Molecular characterization and expression pattern analysis of a defensin (HdDef1) from small abalone (Haliotis diversicolor)
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摘要:
防御素(defensin)是最重要的抗菌肽(AMPs)之一，参与先天免疫防御反应。该研究通过RNA-seq和RACE技术从杂色鲍(Halitotis diversicolor)中克隆到一种新的防御素基因(命名为HdDef1)。HdDef1 cDNA的开放阅读框(ORF)为201 bp，编码66个氨基酸，编码蛋白由18个氨基酸的信号肽和48个氨基酸的成熟肽组成。HdDef1的成熟肽具有AMPs的特征，如分子量较低、净正电荷(+1)、高疏水残基率(45%)。同时，成熟肽的6个半胱氨酸以C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C模式排列，并通过3个二硫键(C1-C4、C2-C5和C3-C6)稳定α-螺旋/β-折叠基序(CSαβ)。此外，通过与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)防御素在三维结构上的相似性及其系统进化关系比对表明，HdDef1是节肢动物防御素家族的新成员。荧光定量PCR显示，HdDef1转录本在肠、头、鳃、肝胰腺、外套膜和足中均有表达，其中肝胰腺具有最高的表达水平。哈维弧菌(Vibrio harveyi)感染后，肝胰腺中HdDef1 mRNA被显著诱导表达。结果表明，HdDef1可能在杂色鲍抵抗病原的免疫防御反应中发挥重要作用，但其在蛋白水平的抗菌活性还需要进一步研究。
Abstract:Defensin is one of the most important antimicrobial peptides (AMPs) that participate in invertebrate innate immunity against invading pathogens. In the present study, a novel defensin was identified in small abalone (Haliotis diversicolor) that was denoted as HdDef1 by using RNA-seq and RACE techniques. The HdDef1 cDNA contained a 201 bp open reading frame (ORF) encoding 66 amino acids including a signal peptide of 18 amino acids and a mature peptide of 48 amino acids. The mature peptide of HdDef1 shared common features of AMPs, such as lower molecular mass, net positive charge (+1) and high hydrophobic residue ratio (45%). In addition, six cysteines in the mature peptide were arranged in the pattern of C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C and stabilized the α-helix/β-sheet motif (CSαβ) with three disulfide bonds (C1-C4, C2-C5 and C3-C6) in the predicted tertiary structure. Moreover, by comparision with the similar three-dimensional structure of Anopheles gambiae defensin and phylogenetic analysis, it is suggested that HdDef1 might be a new member of the arthropod defensin family. Quantitative real-time PCR analysis reveals that HdDef1 transcripts were expressed constitutively in intestine, head, gill, hepatopancreas, mantle and foot, with the highest level in hepatopancreas. After being challenged with Vibrio harveyi, HdDef1 transcripts were induced significantly in hepatopancreas. The results indicate that HdDef1 might have an important function in host defense against invasive pathogenic bacteria, but its antimicrobial activity at protein level needs further study.
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Keywords:
- Haliotis diversicolor /
- HdDef1 /
- gene cloning /
- tissue distribution /
- immune challenge
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随着生活水平的不断提高，人们越来越追求健康饮食，尤其对食物中的脂肪酸组成越来越重视。鱼类营养丰富，富含多不饱和脂肪酸，特别是DHA和EPA。中国对淡水鱼的需求量不断增加，因此，研究淡水鱼在贮藏加工过程中品质(特别是脂肪酸组成)的变化具有重大意义。
鳙(Aristichthys nobilis)又名花鲢、胖头鱼，是中国四大家鱼之一，也是目前国内水产品市场中主要的商业化淡水鱼种之一，其2011年的年产量达到266.8×104 t[1]。目前，国内学者对鲤(Cyprinus carpio)、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳙等淡水鱼在贮藏过程中的品质变化进行了一些研究[2-4]，HONG等[5]报道了低浓度的盐和糖对鳙冷藏过程中品质变化的影响，指出低浓度的盐和糖不仅能够改善鱼片的食用口感，还能延缓品质变化、延长货架期，但是没有将脂肪酸作为品质变化的内容进行研究。脂肪酸的氧化对鱼的品质有重要的影响。国外学者对沙丁鱼(Sardinella gibbosa)、马鲛(Trachurus trachurus)、鲱(Clupea harengus)等海水鱼类在贮藏加工过程中脂肪的变化规律进行过一些报道[6-8]，发现随着贮藏时间的延长，鱼的品质下降速度加快，脂肪酸(尤其是不饱和脂肪酸)的氧化程度加剧。食盐腌制是水产品保藏中应用较为广泛的一种方式，但是腌制对淡水鱼贮藏中脂肪酸变化的影响以及对鱼整体品质的影响尚不清楚，为此笔者选择鳙作为试验用鱼，通过测定感官指标和pH、硫代巴比妥酸(TBA)值、色泽、脂肪酸组成等理化指标，研究腌制鳙鱼片在冷藏过程中的品质变化规律。
1. 材料与方法
1.1 试样及预处理
鳙购于北京小月河农贸市场，其平均体质量和体长分别为(1 923.04±173.67)g和(52.13±1.93)cm，活体运至实验室后击毙，去鳞、去内脏，将洗净沥干后的鱼片随机均分为2组并装于聚乙烯保鲜袋内，一组用质量分数为2%的氯化钠(NaCl)干腌，另一组不做任何处理作为对照组。将2组鱼片分别置于4 ℃的冰箱中冷藏，每隔2 d从2组鱼片中随机选取3块进行各项指标的测定，每个指标重复3次。
1.2 测定方法
1.2.1 感官评定
分为生鲜和水煮2种评价方式，生鲜鱼片以色泽、气味、组织形态和肌肉弹性为检验指标，水煮鱼片以气味、滋味和汤汁浑浊度为检测指标，各项指标分为好、较好、一般、较差和差五个级别，分值分别为5、4、3、2、1分，由10名评定人员对鱼片的各项指标进行评分，感官分值为7项指标之和。具体的评分标准参照黄晓春等[9]的评定方法。
1.2.2 pH的测定
取绞碎的鱼背部肌肉10 g于烧杯中，加入100 mL蒸馏水，搅拌30 min后过滤，取其滤液用FE-20酸度计进行测定。
1.2.3 TBA值的测定
参照ERKAN等[10]的方法并稍作修改。取2 g绞碎的鱼肉样品于50 mL的离心管中，加入16 mL 50 g · L-1的三氯乙酸溶液和100 μL 2 g · L-1的BHT乙醇溶液，高速匀浆2 min，常温5 000 r · min-1离心3 min，取上清液5 mL与1 mL 0.01 mol · L-1的TBA溶液混合，振荡后沸水浴40 min; 对照组用5 mL蒸馏水代替样品上清液，将经过水浴的反应管置于冷水中冷却5 min后，于532 nm下测定吸光度值(OD)。TBA值由样品中丙二醛(MDA)的质量分数(mg · kg-1)表示，计算公式为TBA值(mg · kg-1)=10.2×OD。
1.2.4 色泽的测定
鳙肌肉色泽变化用全自动色差仪(ADCI-60-C)测定。测量前用制造商提供的白色和黑色标准瓷板对仪器进行校准，将鱼背部肌肉绞碎，均匀的填进测量杯内进行测量。色泽的测量结果用亮度(L*)、红绿色值(a*)和黄蓝色值(b*)表示[11]。
1.2.5 总脂肪的提取
参照FOLCH等[12]的方法并稍作修改，取4 g绞碎的鱼肉样品于50 mL离心管中，加入20 mL V(氯仿) : V(甲醇)=2 : 1的混合液，静置浸提24 h，过滤后加蒸馏水10 mL并摇匀，常温2 000 r · min-1离心5 min，取下层氯仿层，用氮气吹干备用。
1.2.6 脂肪酸的甲酯化
参照AOAC[13]方法，取0.1 g的脂肪提取物于离心管中，加入3 mL 0.5 mol · L-1氢氧化钠(NaOH)/甲醇溶液，沸水浴10 min使其进行皂化反应，冷却至室温加入5 mL V(BF3) : V(甲醇)=14 : 86的混合液并沸水浴加热2 min，待冷却至室温加入5 mL庚烷来提取酯化了的脂肪酸，同时加入NaCl至溶液饱和来防止乳化，最后，庚烷提取的部分用氮吹干，贮存于-20 ℃下备用。
1.2.7 脂肪酸组成的分析
将脂肪酸甲酯(FAMES)样品溶于0.1 mL的正己烷，每次进样量为4 μL，用气相色谱仪进行脂肪酸组成的分析。气相色谱条件为气相色谱使用SPTM-2560毛细管柱(100 m×0.25 mm ID.；Supelco Inc.，Bellefonte，PA)，火焰离子检测器(FID)；进样器和检测器的温度都设置在250 ℃，毛细管柱的初始温度为140 ℃，保持5 min，以4 ℃ · min-1升至240 ℃，保持40 min；载氮气，流速为1.5 mL ·min-1。
1.3 数据统计分析
采用Excel 2010进行数据处理与作图，用面积归一化法计算各种脂肪酸的含量，用SAS 9.0软件进行差异显著性分析，采用最小显著差异法(LSD)进行显著性检验(显著性水平为P < 0.05)。
2. 结果与分析
2.1 感官分值的变化
腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的感官分值变化见图 1-a。2组鳙鱼片的感官分值均随冷藏时间的延长而下降，HONG等[5]在研究低浓度的盐和糖对鳙鱼片冷藏过程中的品质变化时也得到了类似的结论。对照组与腌制组鳙鱼片的感官分值变化具有明显差异，前者的感官分值下降速率明显大于后者。对照组鱼片贮藏至第9天的感官分值为13，而腌制组鱼片贮藏至第15天仅为12。ZHANG等[14]认为鱼的感官分值小于12消费者已无法接受，因此，未经处理的鱼片在贮藏9 d后就几乎达到了感官接受限度，而经腌制处理的鱼片在贮藏15 d后才达到感官接受限度。结果表明，腌制处理能明显延缓鱼片感官分值的变化(P < 0.05)。对照组和腌制组鳙鱼片的货架期分别为9 d和15 d。
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图 1 腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的感官分值(a)、pH (b)、硫代巴比妥酸值(c)的变化Figure 1. Changes in sensory score (a), pH (b) and TBA (c) of bighead carp fillets treated with salt and unsalted treatment during storage at 4 ℃2.2 pH的变化
贮藏过程中2组鳙鱼片的pH变化均呈先下降后上升的趋势(图 1-b)。贮藏初期pH的下降主要是由于二氧化碳(CO2)溶于鱼肉组织[15]和鱼肉中糖原的分解[16]所导致，NAKAGAWA等[17]认为pH的下降还有可能是由于脂肪水解产生的游离脂肪酸所致，随后pH的上升主要是由于微生物的分解作用所产生的碱性胺类物质所致[18]。对照组鱼片的pH在第3天就降到了最小值(6.81)，然后开始上升；而腌制组鱼片的pH一直下降到第9天才达到最小值(6.73)，随后也开始上升。显然，经过2%盐腌制处理的鳙鱼片其pH下降的时间明显长于对照组，这可能是因为腌制促进了脂质的分解进而使更多的游离脂肪酸不断产生。贮藏结束时腌制组鱼片的pH(6.89)低于对照组(7.18)，这可能是因为腌制能够抑制鱼肉中微生物的生长，降低微生物的代谢速率，抑制内源酶的活性，进而延缓了pH的上升。
2.3 TBA值的变化
腌制与未腌制鳙鱼片在4 ℃冷藏过程中的TBA值变化见图 1-c。总体来说，2组鱼片的TBA值均随着贮藏时间的延长而升高(P < 0.05)，这是因为随着贮藏时间的增加鱼片的腐败加剧，脂肪酸的氧化加快，从而形成的二级脂肪氧化产物(如醛类)增多[19]。对照组的TBA值在前9 d缓慢上升，之后快速增加，表明鱼肉中脂肪酸的氧化主要发生在贮藏后期。而经过腌制处理的鱼片，其TBA值在贮藏前6 d变化较平缓，从第6天就开始迅速上升一直到贮藏结束(P < 0.05)，说明腌制使脂肪的氧化提前。CHAIJAN等[6]对沙丁鱼冰藏过程中的脂肪变化情况进行研究时指出，其TBA值从第3天就开始迅速上升，这可能是由于沙丁鱼所含的脂肪较鳙要多。第6天以后腌制组鳙鱼片在每个时间点的TBA值都大于对照组，如第9天时腌制鱼片的TBA值(2.46 mg ·kg-1)显著高于对照组(1.02 mg · kg-1)(P < 0.05)，表明腌制能够促进脂肪的氧化。因此，与对照组相比，腌制处理不仅能够促进鱼片脂肪的氧化，还能够使脂肪的氧化提前。
2.4 色泽的变化
2%盐腌制和未经腌制的鳙鱼片在冷藏过程中各项色泽指标的变化见表 1。2组鳙鱼片的L*和b*随着贮藏时间的延长呈下降趋势，a*随着贮藏时间的增加呈上升趋势，但腌制鳙鱼片的这些指标变化幅度明显大于对照组(P < 0.05)。贮藏结束时腌制处理鱼片的L*、b*分别为36.83、-0.71，明显低于对照组的47.07、3.70(P < 0.05)，而腌制鳙鱼片的a*为8.79，明显高于对照组的6.12(P < 0.05)。与对照组相比，腌制鱼片的亮度低，肉色偏红、偏蓝，表明腌制处理对冷藏过程中鳙鱼片的色泽品质有显著的影响。HONG等[5]在研究低浓度的盐和糖对冷藏过程中鳙鱼的品质影响时也得出了相似的结论。而OCAÑO-HIGUERA等[20]研究发现(Potamotrygon)在冰藏过程中其L*并没有随贮藏时间出现明显变化，但a*和b*却发生了显著变化(P < 0.05)。关于色泽变化的原因主要有：1)L*的变化可能是由于腌制加速了鱼片的汁液流失进而使亮度降低；2)随着脂肪氧化程度的提高，氧化产生的羰基化合物(如醛和酮)增多，这些化合物能够与游离氨基酸或肽发生非酶促褐变反应，进而促进了b*的变化，还可能是腌制加速了鱼片的失水进而引起b*的变化[21]。究竟是单个因素引起，还是多个因素共同作用的结果尚需深入研究；3)关于a*的变化原因还有待进一步研究。
表 1 腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的色泽变化(X ±SD，n=3)Table 1. Colour changes of bighead carp fillets with salt and unsalted treatment during storage at 4 ℃参数parameters 贮藏时间/d storage time 对照组control 2%盐处理组treated with 2% salt 亮度L* 0 52.55±1.40Aa 52.55±1.40Aa 3 48.14±1.25Abc 40.33±2.09Bb 6 48.69±1.39Ab 38.43±0.42Bc 9 47.76±0.25Abc 33.90±2.03Be 12 46.73±0.86Ac 36.59±2.25Bd 15 47.07±0.85Ac 36.83±1.16Bcd 红绿色值a* 0 5.82±0.90Acd 5.82±0.90Ad 3 5.27±0.70Bd 8.14±2.11Ac 6 5.79±0.68Bcd 8.93±0.50Abc 9 6.99±0.37Ba 13.03±2.04Aa 12 6.78±0.27Bab 9.71±1.44Ab 15 6.12±0.62Bbc 8.79±0.94Abc 黄蓝色值b* 0 6.82±0.47Aa 6.82±0.47Aa 3 6.93±0.79Aa 3.50±0.47Bb 6 6.61±0.55Aa 1.34±0.96Bc 9 5.52±0.27Ab -2.18±1.36Be 12 3.75±0.68Ac 0.13±1.85Bd 15 3.70±0.24Ac -0.71±0.42Bd 注：A~B. 同一指标下同一行的数值上标有相同字母表示它们没有差异显著性(P>0.05)；a~e. 同一指标下同一列的数值上标有相同字母则表示它们没有差异显著性(P>0.05)；后表同此
Note：A~B. values with same superscript letters in the same column have no significant difference under the same parameter (P>0.05)；a~e. values with same superscript letters in the same row have no significant difference under the same parameter (P>0.05). The same case in the following table.2.5 脂肪酸组成的变化
腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的脂肪酸组成变化见表 2。新鲜鳙鱼片的总脂肪酸由34.13%的饱和脂肪酸(SFA)、19.95%的单不饱和脂肪酸(MUFA)和37.17%的多不饱和脂肪酸(PUFA)组成，其中含量较高的脂肪酸有棕榈酸(C16:0)、油酸(C18:1 n-9)、EPA(C20:5 n-3)、硬脂酸(C18:0) 和DHA(C22:6 n-3)。腌制鳙鱼片在贮藏期间总多不饱和脂肪酸(∑PUFA)的变化范围是34.82%~39.29%，总饱和脂肪酸(∑SFA)的变化范围为33.57%~38.20%；对照组鳙鱼片∑PUFA和∑SFA的变化范围分别为37.17%~45.09%和30.37%~34.13%。腌制鳙鱼片∑PUFA的平均含量(37.25%)明显低于对照组(41.53%)(P < 0.05)，而∑SFA含量则明显高于对照组(P < 0.05)，这可能是由于腌制最先促进了多不饱和脂肪酸的氧化，从而提高了饱和脂肪酸的相对含量。KANNER等[22]认为，NaCl能够增强铁离子的活性进而促进脂肪酸的氧化。另外，腌制处理的鳙鱼片其总n-3系列多不饱和脂肪酸(∑n-3)的平均含量(25.39%)明显低于对照组(28.40%)(P < 0.05)，而2组鱼片∑n-6的平均含量分别为9.99%和11.77%，没有显著性差异(P>0.05)，这表明腌制处理更容易促进n-3系列脂肪酸的氧化。因此，腌制能够促进鱼片脂肪酸的氧化，更容易促进PUFA尤其是n-3系列多不饱和脂肪酸的氧化，从而降低了鱼片的营养品质。
表 2 腌制和未腌制鳙鱼片在冷藏过程中的脂肪酸组成变化(X ±SD，n=3)Table 2. Changes in fatty acid profile of bighead carp fillets with salt and unsalted treatment during storage at 4 ℃% 脂肪酸fatty acids 贮藏时间/d storage time 0 3 6 9 12 肉豆蔻酸C14:0 1.22±0.26Aa 1.17±0.38Aa 0.76±0.13Ab 0.76±0.03Bb 0.86±0.18Aab 1.22±0.26Aa 1.02±0.15Aa 0.97±0.11Aa 1.01±0.01Aa 1.13±0.23Aa 棕榈酸C16:0 20.13±0.96Aa 19.88±0.29Bab 19.09±1.16Bab 18.90±0.22Bb 19.42±0.44Aab 20.13±0.96Ac 22.55±1.01Aa 22.05±1.14Aab 21.36±1.42Aabc 20.52±0.85Abc 硬脂酸C18:0 9.86±0.21Aa 8.91±1.03Bab 8.63±0.43Bbc 8.20±0.34Abc 7.90±0.43Ac 9.86±0.21Aab 11.85±1.04Aa 11.29±1.58Aab 9.83±1.20Aab 9.40±2.37Aab 总饱和脂肪酸∑SFA 34.13±1.49Aa 33.87±1.19Ba 31.64±0.99Bb 30.37±0.44Ab 31.21±0.50Ab 34.13±1.49Ac 38.2±2.36Aa 37.96±1.32Aab 34.74±2.70Abc 34.43±2.10Ac 棕榈油酸C16:1 5.43±0.22Aa 4.91±1.39Aab 3.30±0.79Ac 3.52±0.29Abc 4.52±0.94Aabc 5.43±0.22Aa 3.97±1.12Aa 3.75±0.60Aa 4.03±0.25Aa 4.54±1.30Aa 油酸C18:1 n-9 12.68±1.30Aa 11.15±1.58Aa 12.13±0.59Aa 10.65±1.38Aa 11.74±0.21Aa 12.68±1.30Aab 11.83±2.58Aab 10.16±0.51Bb 11.02±0.38Aab 13.07±2.97Aab 总单不饱和脂肪酸∑MUFA 19.95±1.22Aa 18.28±3.22Aab 17.15±0.23Aab 15.67±1.60Ab 18.13±0.93Aab 19.95±1.22Aab 17.41±3.85Aab 15.55±0.89Bb 16.47±0.26Aab 19.43±4.64Aab 亚油酸C18:2 n-6 2.97±0.75Aab 2.30±0.15Ab 6.07±3.78Aa 3.71±1.42Aab 3.11±1.18Aab 2.97±0.75Aa 4.00±3.64Aa 2.46±0.64Aa 1.09±0.58Aa 2.35±0.89Aa γ-亚麻酸C18:3 n-6 0.12±0.04Aa 0.10±0.03Aa 0.08±0.02Aa 0.11±0.01Aa 0.09±0.04Aa 0.12±0.04Aa 0.07±0.00Ab 0.06±0.01Ab 0.09±0.03Aab 0.08±0.02Aab α-亚麻酸C18:3 n-3 3.12±0.34Aa 3.19±0.38Aa 2.38±0.15Ab 2.90±0.22Aa 2.91±0.31Aa 3.12±0.34Aa 2.11±0.09Bc 2.55±0.28Ab 2.61±0.11Ab 2.51±0.11Ab DH-γ亚麻酸C20:3 n-6 0.49±0.02Aa 0.47±0.01Aa 0.50±0.09Aa 0.46±0.02Ab 0.47±0.01Aa 0.49±0.02Aa 0.49±0.08Aa 0.39±0.02Ab 0.40±0.02Bb 0.44±0.04Aab 花生四烯酸C20:4 n-6 4.32±0.52Ab 4.86±0.74Aab 4.74±0.25Aab 5.37±0.50Aa 4.77±0.13Aab 4.32±0.52Aa 4.27±0.78Aa 4.72±0.14Aa 4.66±0.37Aa 4.08±1.20Aa EPA C20:5 n-3 9.97±0.30Ab 10.46±1.43Ab 10.07±1.63Ab 12.31±1.05Aa 11.71±0.44Aab 9.97±0.30Aab 8.28±1.61Ab 10.26±1.07Aab 10.75±0.79Aa 9.76±1.49Aab DHA C22:6 n-3 9.62±1.43Ac 11.00±0.78Abc 12.55±0.57Aa 12.92±0.16Aa 12.34±0.85Aab 9.62±1.43Ac 10.43±2.13Aabc 10.05±0.62Bbc 10.73±1.48Aabc 12.48±1.23Aab 总多不饱和脂肪酸∑PUFA 37.17±1.53Ad 39.27±2.70Acd 42.87±2.08Aab 45.09±0.39Aa 42.92±1.30Aab 37.17±1.53Aab 34.82±1.54Ab 36.52±2.31Bab 39.29±2.95Ba 38.14±2.95Aab n-3系列多不饱和脂肪酸∑n-3 25.28 27.35 27.61 31.16 29.97 25.28 22.71 25.20 26.44 27.20 n-6系列饱和脂肪酸∑n-6 10.35 10.42 14.33 12.64 11.48 10.35 10.85 10.11 8.66 9.42 n-3/n-6比值n-3/n-6 ratio 2.44 2.62 1.95 2.47 2.61 2.44 2.09 2.49 3.05 2.89 注：每一种脂肪酸下第一行为对照组，第二行为腌制组
Note：Values in the first row are of the control and in the second row are of the treated with 2% salt under the same parameter.3. 结论
2组鱼片的感官分值都随着贮藏时间的延长而下降，但腌制鱼片比未腌制鱼片下降缓慢。与未腌制鱼片相比，腌制鱼片的TBA值增加更快、色泽变化更大、多不饱和脂肪酸含量下降更快。因此，2%盐腌制鳙鱼片虽然能够延长冷藏货架期，增强鱼片的口感，但会加速鱼片变色，促进脂肪酸尤其是n-3系列多不饱和脂肪酸的氧化。所以，2%食盐腌制不是一种保藏鳙的较好方法。
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图 1 HdDef1基因的核苷酸序列和氨基酸序列
起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)以红色显示，预测的信号肽使用阴影覆盖，经典的多聚腺苷酸化加尾信号用下划线标示，半胱氨酸残基使用方框标记
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of HdDef1
Translation start (ATG) and stop (TGA) codons are highlighted in red. The predicted signal peptide is shaded. The classical polyadenylation signal is underlined. Cysteine residues are boxed.
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图 2 杂色鲍HdDef1与其他软体动物和节肢动物防御素成熟肽的多序列比对
黑色阴影显示相同的氨基酸，灰色阴影显示相似的氨基酸，二硫键桥以黑色连线显示
Figure 2. Multiple alignment of mature HdDef1 sequence and other defensins found in mollusks and arthropod
The black shadow shows identical amino acids and the gray indicates similar amino acids. The disulfide linkages are shown with black lines.
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图 3 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素结构
A. 冈比亚按蚊防御素的3D结构(PDB登录号：2ny9)；B. 杂色鲍HdDef1的3D结构；C. 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素的二级结构；6个半胱氨酸残基的相对位置及3个二硫键(半胱氨酸之间的蓝线)用蓝色标记；相似的结构单元用灰色阴影标记
Figure 3. Structures of HdDef1 and A. gambiae defensin
A. 3D structure of A. gambiae defensin (PDB accession: 2ny9); B. 3D structure of HdDef1; C. secondary structures of A. gambiae defensin and HdDef1; the relative positions of six cysteine residues and three disulfide bonds (blue lines between cysteines) are labelled in blue and the similar elements of structure are shaded in gray.
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图 4 利用MEGA 5.05基于邻接法构建的HdDef1系统进化树
Figure 4. Neighbor-joining phylogenetic tree of HdDef1 by MEGA 5.05
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图 5 杂色鲍HdDef1的组织表达模式
数据显示为平均值±标准误，小写字母不同表示各组之间具有显著差异(P<0.05)
Figure 5. Expression level of HdDef1 mRNA in different tissues
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 6 哈维弧菌感染后肝胰腺中HdDef1的时序表达模式
数据显示为平均值±标准误；*. 与0小时对照组差异显著(P<0.05)
Figure 6. Temporal expression profile of HdDef1 mRNA in hepatopancreas post V. harveyi challenge
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $; *. significant difference with control group at 0th hour (P<0.05)
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence序列信息
sequence informationP1 CATCACCTGCGATCTGCTCTCCTTTA 5' RACE primer out (HdDef1) P2 TTCTGCCTGTGCTGCTAAATGCCTTG 5' RACE primer in (HdDef1) P3 ACAGACACAGACGCCACCATGACAG 3' RACE primer out (HdDef1) P4 GCCATACCGACGATGACAACAACCAAAC 3' RACE primer in (HdDef1) Def-F TGGTTGTTGTCATCGTCGGTAT qRT-PCR primer for HdDef1 Def-R AGTAACAAGGCATTTAGCAGCAC qRT-PCR primer for HdDef1 18S-F ACGCATCTATCAAGTGTCTGCCCTA qRT-PCR primer for 18S 18S-R CTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAG qRT-PCR primer for 18S 
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