浮游动物的平面分布特点
珠江口浮游动物的种类丰富度的平面分布呈现由S1到S8递减的趋势，而浮游动物生物量的空间分布呈现从S1到S8递增的趋势，这主要是由于8个站位浮游动物群落结构之间的差异。S1和S2站位种类丰富度和种群密度都很高，是由于这2个站位轮虫类和枝角类种类比较丰富，桡足类不占优势，主要由小型浮游动物组成的浮游动物群落导致其生物量较低。S3和S4站位浮游动物的种类数和其它站位相当，但种群密度很低，所以其生物量最低。分析原因可能由于S3和S4站位的上游有较多大的炼油厂，水质污染较重所致。S6和S7站位浮游动物生物量都较前4个站位要高，因为在这2个站位中大型浮游动物桡足类在浮游动物群落中的比重有所提升，而且种群密度也较高。S5和S8站位浮游动物的种群密度虽然不是最高，但生物量却是8个站位中最高的，因为在这2个站位中桡足类占绝对优势，特别是大型浮游动物中华异水蚤为绝对优势种，所以生物量最高。
3.2 浮游动物的群落结构特征
与以往的调查结果相比[17-19]，此次珠江口浮游动物种类组成和群落结构变化不大，浮游甲壳动物占优势，且桡足类种类和数量最多，在8月的丰水期，浮游幼虫也比较丰富，但中小型浮游动物的比例有所升高。在所调查的8个站位都出现的种类有长额象鼻溞、萼花臂尾轮虫和镰状臂尾轮虫。
由于潮流携带河口半咸水种类进入口门内与淡水种类混杂，珠江口浮游动物群落明显可分为河口类群、近岸类群、和近外海类群。由于采样点设置及丰水期的原因，8个站位浮游动物主要以河口类群占优势，近岸类群和近外海类群都较少。在所鉴定出的20种桡足类中，有不少种类为咸淡水皆能生存的种类，大体分为3类：(1)中华异水蚤、短角异剑水蚤(Apocyclops royi)、矮小拟镖剑水蚤等种类在咸淡水中都能生存；(2)锥肢蒙镖水蚤(Mongolodiaptomus birulai)、长日华哲水蚤(Sinocalanus solstitialis)、球状许水蚤等种类在淡水、咸淡水及低盐度海水都能生存，但以淡水为主；(3)披针纺锤水蚤、海洋伪镖水蚤(Pseudodiaptomus marinus)以及火腿许水蚤在咸淡水中也能生存，但以海水为主。
虽然以往有很多关于珠江口浮游动物的生态调查，但这些调查站位都比较偏向于珠江口的外海海域(伶仃洋及其以南海域)，且未曾有过珠江8大入海口浮游动物的系统调查，所以该研究对于了解珠江口近岸的水域生态情况具有一定意义。为了能更好地预测河口浮游动物的分布情况和变动规律，在以后的研究中还应该增加采样点的数目和采样频度，为珠江口水域的生态管理提供依据。
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图 1 HdDef1基因的核苷酸序列和氨基酸序列
起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)以红色显示，预测的信号肽使用阴影覆盖，经典的多聚腺苷酸化加尾信号用下划线标示，半胱氨酸残基使用方框标记
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of HdDef1
Translation start (ATG) and stop (TGA) codons are highlighted in red. The predicted signal peptide is shaded. The classical polyadenylation signal is underlined. Cysteine residues are boxed.
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图 2 杂色鲍HdDef1与其他软体动物和节肢动物防御素成熟肽的多序列比对
黑色阴影显示相同的氨基酸，灰色阴影显示相似的氨基酸，二硫键桥以黑色连线显示
Figure 2. Multiple alignment of mature HdDef1 sequence and other defensins found in mollusks and arthropod
The black shadow shows identical amino acids and the gray indicates similar amino acids. The disulfide linkages are shown with black lines.
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图 3 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素结构
A. 冈比亚按蚊防御素的3D结构(PDB登录号：2ny9)；B. 杂色鲍HdDef1的3D结构；C. 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素的二级结构；6个半胱氨酸残基的相对位置及3个二硫键(半胱氨酸之间的蓝线)用蓝色标记；相似的结构单元用灰色阴影标记
Figure 3. Structures of HdDef1 and A. gambiae defensin
A. 3D structure of A. gambiae defensin (PDB accession: 2ny9); B. 3D structure of HdDef1; C. secondary structures of A. gambiae defensin and HdDef1; the relative positions of six cysteine residues and three disulfide bonds (blue lines between cysteines) are labelled in blue and the similar elements of structure are shaded in gray.
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图 4 利用MEGA 5.05基于邻接法构建的HdDef1系统进化树
Figure 4. Neighbor-joining phylogenetic tree of HdDef1 by MEGA 5.05
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图 5 杂色鲍HdDef1的组织表达模式
数据显示为平均值±标准误，小写字母不同表示各组之间具有显著差异(P<0.05)
Figure 5. Expression level of HdDef1 mRNA in different tissues
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 6 哈维弧菌感染后肝胰腺中HdDef1的时序表达模式
数据显示为平均值±标准误；*. 与0小时对照组差异显著(P<0.05)
Figure 6. Temporal expression profile of HdDef1 mRNA in hepatopancreas post V. harveyi challenge
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $; *. significant difference with control group at 0th hour (P<0.05)
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence序列信息
sequence informationP1 CATCACCTGCGATCTGCTCTCCTTTA 5' RACE primer out (HdDef1) P2 TTCTGCCTGTGCTGCTAAATGCCTTG 5' RACE primer in (HdDef1) P3 ACAGACACAGACGCCACCATGACAG 3' RACE primer out (HdDef1) P4 GCCATACCGACGATGACAACAACCAAAC 3' RACE primer in (HdDef1) Def-F TGGTTGTTGTCATCGTCGGTAT qRT-PCR primer for HdDef1 Def-R AGTAACAAGGCATTTAGCAGCAC qRT-PCR primer for HdDef1 18S-F ACGCATCTATCAAGTGTCTGCCCTA qRT-PCR primer for 18S 18S-R CTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAG qRT-PCR primer for 18S 
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