Molecular characterization and expression pattern analysis of a defensin (HdDef1) from small abalone (Haliotis diversicolor)
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摘要:
防御素(defensin)是最重要的抗菌肽(AMPs)之一，参与先天免疫防御反应。该研究通过RNA-seq和RACE技术从杂色鲍(Halitotis diversicolor)中克隆到一种新的防御素基因(命名为HdDef1)。HdDef1 cDNA的开放阅读框(ORF)为201 bp，编码66个氨基酸，编码蛋白由18个氨基酸的信号肽和48个氨基酸的成熟肽组成。HdDef1的成熟肽具有AMPs的特征，如分子量较低、净正电荷(+1)、高疏水残基率(45%)。同时，成熟肽的6个半胱氨酸以C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C模式排列，并通过3个二硫键(C1-C4、C2-C5和C3-C6)稳定α-螺旋/β-折叠基序(CSαβ)。此外，通过与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)防御素在三维结构上的相似性及其系统进化关系比对表明，HdDef1是节肢动物防御素家族的新成员。荧光定量PCR显示，HdDef1转录本在肠、头、鳃、肝胰腺、外套膜和足中均有表达，其中肝胰腺具有最高的表达水平。哈维弧菌(Vibrio harveyi)感染后，肝胰腺中HdDef1 mRNA被显著诱导表达。结果表明，HdDef1可能在杂色鲍抵抗病原的免疫防御反应中发挥重要作用，但其在蛋白水平的抗菌活性还需要进一步研究。
Abstract:Defensin is one of the most important antimicrobial peptides (AMPs) that participate in invertebrate innate immunity against invading pathogens. In the present study, a novel defensin was identified in small abalone (Haliotis diversicolor) that was denoted as HdDef1 by using RNA-seq and RACE techniques. The HdDef1 cDNA contained a 201 bp open reading frame (ORF) encoding 66 amino acids including a signal peptide of 18 amino acids and a mature peptide of 48 amino acids. The mature peptide of HdDef1 shared common features of AMPs, such as lower molecular mass, net positive charge (+1) and high hydrophobic residue ratio (45%). In addition, six cysteines in the mature peptide were arranged in the pattern of C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C and stabilized the α-helix/β-sheet motif (CSαβ) with three disulfide bonds (C1-C4, C2-C5 and C3-C6) in the predicted tertiary structure. Moreover, by comparision with the similar three-dimensional structure of Anopheles gambiae defensin and phylogenetic analysis, it is suggested that HdDef1 might be a new member of the arthropod defensin family. Quantitative real-time PCR analysis reveals that HdDef1 transcripts were expressed constitutively in intestine, head, gill, hepatopancreas, mantle and foot, with the highest level in hepatopancreas. After being challenged with Vibrio harveyi, HdDef1 transcripts were induced significantly in hepatopancreas. The results indicate that HdDef1 might have an important function in host defense against invasive pathogenic bacteria, but its antimicrobial activity at protein level needs further study.
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Keywords:
- Haliotis diversicolor /
- HdDef1 /
- gene cloning /
- tissue distribution /
- immune challenge
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黄鳍金枪鱼 (Thunnus albacares) 属硬骨鱼纲、辐鳍鱼亚纲、鲈形目、鲭亚目、鲭科、金枪鱼属，是名贵的海洋暖水性上层鱼类。因其背鳍和臀鳍呈黄色 (成年后尤为明显) 而得名，属于金枪鱼中产量最高的一种。黄鳍金枪鱼具有高度洄游的特性，广泛分布于世界三大洋的热带和温带水域，最大体长可达3 m，体质量可达225 kg。因营养价值丰富、味道鲜美可口而深受消费者喜爱[1]。目前，关于黄鳍金枪鱼的研究主要集中在营养成分、捕捞、鱼群分布、开发利用、保鲜运输等方面。澳大利亚、日本、墨西哥、巴拿马等国已开展黄鳍金枪鱼的网箱养殖作业并取得良好效果[2-9]。我国关于黄鳍金枪鱼养殖研究的公开报道较少。Ma等[10]研究了美济礁深水网箱养殖的黄鳍金枪鱼幼鱼驯化过程中摄食水深的变化；方伟等[11]开展了5月龄黄鳍金枪鱼幼鱼形态性状对体质量的相关性及通径分析。目前黄鳍金枪鱼养殖方式主要为网箱养殖，养殖所需幼鱼主要来自于野生苗种诱捕。我国黄鳍金枪鱼网箱及陆基循环水驯化养殖技术仍处于起步阶段[12]。
高价值经济鱼类新品种的开发需要详细的基础研究数据，体质量能反映同批鱼苗的生长状况，通常用作优质品种选育的常规手段[13-16]。鱼类为低等变温脊椎动物，特异性免疫力较低，主要依靠非特异性免疫对外来入侵病原生物、异物或机体产生的有害物质进行清除[17]，因此非特异性免疫对其生存具有重要意义[18]。而免疫相关酶的活性变化能够有效反映黄鳍金枪鱼幼鱼免疫能力的变化。鱼体肠道在营养物质的消化和吸收中发挥着重要作用，消化酶活性与鱼类消化系统的功能相适应[19]，在一定程度上反映了鱼体消化道的生理状态，鱼体内消化酶活性及其肠道的形态结构受到多种因素影响[20]。有研究表明，投喂策略、投喂饵料种类、发育阶段等均会影响鱼体内的消化酶活性[20-21]。因此测定不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼的各种消化酶活性对研究其食性偏好有重要意义。目前关于黄鳍金枪鱼幼鱼陆基循环水养殖的基础数据较少，尚未见不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼酶活指标差异的研究。本研究测定了不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼的基础数据，为其陆基养殖积累基础数据，有利于构建设施化金枪鱼养殖技术体系，为我国后续开展金枪鱼深远海养殖和陆基循环水养殖推广奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料来源
黄鳍金枪鱼幼鱼共60尾，由中国水产科学研究院深远海养殖技术与品种开发创新团队于2020年11月—2021年2月在海南陵水黎族自治县新村镇附近海域诱捕，并转运至基地后进行驯化养殖，驯养池规格为长8.6 m×宽5.6 m×高2.8 m。各项水质指标为：水温 (22.5±0.5) ℃，溶解氧质量浓度>8.50 mg·L−1，pH 7.93±0.12，盐度33，氨氮<0.1 mg·L−1，亚硝态氮质量浓度<0.1 mg·L−1，实验用鱼体质量410~2 580 g。驯化期间投喂新鲜杂鱼。
1.2 实验设计
经过1个月的驯养，野生黄鳍金枪鱼幼鱼能正常摄食人工投料视为驯化成功。驯化成功后，将其按照体质量分为4组 [500 g (250~750 g)、1 000 g (750~1 250 g)、1 500 g (1 250~2 000 g)、2 500 g (2 000~3 000 g)]，每组15尾，每组随机抽取5尾进行麻醉。黄鳍金枪鱼幼鱼使用丁香酚 (10~30 μg·L−1) 麻醉后，用一次性注射器 (注射器用抗凝剂肝素润洗) 从幼鱼尾部抽取血液样品 (每尾取血4 mL) 并按照比例加入抗凝剂 [(每mL血液肝素用量为(15±2.5) U]，于4 ℃保存并静置30 min，然后用台式高速冷冻离心机 (型号EXPERT 18K-R) 4 ℃、3 000 r·min−1离心10 min。提取上清液后测定血液样品酶活。采血完成后的黄鳍金枪鱼幼鱼解剖取肌肉、胃、前肠、肝脏等组织用于样品测定。测定酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶等数据，数据精确到小数点后两位。
1.3 样品处理
称量各实验组样品后，与0.2 mol·L−1生理盐水按指定比例进行研磨，研磨液2 ℃，研磨后4 ℃、15 000 r·min−1离心10 min，取上清，置于−80 ℃备测，各消化酶及免疫酶活性分别采用相关试剂盒进行测定 (南京建成生物工程研究所)。本实验中酶活性以每毫克可溶解蛋白酶活性值 (U·mg−1)、每克可溶解蛋白酶活性值 (U·g−1)、每升可溶解蛋白酶活性值 (U·L−1) 表示。
1.4 数据统计分析
采用Excel 2010软件整理数据并作图，利用SPSS 19.0软件进行显著性差异分析，P<0.05为差异显著。
2. 结果
2.1 不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼ACP活性差异
不同体质量的黄鳍金枪鱼幼鱼不同组织中的ACP活性存在一定差异，均表现为肠道>肌肉>肝脏>血清 (图1)。血清中的ACP活性在体质量500 g时达到最高 [(1 655.99±194.95) U·L−1]，而后随着体质量的增加逐渐降低，而当体质量达1 500 g时降至最低 [(763.67±38.14) U·L−1]，当体质量达2 500 g时又轻微回升 [(929.64±86.85) U·L−1]，且相邻两组之间差异显著 (P<0.05) 。仅在体质量为1000 g时，肠组织中ACP活性 [(420 382.21±37 313.08) U·L−1]，显著低于其余体质量组 (P<0.05) ，其余组间差异不显著 (P>0.05)。肌肉组织和肝脏中ACP活性在不同体质量组间差异不显著 (P>0.05)，未见规律性变化。
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图 1 黄鳍金枪鱼幼鱼不同组织中酸性磷酸酶活性差异Figure 1. Difference of ACP activity in various tissues of juvenile T. albacares2.2 不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼AKP活性差异
不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼各组织中AKP活性存在差异，均表现为肠道>肝脏>肌肉>血清 (图2)。血清中AKP活性在体质量为500、1 000、1 500 g 组中差异不显著，当体质量为2 500 g时血清中AKP活性骤降 [(29.97±3.56) U·g−1]，与其他体质量组之间差异显著 (P<0.05)。肠组织中AKP活性在体质量为1 000 g时有所下降 [(29.97±3.56) U·g−1]，与其他体质量组之间差异显著 (P<0.05)，其他各组间差异不显著 (P>0.05)。肌肉组织中AKP活性随着体质量的增加呈先下降后逐渐稳定的趋势，500 g体质量组中AKP活性 [(411.62±49.32) U·g−1] 显著高于1 000和2 500 g组 (P<0.05)，1 500 g体质量组与其他各组间差异不显著 (P<0.05)。肝脏中AKP活性随着体质量的增加呈先轻微下降后缓慢增加的趋势，当体质量为1 000 g时，活性最低[(74 883.05±991.00) U·g−1]，体质量为2 500 g时活性最高 [(116 359.06±1 295.10) U·g−1]，相邻两组间差异显著 (P<0.05)。
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图 2 黄鳍金枪鱼幼鱼不同组织中碱性磷酸酶活性差异Figure 2. Difference of AKP activity in various tissues of juvenile T. albacares2.3 不同体质量黄鳍金枪鱼幼鱼消化酶活性差异
随着体质量的增加，黄鳍金枪鱼幼鱼消化器官中各消化酶活性出现一定波动，但整体较稳定 (图3)。肠道中3种消化酶活性依次为胰蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶；胃中2种消化酶活性为淀粉酶>胃蛋白酶。黄鳍金枪鱼幼鱼各体质量之间肠道淀粉酶、肠道脂肪酶、胃淀粉酶、胃蛋白酶活性差异均不显著 (P>0.05)。肠道胰蛋白酶活性呈波动性变化，体质量为500 g时活性最高 [(3 230.51±628.91) U·mg−1]，显著高于体质量1 000和2 500 g 组 (P<0.05)，其他3组间差异不显著 (P>0.05)。
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图 3 黄鳍金枪鱼幼鱼不同器官中消化酶活性差异Figure 3. Difference of digestive enzyme activities in various tissues of juvenile T. albacares3. 讨论
3.1 不同体质量组之间黄鳍金枪鱼幼鱼4种组织中ACP和AKP活性差异
磷酸酶包括ACP和AKP 两种，是重要的磷代谢酶，具有促进含磷 (P) 物质消化吸收、代谢、转化、转运、再利用等的功能，同时是重要的免疫反应酶及重要的解毒酶类[22]。有研究表明，ACP和AKP是细胞磷酸化和去磷酸化可逆性调节机制的重要参与者，也是细胞增殖启动的重要参与者[23-24]，因此其活性高低可有效反映鱼类对P或含P物质的分解、吸收、再利用、转运等功能的有效性，反映对外来入侵物的分解能力，起到免疫的效果[25]。
3.1.1 ACP活性差异
ACP是溶酶体的标志酶之一，其反应颗粒分布之处表明溶酶体和其他水解酶的存在，细胞内消化过程在此处进行[18]。4个体质量组4种组织中ACP活性均表现为肠道>肌肉>肝脏>血清。研究结果与茴鱼 (Thymdlus grube) 相似 (肾脏>肌肉>肝脏)，且活性均高于茴鱼[18]。说明本实验中黄鳍金枪鱼幼鱼溶酶体和其他水解酶丰富，细胞内消化过程活跃，其中肠道、肌肉和肝脏代谢速率较高，对含P物质的分解、吸收和利用效率高，对外来入侵物质或入侵生物的清理能力强。外在表现为免疫力强、生长速度快和运动量大。其中肠道的ACP活性在所有质量组中均最高，表明本实验中肠道ACP更活跃，而其高活性代表对含P物质分解、消化和吸收能力更强。可能因为肠道是与食物直接接触的重要器官，需要更强的免疫力来分解细菌、病毒或有毒有害物质，保证自身的内环境稳态。而肌肉和肝脏中ACP活性较高可能是因为在本实验中黄鳍金枪鱼幼鱼处于快速生长阶段，需要大量的营养物质参与机体构建，因此通过提高ACP活性的方式提高细胞对含P物质的吸收利用能力。而血清中ACP活性最低，可能与血液的主要功能为转运有关。肠道、肌肉、肝脏3种组织中的ACP活性保持稳定，同时血清中ACP活性稳步地降低，表明无明显的外界刺激，黄鳍金枪鱼内环境稳定，养殖过程中生活环境及饵料供给较稳定，未发生突发性疾病印证了这一点。
3.1.2 AKP活性差异
AKP是一种重要的免疫反应酶，直接参与磷酸基团的转移，具有重要的调控功能，其活性在机体代谢中起着非常关键的作用，在临床医学中通常作为诊断外来病原入侵或环境毒素入侵等的重要指示[26-28]。在本研究中，AKP活性在所有体质量组中均表现为肠道>肝脏>肌肉>血清，这与长丝鲈 (Osphronemus goramy)、茴鱼及草鱼 (Ctenopharyngodon idella) 的研究结果类似，均为肝>肌肉[29-30]。且在本研究中，肠道及肝脏中AKP活性值远大于肌肉和血清 (相差3个数量级)，表明与外界食物直接接触的肠道和重要的免疫器官肝脏需要更高活性的AKP来提高免疫能力。同时肠道是含P物质重要的分解、吸收、转运起点，肝脏是磷酸基团重要的中间存储转化合成器官和免疫器官，对AKP活性均有较高的需求。随着体质量的增加，黄鳍金枪鱼幼鱼肠道和肝脏的AKP活性轻微上升，而血清和肌肉中的则逐渐下降。这可能是因为随着体质量的增加，黄鳍金枪鱼幼鱼器官组织发育程度逐渐完善，组织器官功能的定位及功能分化愈发清晰。同时，养殖条件下黄鳍金枪鱼幼鱼摄食难度低，运动量必然小于野生状态，这可能是导致肌肉AKP活性轻微下降的原因之一。在体质量为2 500 g时，血清中AKP活性骤降，且误差值较小，表明活性数值稳定，受突发性环境因素干扰的可能性较小，应与所处生长发育阶段有关，具体机理有待进一步研究。
AKP和ACP活性在肠道和肝脏中均较高，表明黄鳍金枪鱼对P具有较强的分解和合成能力，对氨基酸、核苷酸等大分子物质具有较好的分解和再利用能力；对外源物质和自身废弃物有较强的分解和再利用能力；对外界环境因子变化和病原体入侵具有较强的免疫能力和抗逆性。血清中AKP和ACP活性的降低可能与免疫器官逐步发育完善有关。
3.2 不同体质量组间黄鳍金枪鱼幼鱼3种消化酶活性差异
蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等是参与营养物质消化和吸收的主要酶类，是评估消化吸收能力及功能的重要指标[31]。淀粉酶可将淀粉催化分解成单糖以便吸收利用[32]；脂肪酶能够将食物中的脂肪分解为脂肪酸和甘油分子以便吸收利用[33]；蛋白酶可将食物中的蛋白质水解为可供机体吸收的氨基酸[34]。因此测定消化器官中各种消化酶的活性，有助于了解养殖鱼类对所摄食饵料的消化状态[35]。鱼类消化酶活性受多种因素影响，包括发育阶段、季节变化、饵料变化、投喂策略、环境变化等。有研究表明鱼类在不同的发育阶段，其口径有较大变化，导致其摄食饵料的种类也发生变化，为充分吸收利用足够的营养，各种消化酶活性随着摄入饵料种类的变化而改变，例如大弹涂鱼 (Boleophthalmus pectinirostris) 幼鱼、成鱼消化酶活性有显著差异[36]。本研究中，不同体质量的黄鳍金枪鱼幼鱼，口径和体型存在一定差异，测定消化酶活性可有效反映其不同体质量之间生理生化及所需营养的变化。本研究中，黄鳍金枪鱼幼鱼消化器官中各消化酶活性随体质量的增加出现一定波动，但整体较稳定。不同体质量之间肠道淀粉酶、肠道脂肪酶、胃淀粉酶、胃蛋白酶活性均无显著差异 (P>0.05)。肠道蛋白酶活性呈波动性变化，体质量为500 g时活性最高 [(3 230.51±628.91) U·mg−1]，显著高于体质量为1 000 g和2 500 g两组 (P<0.05)，其他体质量组之间差异不显著 (P>0.05)。有研究表明，脂肪酶活性在肉食性鱼类中较高，淀粉酶活性在草食性鱼类中较高[37]，如在青鱼 (Mylopharyngodon piceus) 肠道中发现类似的结果，即胰蛋白酶活性>脂肪酶活性>淀粉酶活性[38]。本研究结果与之不同，黄鳍金枪鱼幼鱼肠道中3种消化酶活性排序为胰蛋白酶>淀粉酶>脂肪酶。与青鱼相比，黄鳍金枪鱼的淀粉酶活性更高、胰蛋白酶活性相似、脂肪酶活性较低，表明黄鳍金枪鱼幼鱼对蛋白类营养物质和淀粉类营养物质有较好的吸收利用能力，而对脂肪的需求量相对较少；与大弹涂鱼对比发现，本研究中黄鳍金枪鱼胃蛋白酶、淀粉酶活性更高，而脂肪酶活性差异较小[36]，表明黄鳍金枪鱼对蛋白类和淀粉类食物有更好的消化吸收能力。有研究指出黄鳍金枪鱼肌肉脂肪含量较低[4]，对脂肪的消化吸收能力相对较差，可能是导致肌肉的脂肪含量较低的原因。而降低对脂肪类食物的消化吸收速率，保持较高的蛋白酶、淀粉酶消化吸收速率，有利于降低体脂率，保持更好的运动能力。
4. 结论
本研究表明，黄鳍金枪鱼幼鱼在陆基循环水养殖条件下不同体质量之间存在免疫酶和消化酶活性差异。AKP和ACP活性在肠道和肝脏中均较高，黄鳍金枪鱼在重要的外源物质接触器官和重要的免疫器官对P或含P类营养物质具有较强的分解、吸收和合成利用的能力，对外源入侵物具有较高的免疫能力。肌肉ACP活性高于AKP，表明肌肉对P的利用功能大于转运。ACP和AKP活性随着体质量的增加在黄鳍金枪鱼幼鱼不同组织中的表达量有所变化。黄鳍金枪鱼幼鱼消化酶活性整体稳定，随着体质量的变化小范围地增加或降低，差异较小。蛋白酶活性最高表明其摄食偏好肉类。黄鳍金枪鱼2种免疫相关酶活性及其相关指标随体质量增加的变化规律有所差异，这可能与免疫器官的逐步发育完善有关，具体机理有待进一步研究。黄鳍金枪鱼幼鱼对蛋白类营养物质和淀粉类营养物质有较好的吸收利用能力，而对脂肪的需求量相对较少，内在原因及机理有待进一步探索。
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图 1 HdDef1基因的核苷酸序列和氨基酸序列
起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)以红色显示，预测的信号肽使用阴影覆盖，经典的多聚腺苷酸化加尾信号用下划线标示，半胱氨酸残基使用方框标记
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of HdDef1
Translation start (ATG) and stop (TGA) codons are highlighted in red. The predicted signal peptide is shaded. The classical polyadenylation signal is underlined. Cysteine residues are boxed.
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图 2 杂色鲍HdDef1与其他软体动物和节肢动物防御素成熟肽的多序列比对
黑色阴影显示相同的氨基酸，灰色阴影显示相似的氨基酸，二硫键桥以黑色连线显示
Figure 2. Multiple alignment of mature HdDef1 sequence and other defensins found in mollusks and arthropod
The black shadow shows identical amino acids and the gray indicates similar amino acids. The disulfide linkages are shown with black lines.
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图 3 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素结构
A. 冈比亚按蚊防御素的3D结构(PDB登录号：2ny9)；B. 杂色鲍HdDef1的3D结构；C. 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素的二级结构；6个半胱氨酸残基的相对位置及3个二硫键(半胱氨酸之间的蓝线)用蓝色标记；相似的结构单元用灰色阴影标记
Figure 3. Structures of HdDef1 and A. gambiae defensin
A. 3D structure of A. gambiae defensin (PDB accession: 2ny9); B. 3D structure of HdDef1; C. secondary structures of A. gambiae defensin and HdDef1; the relative positions of six cysteine residues and three disulfide bonds (blue lines between cysteines) are labelled in blue and the similar elements of structure are shaded in gray.
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图 4 利用MEGA 5.05基于邻接法构建的HdDef1系统进化树
Figure 4. Neighbor-joining phylogenetic tree of HdDef1 by MEGA 5.05
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图 5 杂色鲍HdDef1的组织表达模式
数据显示为平均值±标准误，小写字母不同表示各组之间具有显著差异(P<0.05)
Figure 5. Expression level of HdDef1 mRNA in different tissues
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 6 哈维弧菌感染后肝胰腺中HdDef1的时序表达模式
数据显示为平均值±标准误；*. 与0小时对照组差异显著(P<0.05)
Figure 6. Temporal expression profile of HdDef1 mRNA in hepatopancreas post V. harveyi challenge
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $; *. significant difference with control group at 0th hour (P<0.05)
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence序列信息
sequence informationP1 CATCACCTGCGATCTGCTCTCCTTTA 5' RACE primer out (HdDef1) P2 TTCTGCCTGTGCTGCTAAATGCCTTG 5' RACE primer in (HdDef1) P3 ACAGACACAGACGCCACCATGACAG 3' RACE primer out (HdDef1) P4 GCCATACCGACGATGACAACAACCAAAC 3' RACE primer in (HdDef1) Def-F TGGTTGTTGTCATCGTCGGTAT qRT-PCR primer for HdDef1 Def-R AGTAACAAGGCATTTAGCAGCAC qRT-PCR primer for HdDef1 18S-F ACGCATCTATCAAGTGTCTGCCCTA qRT-PCR primer for 18S 18S-R CTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAG qRT-PCR primer for 18S 
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