Molecular characterization and expression pattern analysis of a defensin (HdDef1) from small abalone (Haliotis diversicolor)
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摘要:
防御素(defensin)是最重要的抗菌肽(AMPs)之一，参与先天免疫防御反应。该研究通过RNA-seq和RACE技术从杂色鲍(Halitotis diversicolor)中克隆到一种新的防御素基因(命名为HdDef1)。HdDef1 cDNA的开放阅读框(ORF)为201 bp，编码66个氨基酸，编码蛋白由18个氨基酸的信号肽和48个氨基酸的成熟肽组成。HdDef1的成熟肽具有AMPs的特征，如分子量较低、净正电荷(+1)、高疏水残基率(45%)。同时，成熟肽的6个半胱氨酸以C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C模式排列，并通过3个二硫键(C1-C4、C2-C5和C3-C6)稳定α-螺旋/β-折叠基序(CSαβ)。此外，通过与冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)防御素在三维结构上的相似性及其系统进化关系比对表明，HdDef1是节肢动物防御素家族的新成员。荧光定量PCR显示，HdDef1转录本在肠、头、鳃、肝胰腺、外套膜和足中均有表达，其中肝胰腺具有最高的表达水平。哈维弧菌(Vibrio harveyi)感染后，肝胰腺中HdDef1 mRNA被显著诱导表达。结果表明，HdDef1可能在杂色鲍抵抗病原的免疫防御反应中发挥重要作用，但其在蛋白水平的抗菌活性还需要进一步研究。
Abstract:Defensin is one of the most important antimicrobial peptides (AMPs) that participate in invertebrate innate immunity against invading pathogens. In the present study, a novel defensin was identified in small abalone (Haliotis diversicolor) that was denoted as HdDef1 by using RNA-seq and RACE techniques. The HdDef1 cDNA contained a 201 bp open reading frame (ORF) encoding 66 amino acids including a signal peptide of 18 amino acids and a mature peptide of 48 amino acids. The mature peptide of HdDef1 shared common features of AMPs, such as lower molecular mass, net positive charge (+1) and high hydrophobic residue ratio (45%). In addition, six cysteines in the mature peptide were arranged in the pattern of C-X16-C-X3-C-X9-C-X4-C-X1-C and stabilized the α-helix/β-sheet motif (CSαβ) with three disulfide bonds (C1-C4, C2-C5 and C3-C6) in the predicted tertiary structure. Moreover, by comparision with the similar three-dimensional structure of Anopheles gambiae defensin and phylogenetic analysis, it is suggested that HdDef1 might be a new member of the arthropod defensin family. Quantitative real-time PCR analysis reveals that HdDef1 transcripts were expressed constitutively in intestine, head, gill, hepatopancreas, mantle and foot, with the highest level in hepatopancreas. After being challenged with Vibrio harveyi, HdDef1 transcripts were induced significantly in hepatopancreas. The results indicate that HdDef1 might have an important function in host defense against invasive pathogenic bacteria, but its antimicrobial activity at protein level needs further study.
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Keywords:
- Haliotis diversicolor /
- HdDef1 /
- gene cloning /
- tissue distribution /
- immune challenge
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三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 隶属甲壳纲、十足目、梭子蟹科、梭子蟹属，广泛分布于西北太平洋及东南亚沿海，处于食物链较底层，生长速度快、适应能力强、分布范围广，是我国近海海洋生态系统中的优势物种，是海洋生态系统中物质传递和能量流动的重要载体，决定着海洋生态系统的许多重要生态过程。近年来，有关三疣梭子蟹的研究大多集中在生物学特性与养殖[1-5]、基因表达与免疫[6-9]等方面，对其年龄鉴定的相关研究甚少。但年龄鉴定一直是甲壳类生物研究的重要内容，有利于了解及掌握其种群结构、开展资源评估，为制订渔业管理措施提供依据，因此提供更加精确的直接年龄鉴定方法十分必要。
甲壳类生物因其特殊的生长方式 (蜕壳)，其年龄鉴定尤其困难。长期以来大多数学者采用标志重捕法[10]和体长频率法[11]等间接方法鉴定其年龄，但因方法的局限性，鉴龄的精确度不高；放射性同位素分析法[12]虽可较为精准鉴龄，但成本较高。最新研究表明甲壳类硬组织结构 (眼柄和胃磨) 能够作为直接鉴定其年龄的方法[13]。Leland等[14-15]利用甲壳动物的胃磨研磨截面微结构进行年龄鉴定，为甲壳动物年龄鉴定研究提供了新方向。Kilada等[13,16]先后发现美国螯龙虾 (Homarus americanus) 与斑纹黄道蟹 (Cancer irroratus) 两者的胃磨生长纹与年龄有着一定关系。现有研究中对三疣梭子蟹进行年龄鉴定的较少，蒋瑞等[17]发现三疣梭子蟹眼柄生长纹与其生长有关，但未肯定宽带个数代表其年龄。本研究通过对三疣梭子蟹胃磨微结构进行观察，探讨利用胃磨微结构对三疣梭子蟹进行年龄鉴定的可行性，分析胃磨微结构与基础生物学数据及年龄间的关系，以期为今后深入开展三疣梭子蟹年龄鉴定和其资源评估提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 实验样本的采集
三疣梭子蟹样本共185只，分别采集于三疣梭子蟹南通养殖基地 (100只)、江苏南通近海 (45只) 和上海芦潮港附近 (40只)。
1.2 胃磨的制片
测量取样个体生物学数据 [甲长 (Carapace length，CL)、甲宽 (Carapace width，CW)、体质量 (Body mass，m) ] 后取出胃磨，放置于70%的乙醇溶液中运送回实验室，在实验室中将胃磨转移至乙醇甘油混合溶液中 [V (乙醇)∶V (甘油)∶V (水)=6∶3∶1]；实验时使用解剖针剔除胃磨中附着的有机物，并使用蒸馏水冲洗干净。采用国内外胃磨结构划分的常规方法[18]，可将胃磨结构分为5个部分，即前幽门骨、外幽门骨、尾贲门骨、轭贲门骨和翼贲门骨 (图1)。以往的甲壳类鉴龄研究表明，外幽门骨和尾贲门骨经过预处理并切片后能在显微镜下清晰地观察到类似鱼类耳石或甲壳类眼柄中生长纹结构[15]，因此本研究采用这两种结构进行切片观察。
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图 1 三疣梭子蟹胃磨结构展开示意图Figure 1. Schematic diagram of gastric mill structure of P. trituberculatus采用蒋瑞等[19]眼柄的制片方法，对于胃磨中外幽门骨和尾贲门骨在进行包埋前先使用无水乙醇脱水，再放入包埋盒中使用调配好的冷埋树脂溶液固定 (固化剂与亚克力粉按照体积比1.5∶1的比例调配，固化剂黏度为60 mPas)。包埋好的树脂样本放在阴凉通风处24 h待其硬化，后将包有胃磨的模具依次用120、240、600、1 200和2 500目的水磨砂纸打磨，在打磨过程中不断在显微镜下观察，直至能清晰观察到胃磨结构的平面，之后对此树脂薄片抛光，再清除其表面杂质，用吸水纸擦干表面水分。然后将抛光过的截面朝下，用热熔胶粘在载玻片上，使用同样的方法对另一面进行打磨，直至在显微镜下模具截面的生长纹清晰可见，再抛光得到切片。最后将做好的切片用密封袋密封保存，以备观察微结构时使用。
1.3 生长纹读取方法
生长纹的计数以胃磨中“暗纹”为计数标准。使用目视方法确定角质层边界，并且以该边界为计数起点。将胃磨切片照片依据照片的可读性分为3个等级。1) 清晰：沿着单个平面读数，可以连续且快速地读取所有生长纹的切片；2) 基本清晰：无法在单个平面内连续读取所有生长纹，但是通过平面的平移可以将生长纹全部读取的切片；3) 无法读取：无法辨别生长纹分界、明显脱钙、生长纹不完全及有明显缺陷的切片，这切片的读数不计入后续的数据分析。
每个样本的胃磨切片照片分别由3名不同实验室人员在相互独立的环境下判读其轮纹数量。采用变异系数 (CV) 以校对每个样本读数的准确性，公式为:
$$ {\rm{CV}} = \frac{{\sqrt {\frac{{{{\left( {{R_1} - R} \right)}^2} + {{\left( {{R_2} - R} \right)}^2} + {{\left( {{R_3} - R} \right)}^2}}}{2}} }}{R} \times 100{\text{%}} $$ (1) 其中R1、R2、R3分别表示3名不同人员对同一样本的读数，R表示3位人员读数的平均值，根据其他研究的经验[20-21]，当每个样本读数的变异系数值不高于10%时认为该次读数可信。
1.4 蜕壳次数的估算
通过周期性的蜕壳实现生长是甲壳动物最明显的生长特点。掌握甲壳类动物的蜕壳规律是研究其年龄与生长等信息的重要依据。高天龙等[22]认为三疣梭子蟹蜕壳周期时间随着期数的增加而增大，但其个体生命史中只存在有限数量的蜕壳次数，同时引入了单位阶梯函数来表示蜕壳次数f(m) 与体质量m的关系，具体函数为：
当m <0，u(m) =0；当m >0，u(m) =1；
$$ \begin{array}{c} f\left( m \right) = u\left( m \right) + u\left( {m - 0.014} \right) + u\left( {m - 0.033} \right) + u( {m }-\\ 0.104 ) + u\left( {m - 0.411} \right) + u\left( {m - 1.4} \right) + u\left( {m - 3.89} \right) +\\ u\left( {m - 11.56} \right) +u\left( {m - 32.77} \right) + u\left( {m - 66.28} \right) + \\ u\left( {m - 114.02} \right) + u\left( {m - 177.84} \right) + u\left( {m - 256.61} \right) \end{array} $$ (2) 该阶梯函数对于蜕壳阶段在5—11期的三疣梭子蟹判对率高达91.38%，因此本文采用该阶梯函数来推算取样三疣梭子蟹的蜕壳次数，并以此来探索蜕壳次数与胃磨生长纹数量之间的关系。
1.5 生长方程模型
由于缺乏对其的精准鉴龄，有关其生长方程的研究也较少。故本研究采用目前推算水生生物常用的7种生长方程模型：线性模型、幂函数模型、指数模型、对数模型、Logistic模型、von Bertalanffy模型 (v-B模型) 和Gompertz模型来拟合三疣梭子蟹的生长方程，并开展最适模型的选择，各模型公式为：
线性方程，
$$ f\left( t \right) = {\rm{a}} + {\rm{b}}t $$ (3) 幂函数方程，
$$ f\left( t \right) = {\rm{a}}{t^{\rm{b}}} $$ (4) 指数方程，
$$ f\left( t \right) = {\rm{a}}{{\rm{e}}^{{\rm{b}}t}} $$ (5) 对数函数方程，
$$ f\left( t \right) = {\rm{a}}\ln t + {\rm{b}} $$ (6) Logistic生长方程，
$$ f\left( t \right) = \frac{{{{{L}}_\infty }}}{{1 + {{\rm{e}}^{ - {\rm{K}}\left( {t - {{\rm{t}}_0}} \right)}}}} $$ (7) von Bertalanffy生长方程，
$$ f\left( t \right) = {L_\infty } \times \left[ {1 - {{\rm{e}}^{ - {\rm{K}}\left( {t - {t_0}} \right)}}} \right] $$ (8) Gompertz生长方程，
$$ f\left( t \right) = {L_\infty } \times {{\rm{e}}^{\left[ {1 - {{\rm{e}}^{ - {\rm{K}}\left( {t - {t_0}} \right)}}} \right]}} $$ (9) 其中f (t) 表示三疣梭子蟹的甲长 (CL)、甲宽 (CW) 或体质量 (m)，t表示胃磨生长纹个数，a、b、K、L∞和t0表示对应公式中常数项。对于Logistic方程、v-B方程和Gompertz方程，L∞表示无限年龄的三疣梭子蟹渐进的甲长、甲宽或体质量，t0表示理论上当甲长、甲宽或体质量为0时三疣梭子蟹的生长纹数量，在一般情况下，该值为负值。K值则表示常数。为了更加快速地拟合各公式，本研究中在迭代过程中起始值默认为所有样本中甲长、甲宽或体质量的最大值，而为了避免出现理论上的错误，t0和K的起始值则为0，并约束−t0和K值为正值。
在选取最适函数时，使用赤池信息量准则(Akaike information criterion, AIC)，AIC为最小时，则认为该模型在常用7个生长模型当中为最适模型，选定最适函数后使用回归系数 (R2) 作为判断数据对该模型的拟合程度。
AIC计算方法为：
$$ {\rm{AIC}} = 2k + n{\rm{ln}}\left( {\frac{{{\rm{RSS}}}}{n}} \right) $$ (10) 式中k为模型的参数数量，n为样本数量，RSS为所有样本量的残差平方和。
2. 结果
2.1 胃磨的微结构
胃磨位于虾蟹类的消化系统中，大部分虾蟹类食道通入一个能够收缩的三角形囊状胃，胃内部角质层发达，与胃壁共同形成的嵴构成胃磨。由于胃磨形状的不规则性及胃磨由多块相对独立的部分组合而成，因此将胃磨在显微镜下所观察的微结构分为两部分：1) 在肉眼下能观察到类似与动物牙齿的齿板部分；2) 不包含齿板的剩余白色部分 (柄部及翼部)。生长纹主要分布于胃磨各部分的柄部和翼端，本研究中胃磨微结构特指能够观察到生长纹的柄部切面微结构。
通过显微镜下观察三疣梭子蟹胃磨微结构后发现 (图2)，胃磨微结构由4个部分组成：蜡质层、外角质层、钙化层和膜层。蜡质层紧邻外角质层，外角质层位于胃磨靠向外一侧，边缘规则且光滑，但因内部含有少量色素透光度低，但随着切片厚度减小，透光度有所提升，主要由几丁质构成，在显微镜下观察不到任何的周期性生长纹结构。膜层在胃磨内侧与肌肉或其他组织接触部分，在显微镜下可以观察到黑色部分，透光度较高，钙化层是胃磨微结构中占比最大的一部分，钙化程度较高，在显微镜下能观察明暗相间的生长纹结构，与膜层为平移关系，同时钙化层中还存在垂直生长纹。
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图 2 外幽门骨 (a)、尾贲门骨 (b) 和眼柄 (c) 微结构及生长纹Figure 2. Microstructure and growth bands of explyloric ossicle (a), urocardiac ossicl (b) and eyestalk (c)与同样作为甲壳类直接年龄鉴定材料的眼柄微结构 (图2-c) 相比，胃磨微结构与其略有不同。眼柄切片中色素层充满了红色色素，而胃磨中表层较薄，色素层呈现黑色，且色素层占比比眼柄切片小。胃磨钙化层所占比例要大于眼柄中钙化层。在胃磨和眼柄切片中均可观察到密集且间距均匀的细纹，还可以观察到颜色较深、排列稀疏的宽带，一个宽带内可以看到包含数条或十数条细纹。
2.2 生长纹读数的精确性
生长纹读数的准确度会直接影响到最终的实验结果，因此在利用生长纹个数拟合生长方程之前，要判断对样本生长纹读数的精确度。Kilada等[23]利用眼柄和胃磨直接鉴定南极磷虾 (Euphausis superba) 年龄发现，当变异系数CV小于10%，该组数据可被使用。在本研究中，由3名实验人员单独对同一样本的胃磨生长纹读数，经计算得出平均变异系数为8.6% (n=185)，因此该生长纹数据准确可靠，可用于拟合有关生长方程的研究。
2.3 生长模型建立
2.3.1 甲长、甲宽与体质量生长模型
通过基本生物学测量分析后，185只样本中包含雌蟹120只，雄蟹65只。总体样本中甲长为20~99 mm [平均值 (57.27±1.30) mm]，甲宽介于43~190 mm [平均值 (116.25±2.22) mm]，体质量介于3.70~365.89 g [平均值 (105.86±5.92) g]。雌雄三疣梭子蟹基础生物学数据见表1，在平均值上雌蟹数据要略高于雄蟹。分别对所有的三疣梭子蟹甲长、甲宽和体质量数据进行分析，得出以下三疣梭子蟹甲长CL与甲宽CW的关系 (图3、图4、图5)。
表 1 三疣梭子蟹样本个体基础生物学数据Table 1. Basic biological data of gastric abrasion growth samples of P. trituberculatus项目
Item雄蟹 Male 雌蟹 Female 甲长 CL/mm 甲宽 CW/mm 体质量 m/g 甲长 CL/mm 甲宽 CW/mm 体质量 m/g 样本量 Sample number 65 65 65 120 120 120 最大值 Maximum 99 190 365.89 97 189 363.17 最小值 Minimum 20 43 3.7 24 60 7.29 平均值 Mean 50.05 105.47 85.33 61.18 122.08 166.97 标准误 Standard error 2.27 4.17 10.16 1.47 2.67 7.10 ![]()
图 3 雄性 (a) 与雌性 (b) 三疣梭子蟹甲长与甲宽关系图Figure 3. Relationship between carapace length and width of male (a) and female (b) P. trituberculatus![]()
图 4 雄性 (a) 与雌性 (b) 三疣梭子蟹甲宽与体质量关系图Figure 4. Relationship between carapace width and body mass of male (a) and female (b) P. trituberculatus![]()
图 5 185只三疣梭子蟹甲长与甲宽、甲宽与体质量关系图Figure 5. Relationship between carapace length and carapace width, carapace width and body mass of 185 individuals of P. trituberculatus雄性三疣梭子蟹：
$$ {\rm{CW}} = 1.77{\rm{CL}} + 16.94\;(n = 65,{R^2} = 0.93,P < 0.01) $$ (11) 雌性三疣梭子蟹：
$$ {\rm{CW}} = 1.72{\rm{CL}} + 16.93\;(n = 120,{R^2} = 0.89,P < 0.01) $$ (12) 185只三疣梭子蟹：
$$ {\rm{CW}} = 1.72{\rm{CL}} + 17.93\;(n = 185,{R^2} = 0.89,P < 0.01) $$ (13) 三疣梭子蟹甲宽CW与体质量m的关系：
雄性三疣梭子蟹：
$$ m = 8.28 \times {10^{ - 5}}{\rm{C}}{{\rm{W}}^{2.91}}(n = 65,{R^2} = 0.87,P < 0.01) $$ (14) 雌性三疣梭子蟹：
$$ m = 4.92 \times {10^{ - 5}}{\rm{C}}{{\rm{W}}^{3.02}}(n = 120,{R^2} = 0.92,P < 0.01) $$ (15) 185只三疣梭子蟹：
$$ m = 6.31 \times {10^{ - 5}}{\rm{C}}{{\rm{W}}^{2.97}}(n = 185,{R^2} = 0.92,P < 0.01) $$ (16) 2.3.2 甲长、甲宽、体质量与生长纹的关系
根据最小AIC法原则 (表2)，185个样本中，甲长、甲宽与胃磨生长纹个数的关系均适合v-B生长模型来表示 (图6)，关系式分别为：
表 2 7个生长模型函数拟合结果Table 2. Seven growth model function fitting results模型
Model甲长-生长纹个数
CL-t甲宽-生长纹个数
CW-t体质量-生长纹个数
m-tR2 AIC R2 AIC R2 AIC 线性 Linear 0.884 473.77 0.922 539.78 0.868 710.89 幂函数 Power 0.834 504.01 0.886 571.06 0.910 678.42 指数 Exponent 0.865 486.36 0.906 555.32 0.913 675.90 对数 Logarithm 0.841 500.07 0.897 562.54 0.698 780.75 逻辑斯蒂 Logistic 0.897 465.69 0.953 499.09 0.907 683.98 v-B 0.910 449.19 0.995 4 498.26 0.914 677.15 冈珀茨 Gompertz 0.870 484.63 0.949 504.56 0.922 668.93 注：加粗表示拟合结果最好 Note: Bold indicates the best fit result. ![]()
图 6 三疣梭子蟹甲长、甲宽、体质量与生长纹数目的关系Figure 6. Relationship between carapace length, carapace width, body mass and growth increments of P. trituberculatus$$ {\rm{CL}}=103.42 \times ( {1-{{\rm{e}}^{ - 0.027\;7t-1.149}}} )( {n=185,{R^2}=0.91,P < 0.01} ) $$ (17) $$ {\rm{CW}} = 202.96 \times ( {1 - {{\rm{e}}^{ - 0.032\;2t}}} )(n = 185,{R^2} = 0.90,P < 0.01) $$ (18) 体质量与胃磨生长纹个数的关系适合使用Gompertz模型来表示 (图6)，且关系式为：
$$ m = 356.27 \times {{\rm{e}}^{\left[ {1 - {{\rm{e}}^{ - 0.027\;1\left( {t - 59.6} \right)}}} \right]}}\left( {n = 185,{R^2} = 0.92,P < 0.01} \right) $$ (19) 同样，雄性三疣梭子蟹甲长、甲宽、体质量与其胃磨生长纹数目的关系均适于用Gompertz模型描述，表达式分别为：
$$ {\rm{CL}} = 51.296 \times {{\rm{e}}^{\left[ {1 - {{\rm{e}}^{0.028\left( {t - 26.014} \right)}}} \right]}}( {n = 65,{R^2} = 0.98,{{P}} < 0.01} ) $$ (20) $$ {\rm{CW}} = 87.853 \times {{\rm{e}}^{\left[ {1 - {{\rm{e}}^{ - 0.033\left( {t - 18.471} \right)}}} \right]}}( {n = 65,{R^2} = 0.99,{{P }}< 0.01} ) $$ (21) $$ m = 2{\rm{}}512.410 \times {{\rm{e}}^{\left[ {1 - {{\rm{e}}^{0.015\left( {t - 129.841} \right)}}} \right]}}( {n = 65,{R^2} = 0.96,{{P}}< 0.01} ) $$ (22) 对于雌性三疣梭子蟹，其甲宽以及体质量与胃磨生长纹数目的关系均适于用幂函数生长模型来描述，表达式分别为：
$$ {\rm{CW}} = 17.704{t^{0.573}}(n = 120,{R^2} = 0.89,P < 0.01) $$ (23) $$ m = 0.357{t^{1.684}}(n = 120,{R^2} = 0.81,P < 0.01) $$ (24) 雌性甲长与胃磨生长纹数目的关系则适于用v-B生长模型描述，表达式为：
$$ {\rm{CL}}=98.007\times\left[ {1-{{\rm{e}}^{ - 0.037{\rm{}}\left( {t - 1.201} \right){\rm{}}}}} \right](n=120,{R^2}=0.84,P < 0.01) $$ (25) 2.4 生长纹与预估蜕壳次数关系
在本研究中选取70个胃磨切片清晰的样本，利用单位阶梯函数的判定，得到其样本的预估蜕壳次数。通过对胃磨生长纹和预估蜕壳次数的拟合，两者存在幂函数关系 (图7)，关系式为u=0.207 1t2.105 2(n=70，R2=0.77)。
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图 7 三疣梭子蟹预估蜕壳次数与胃磨生长纹关系拟合图Figure 7. Relationship between estimate molting preriod and growth increments of P. trituberculatus3. 讨论
Leland等[14]在研究红鳌鳌虾 (Cherax quadricarinatus) 胃磨时发现胃磨研磨截面展示出与鱼类耳石相近的同心生长纹，这开启了虾蟹类年龄鉴定研究的新方向，而后又使用钙黄绿素染色追踪红鳌鳌虾胃磨生长后，在胃磨切片中能明显看到生长痕迹，这也是目前证明胃磨能够作为甲壳类直接年龄鉴定最有力的证据[15]。Sheridan等[24]和Kilada等[13]在实验中采用外幽门骨或尾贲门骨作为甲壳类年龄鉴定，结果显示两者组织切片在显微镜下能够观察到清晰的生长纹，并且其生长纹与年龄信息显著相关。Sheridan等[24]利用硬组织生长纹计数法对普通黄道蟹 (Cancer pagurus) 鉴龄时，其轭贲门骨中生长纹清晰可见，但未在眼柄中观察到清晰的生长纹，这不排除是样本制备所导致。本研究结果显示，胃磨微结构中存在与眼柄相似的生长纹，且胃磨微结构中钙化层比例较大，生长纹清晰可见。对于甲壳类动物来说，目前为止没有哪一种方法可以独立对其进行精确鉴龄，因此可以同时对眼柄及胃磨生长纹分析，两者互为辅助，并与多种鉴龄方法相结合，交叉验证，以提高鉴龄的精确性。对甲壳类年龄鉴定最大的问题就是所使用的材料是否会在甲壳类独特的生长过程 (周期性蜕壳) 中被蜕去。如果在蜕壳过程中所使用的年龄鉴定材料随着老化的外壳丢失，那么该鉴龄材料则只能记录两次蜕壳间的生长信息。但是，Kilada等[13]在对雪蟹 (Chionoecetes opilio) 蜕壳的观察中发现，其眼柄不会随着蜕壳过程丢失，这使得眼柄可以成为甲壳类鉴龄材料。同样地，Leland等[15]也证明了在水晶蟹 (Chaceon albus) 蜕壳过程中，其胃磨也不会随着蜕壳过程而丢失。Krafft等[25]研究发现，胃磨当中的生长纹与已知能够作为甲壳类年龄鉴定材料的眼柄生长纹数量呈函数关系。因此胃磨中生长纹可以作为年龄鉴定材料。三疣梭子蟹通过蜕壳实现生长，在整个生长周期内，蜕壳次数有限。王小刚[26]认为三疣梭子蟹的龄期 (每蜕壳1次，称作1个龄期) 与其蜕壳次数呈正相关关系。故本研究引入高天龙等[22]建立的通过体质量判断期龄的判定函数，以此来探索蜕壳次数与胃磨生长纹数量之间的关系。结果发现，蜕壳次数与生长纹数目之间呈幂函数关系。即在幼蟹时期，三疣梭子蟹每次蜕壳间胃磨所累积的生长纹数目要远少于成年后三疣梭子蟹每次蜕壳间胃磨所累积的生长纹数目。
国内外渔业生物学研究者在对甲壳类生物研究中，各甲壳类甲宽 (头胸甲长) 与体质量关系的研究均采用幂函数，其中幂函数系数b均介于2.5~3.5。通过对所采集的样本分析，本研究中总样本的幂指数系数为3.05，雄蟹为2.91，雌蟹为3.02。即可认为本研究所使用样本符合大部分三疣梭子蟹的生长规律，即等速生长，说明三疣梭子蟹个体在整体生活史中体型随着质量增加等比增大。同时本研究中雌雄三疣梭子蟹幂指数系数相差不大，说明三疣梭子蟹甲宽与体质量关系函数在性别上没有显著差异。与王小刚等[27]使用v-B生长模型所计算得出的渐近甲宽 (L∞=210 mm) 相比，本研究中通过胃磨生长纹代替实际年龄所拟合出的函数其渐近甲宽 (L∞=202.96 mm) 要小。同时从以往的研究来看，在20世纪后期林景祺[28]在中国海洋渔业资源中指出中国近海三疣梭子蟹甲宽范围在30~250 mm，优势甲宽为120~190 mm；张健等[29]研究表明，在中国东海近海的三疣梭子蟹甲宽范围在63.3~201.5 mm，优势甲宽仅为110~160 mm。说明中国近海部分三疣梭子蟹偏向于小型化，且相对于早期个体有明显差距，这也是本研究中渐近甲宽、甲长和体质量要略小于早几年研究的原因。三疣梭子蟹甲宽与甲长之间为线性关系，这也和大多数学者研究结果一致。此外，逻辑斯蒂生长方程、v-B生长模型和Gompertz方程均可用于描述水生生物生长，而在本研究中对于三疣梭子蟹胃磨生长纹个数与其基础生物学数据的关系中，甲长与甲宽和胃磨生长纹数目关系适于用v-B生长模型描述，而体质量和胃磨生长纹数目则更适于用Gompertz模型进行描述。Kilada等[30]在雌性欧洲龙虾 (Homarus gammarus) 和雌性斑纹黄道蟹 (Cancer irroratus) 的轭贲门骨切片中分别观察到了4个和9个宽生长纹，且证实宽带个数与两者实际年龄相近。Kilada和Acuna[16]也在黄蹲龙虾 (Curvimunida johni) 的中位骨切片中观察到了宽带，且认为此宽带是以年为单位形成的。Ismail等[31]研究得出榄绿青蟹 (Scylla oliviacea) 轭贲门骨切片中的宽带数目可以作为估计其年龄的依据。本研究在三疣梭子蟹外贲门骨切片中也观察到了宽带，依据前人研究结果，推测可以用宽带数目估计其年龄。
本研究表明，采用胃磨对三疣梭子蟹鉴龄是可行的，但本实验采用的均为未知年龄的三疣梭子蟹样本，因此只能依据前人研究成果推测胃磨切片中宽带个数与实际年龄相近，后续应使用已知年龄的样本对该推测进行验证。在探讨三疣梭子蟹胃磨生长纹与其年龄的相关性时，笔者尚无法对胃磨生长纹的形成机制作出合理解释。未来的研究重点应落在以下两个方向：1) 延长实验样本 (已知年龄) 采集周期并缩短采集间隔，以验证更加精确的周期性实验，提高三疣梭子蟹胃磨鉴龄的精确性；2) 采用材料学方法 (电子显微镜、荧光染色和同位素分析等) 探究三疣梭子蟹胃磨的形成机制。
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图 1 HdDef1基因的核苷酸序列和氨基酸序列
起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)以红色显示，预测的信号肽使用阴影覆盖，经典的多聚腺苷酸化加尾信号用下划线标示，半胱氨酸残基使用方框标记
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of HdDef1
Translation start (ATG) and stop (TGA) codons are highlighted in red. The predicted signal peptide is shaded. The classical polyadenylation signal is underlined. Cysteine residues are boxed.
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图 2 杂色鲍HdDef1与其他软体动物和节肢动物防御素成熟肽的多序列比对
黑色阴影显示相同的氨基酸，灰色阴影显示相似的氨基酸，二硫键桥以黑色连线显示
Figure 2. Multiple alignment of mature HdDef1 sequence and other defensins found in mollusks and arthropod
The black shadow shows identical amino acids and the gray indicates similar amino acids. The disulfide linkages are shown with black lines.
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图 3 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素结构
A. 冈比亚按蚊防御素的3D结构(PDB登录号：2ny9)；B. 杂色鲍HdDef1的3D结构；C. 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素的二级结构；6个半胱氨酸残基的相对位置及3个二硫键(半胱氨酸之间的蓝线)用蓝色标记；相似的结构单元用灰色阴影标记
Figure 3. Structures of HdDef1 and A. gambiae defensin
A. 3D structure of A. gambiae defensin (PDB accession: 2ny9); B. 3D structure of HdDef1; C. secondary structures of A. gambiae defensin and HdDef1; the relative positions of six cysteine residues and three disulfide bonds (blue lines between cysteines) are labelled in blue and the similar elements of structure are shaded in gray.
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图 4 利用MEGA 5.05基于邻接法构建的HdDef1系统进化树
Figure 4. Neighbor-joining phylogenetic tree of HdDef1 by MEGA 5.05
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图 5 杂色鲍HdDef1的组织表达模式
数据显示为平均值±标准误，小写字母不同表示各组之间具有显著差异(P<0.05)
Figure 5. Expression level of HdDef1 mRNA in different tissues
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 6 哈维弧菌感染后肝胰腺中HdDef1的时序表达模式
数据显示为平均值±标准误；*. 与0小时对照组差异显著(P<0.05)
Figure 6. Temporal expression profile of HdDef1 mRNA in hepatopancreas post V. harveyi challenge
Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $; *. significant difference with control group at 0th hour (P<0.05)
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence序列信息
sequence informationP1 CATCACCTGCGATCTGCTCTCCTTTA 5' RACE primer out (HdDef1) P2 TTCTGCCTGTGCTGCTAAATGCCTTG 5' RACE primer in (HdDef1) P3 ACAGACACAGACGCCACCATGACAG 3' RACE primer out (HdDef1) P4 GCCATACCGACGATGACAACAACCAAAC 3' RACE primer in (HdDef1) Def-F TGGTTGTTGTCATCGTCGGTAT qRT-PCR primer for HdDef1 Def-R AGTAACAAGGCATTTAGCAGCAC qRT-PCR primer for HdDef1 18S-F ACGCATCTATCAAGTGTCTGCCCTA qRT-PCR primer for 18S 18S-R CTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAG qRT-PCR primer for 18S 
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