Protection of Jian carp with immunization of CyHV-3 ORF65 DNA vaccine
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摘要:
为开发针对鲤疱疹病毒3型(Cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3) [ 又称为锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus，KHV)] 的DNA疫苗，该研究将CyHV-3 ORF65插入pEGFP-N1，构建pEGFP-ORF65重组质粒，通过转染实验与活体成像实验证实pORF65-EGFP融合蛋白可以在建鲤(Cyprinus carpio var. Jian)体外、体内表达；重组质粒按照3 μg·尾−1的剂量尾柄肌肉注射免疫10 g左右的建鲤鱼苗，免疫3次，ELISA检测表明pEGFP-ORF65免疫后可以显著提高血清特异性抗体水平；攻毒实验显示，CyHV-3攻毒21 d后，PBS组、pEGFP-N1组和pEGFP-ORF65组的建鲤成活率分别为25%、30%和90%，攻毒建鲤的成活率显著提高(P<0.01)。该研究为ORF65作为DNA疫苗靶基因应用于CyHV-3的防控提供了依据。
Abstract:In order to develop a DNA vaccine against Cyprinid herpes virus 3 (CyHV-3), also known as Koi herpesvirus (KHV), we inserted CyHV-3 ORF65 into pEGFP-N1 to construct recombinant plasmid pEGFP-ORF65. The expression of pORF65-EGFP fusion protein in Cyprinus carpio var. Jian was confirmed by transfection and in vivo imaging experiments. The recombinant plasmid was injected into the tail stalk of the carp seedlings at dosage of 3 μg·tail−1 for about 10 g and immunized for three times. ELISA detection shows that pEGFP-ORF65 could significantly increase the level of serum specific antibodies. The challenge test shows that 21 d after CyHV-3 challenge, the survival rates of PBS group, pEGFP-N1 group and pEGFP-ORF65 group were 25%, 30% and 90%, respectively, which significantly improved the survival rate of the carp seedlings (P<0.01). The study provides a basis for the application of ORF65 as a target gene of DNA vaccine in the prevention and control of CyHV-3.
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Keywords:
- Cyprinid herpesvirus 3 /
- Koi herpesvirus /
- ORF65 /
- DNA vaccine /
- ELISA
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光合细菌菌剂是以培养基为原料、活性光合细菌为菌种，经现代生物工程技术研制而成的一种微生物制剂[1-2]。因具有降解养殖环境中的有害氮素、硫化氢等有毒有害物质等功能[3-6]，从20世纪80年代起光合细菌就被广泛应用于水产养殖业[7]。随着水产养殖业的快速发展，渔用光合细菌成为水产微生物制剂的研究热点之一。然而，虽经多年发展，渔用光合细菌菌剂却呈现出产品质量良莠不齐，作用效果难以保证；光合细菌种类多[8-10]，加之使用环境条件复杂，评估光合细菌菌剂产品在实际应用中的效果存在一定难度[11]等诸多问题。已有的研究更多地关注高效光合细菌菌株的分离筛选[12-13]、作用效果[14-15]等方面，而目前对光合细菌菌剂的组成及其在降解水质因子的同时对水体微生物群落的影响研究报道尚少。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，属于红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属[16]，是最常用的渔用光合细菌菌剂的细菌种类之一[17-18]，其通过体内的脱氮酶系、亚硝酸盐还原酶的作用降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质[19-20]。雷爱莹等[21]从高产对虾养殖池塘底泥中分离得到了一株活性较高的沼泽红假单胞菌，研究发现其具有降解凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘水体中氨氮、亚硝氮的功能。然而，仅关注沼泽红假单胞菌特定菌株自身的生理生态特征和功能特性还显不足，从其对水体微生物群落影响的角度分析其作用原理可能会得到更多新的阐释。
因此，本研究选择市场上购买的知名品牌渔用光合细菌菌剂(该菌剂标签所标注的主要成分为红螺菌(Rhodospirillum sp.)，标明其具有降解氨氮、亚硝氮的功能)和从菌种保藏中心购买的沼泽红假单胞菌菌株，比较分析其对实验水体氮磷营养盐的作用效果，并采用高通量测序技术分析了实验结束时水体的微生物群落组成。通过针对性地对比分析光合细菌菌剂产品与沼泽红假单胞菌的生理生态特性，从其对水体微生物群落结构影响的角度，研究菌剂产品和特定菌株对水质的作用效果，以为光合细菌菌剂产品质量评价、作用机理解析等提供数据支持与理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种来源
光合细菌菌剂PG，生产批号为17041012，购自广东省中山市某水产养殖物质产品经销商。该产品为渔用微生态制剂市场的知名品牌产品，其标签主要成分为红螺菌、微量元素、活性酶及促生长因子。沼泽红假单胞菌PSB-1购自广东省微生物菌种保藏中心(菌种编号为GIM1.167)。
1.1.2 菌株的培养
菌株PSB-1采用液体培养基在30 ℃条件下厌氧光照培养。培养基配方为磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0 g·L–1，硫酸镁(MgSO4) 0.5 g·L–1，酵母膏10.0 g·L–1，pH 7.0~7.2。
1.2 实验体系的构建
饲料浸出液的制备[22-23]。将市售的凡纳滨对虾配合饲料 [广东粤海饲料集团，主要营养成分(质量分数)为粗蛋白41%，粗脂肪5%，灰分16%] 烘干、粉碎，取100 g粉碎的饲料，加入1 L纯净水，室温浸泡24 h，制成饲料浸出液原液。
实验水体的制备。取饲料浸出原液，以体积比1∶100加入盐度为10的养殖池塘水中，并加入适量的氯化铵、亚硝酸钠，调节实验水体主要水质指标的初始浓度。经调节后实验水体的初始COD值为10~15 mg·L–1，氨氮(
${\rm NH}_4^+$ -N)和亚硝氮(${\rm NO}_2^-$ -N)质量浓度为1~3 mg·L–1，活性磷(${\rm PO}_4^{3-}$ -P)为1~2 mg·L–1，以上指标均在养殖池塘水质指标的变动范围内[24-25]，且易于反映其作用效果。实验水体配制好后，分装600 mL至1 L三角烧瓶，121 ℃ 灭菌15~20 min。灭菌后的实验水体备用。1.3 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用
1.3.1 菌剂PG对实验水体氮磷营养盐的作用效果
实验设置PG-4组、PG-6组和对照组。PG-4组和PG-6组分别以初始菌量104 个·mL–1和106 个·mL–1将菌剂PG添加到实验水体中；对照组不加菌，加入相同体积的生理盐水。每组各设置3个平行。
1.3.2 菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用效果
实验设置PSB-1-4组、PSB-1-6组和对照组。PSB-1-4组和PSB-1-6组分别以初始菌量104 个·mL–1和106 个·mL–1将菌株PSB-1添加到实验水体中；对照组不加菌，加入相同体积的生理盐水。每组各设置3个平行。
1.3.3 水质指标的测定
将各组28 ℃振荡培养7 d，于实验的第0、第3、第7天取样检测水体中氨氮、亚硝氮、硝氮和活性磷的含量，分析菌剂PG和菌株PSB-1对水质因子的作用效果。实验水体中
${\rm NH}_4^+$ -N、${\rm NO}_2^-$ -N、${\rm NO}_3^-$ -N和${\rm PO}_4^{3-}$ -P的检测依照国家标准GB17378.4—2007，分别采用靛酚蓝分光光度法、盐酸萘乙二胺分光光度法、锌镉还原法和磷钼蓝分光光度法进行测定。1.4 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体微生物群落的影响
1.4.1 菌剂PG优势菌组成分析
取菌剂PG的菌液100 mL，将菌液摇匀经0.2 μm滤膜(Millipore，美国)过滤。采用水体微生物DNA提取试剂盒(OMEGA，美国)提取菌剂样品的细菌总DNA，待DNA样品检测合格后，送至深圳华大基因科技服务有限公司，以引物515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')特异性扩增16S V4可变区，构建扩增文库，通过比对Sliva数据库，分析菌剂PG的优势菌组成。
1.4.2 实验结束时水体细菌数量和微生物群落结构分析
1)水体细菌数量分析。实验结束时(第7天)，用无菌的吸管吸取合适稀释度摇匀的菌液，使用血球计数板计数水体的细菌数量，采用营养琼脂培养基平板涂布计数法测定水体异养细菌数量，30 ℃恒温培养48 h后计数。
2)水体微生物群落结构分析。实验结束时(第7天)，取各实验组(PG-4组、PG-6组、PSB-1-4组和PSB-1-6组)的水体样品100 mL，经0.2 μm的滤膜(Millipore，美国)过滤。采用水体微生物DNA提取试剂盒(OMEGA，美国)提取水体样品的细菌总DNA，待DNA样品检测合格后，送至深圳华大基因科技服务有限公司，以引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')特异性扩增16S V4可变区，构建扩增文库，通过比对Sliva数据库，分析各实验组水体的微生物群落组成。每组各检测3个平行样品，其编号分别为PG-4-1、PG-4-2、PG-4-3、PG-6-1、PG-6-2、PG-6-3、PSB-1-4-1、PSB-1-4-2、PSB-1-4-3、PSB-1-6-1、PSB-1-6-2、PSB-1-6-3，共计12个样品。
1.5 数据分析
各水质指标降解率的计算公式为：降解率R=(初始浓度C0–实验后的浓度Ct)/初始浓度C0×100%。利用SPSS 20.0软件以单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较各组数据的差异显著性，显著水平设定为P<0.05。
2. 结果
2.1 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用
2.1.1 菌剂PG对实验水体氮磷营养盐的作用分析
不同初始浓度的菌剂组在实验第3和第7天的水体
${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 质量浓度呈现先降低后升高的趋势(图1-a)。PG-4和PG-6组在实验第3天对实验水体的NH3-N表现出降解作用，但其降解率与对照组无显著差异(P>0.05，表1)。![]()
图 1 菌剂PG各组实验水体中氨氮 (a)、亚硝氮 (b)、硝氮 (c)和活性磷 (d) 质量浓度变化Figure 1. Changes of${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ (a),${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ (b),${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ (c) and${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ (d) contents in experimental water of PG groups表 1 菌剂PG各组对水质因子的降解率 (平均值±标准差)Table 1. Degradation rate of various water quality indicators in each PG group ($ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}} \pm {\bf SD}$ )被测物
analyte时间
time组别 group 对照 control PG-4 PG-6 氨氮 ${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 第3天 24.07±9.51a 20.96±4.33a 29.90±4.57a 第7天 15.22±3.09a –18.35±5.94b 7.01±1.52c 亚硝氮 ${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –1.40±0.62a 8.64±1.67b 7.86±4.88b 第7天 2.54±0.95a 20.12±1.25b 15.92±11.39b 硝氮 ${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –15.41±0.78a – 67.41±24.95b –17.98±15.67a 第7天 –10.46±9.34a 28.28±4.80b 15.27±18.81b 活性磷 ${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 第3天 –17.57±3.55a 6.64±0.00b 40.98±1.36c 第7天 –18.46±3.33a 25.48±9.14b 22.18±7.50b 注：同行数据不同上标字母表示差异显著(P<0.05)，表2同此
Note: The data within the same row with different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Tab.2.不同初始浓度的菌剂组水体
${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 质量浓度在实验第3和第7天均有所降低(图1-b)。第7天，PG-4和PG-6组对${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 的降解作用较明显，其降解率分别为20.12%和15.92%，显著高于对照组(P<0.05)，两组间无显著性差异(P>0.05，表1)。在实验第3和第7天的水体
${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 质量浓度呈先升高后降低的趋势(图1-c)。第7天，PG-4和PG-6组对${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 的降解率分别为28.28%和15.27%，显著高于对照组(P<0.05)，两组间无显著性差异(P>0.05，表1)。PG-4组水体中
${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 质量浓度在实验第3和第7天均有所降低(图1-d)。第3天，PG-6组对${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 的降解率达40.98%，显著高于PG-4组和对照组(P<0.05)；第7天，PG-4和PG-6组对${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 的降解率分别为25.48%和22.18%，显著高于对照组(P<0.05)，两组间无显著性差异(P>0.05，表1)。2.1.2 菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用分析
PSB-1组对水体
${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 未表现出降解效果(图2-a)。PSB-1-4组水体中${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 质量浓度上升；PSB-1-6组水体中${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 质量浓度呈现先上升后下降的趋势。![]()
图 2 菌株PSB-1各组实验水体中氨氮 (a)、亚硝氮 (b)、硝氮 (c)和活性磷 (d) 质量浓度变化Figure 2. Change of${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ (a),${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ (b),${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ (c) and${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P} $ (d) contents in experimental water of strain PSB-1 groups不同初始浓度的PSB-1组对水体
${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 呈现一定的降解效果(图2-b)。第7天，PSB-1-4和PSB-1-6组对${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 的降解率分别为14.19%和13.79%，显著高于对照组(P<0.05)，两组间无显著性差异(P>0.05，表2)。表 2 菌株PSB-1各组对各水质指标的降解率 (平均值±标准差)Table 2. Degradation rate of various water quality indicators in each strain PSB-1 group ($ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}} \pm {\bf SD}$ )被测物
analyte时间
time组别 group 对照 control PSB-1-4 PSB-1-6 氨氮 ${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 第3天 24.07±9.51a –53.43±13.24b –87.00±16.33c 第7天 15.22±3.09a –78.22±25.20b –30.65±2.65c 亚硝氮 ${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –1.40±0.62a 4.14±2.71b 6.99±1.04b 第7天 2.54±0.95a 14.19±4.18b 13.79±1.38b 硝氮 ${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –15.41±0.78a –30.70±4.00b –41.63±6.21c 第7天 –10.46±9.34a –26.14±5.28b –7.11±1.77a 活性磷 ${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 第3天 –17.57±3.55a 9.88±0.50b 1.59±0.48c 第7天 –18.46±3.33a 5.69±1.61b –0.28±2.17c 水体
${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 质量浓度在实验第3和第7天呈现先升高后降低的趋势，PSB-1组对水体${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 未表现出降解效果(图2-c)。不同初始浓度的PSB-1组在实验第3和第7天的水体
${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 质量浓度呈现先降低后升高的趋势(图2-d)。PSB-1-4组在第3天对${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的降解率为9.88%，第7天为5.69%，均显著高于对照组(P<0.05)，而PSB-1-6组对${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 未表现出降解作用(表2)。2.2 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体微生物群落的影响
2.2.1 光合细菌菌剂优势菌组成分析
通过高通量测序分析，得到了菌剂PG在门、纲、目、科、属5个分类阶层的优势菌组成(图3)。结果发现，该光合细菌菌剂为包含多菌种的复合菌剂，其主要优势菌为变形菌门、α-变形菌纲、根瘤菌目、慢生根瘤菌科的红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)菌株[26]，在属水平上其相对丰度达50.58%；其次为变形菌门、δ-变形菌纲、脱硫弧菌目、脱硫弧菌科的脱硫弧菌属(Desulfovibrio)，该菌株在属水平的相对丰度为10.45%。
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图 3 光合细菌菌剂PG在门 (a)、纲 (b)、目 (c)、科 (d)、属 (e)水平上的优势菌组成分析Figure 3. Analysis of dominant bacteria of inoculant of photosynthetic bacteria PG in terms of Phylum (a),Class (b), Order (c), Family (d) and Genus (e)2.2.2 实验结束时水体细菌数量和微生物群落结构分析
1)水体细菌数量分析。通过显微镜计数法得到了实验第7天PG-4、PG-6、PSB-1-4和PSB-1-6组的实验水体总菌量分别为1.46×108个·mL–1、1.53×108个·mL–1、1.74×107个·mL–1和7.03×107个·mL–1，通过营养琼脂平板计数得到其实验水体异养细菌数量分别为1.44×108 CFU·mL–1、1.45×108 CFU·mL–1、1.69×107 CFU·mL–1和6.58×107 CFU·mL–1(图4)。
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图 5 实验水体中微生物群落门 (a)、纲 (b)、目 (c)、科 (d)、属 (e) 水平上的相对丰度每个实验组3个平行：PG-4-1为PG-4组平行1；PG-6-1为PG-6组平行1；PSB-1-4-1为PSB-1-4组平行1；PSB-1-6-1为PSB-1-6组平行1，以此类推Figure 5. Relative abundance of microbial community in experimental water in terms of Phylum (a), Class (b), Order (c), Family (d) and Genus (e)Three parallels in each experimental group: PG-4-1 is parallel 1 to PG-4 group; PG-6-1 is parallel 1 to PG-6 group; PSB-1-4-1 is parallel 1 to PSB-1-4 group 1; PSB-1-6-1 is parallel 1 to PSB-1-6 group, and so on.![]()
图 4 实验第7天各实验组水体细菌数量Figure 4. Number of bacteria in water of each experimental group on 7th day of experiment2)水体微生物群落结构分析。利用高通量测序分析得到了实验第7天PG-4、PG-6、PSB-1-4和PSB-1-6组的水体微生物群落在门、纲、目、科、属5个分类阶层优势菌的结构组成(图5)。结果显示，PG-4 (PG-4-1、PG-4-2、PG-4-3)和PG-6组(PG-6-1、PG-6-2、PG-6-3)在实验结束时水体中菌群结构较为相似，其主要优势菌为变形菌门、γ-变型菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属(Pseudomonas)菌株，其在属水平上的平均相对丰度分别为53.46%和61.84%；PSB-1-4 (PSB-1-4-1、PSB-1-4-2、PSB-1-4-3)和PSB-1-6组(PSB-1-6-1、PSB-1-6-2、PSB-1-6-3)在实验结束时水体微生物群落在门、纲、目分类水平下的菌群结构较为相似，该分类水平下主要优势菌分别为厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目，但在科和属的分类水平下PSB-1-4组的优势菌为芽孢杆菌科的芽孢杆菌属(Bacillus)，在属水平上的平均相对丰度为46.95%，而PSB-1-6组在科和属分类水平下的优势菌分别为类芽孢杆菌科、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)，在属水平上的平均相对丰度为66.19% (图5)。
3. 讨论
在集约化养殖生产中，由于养殖生物排泄物、浮游生物尸体残骸的累积，加之大量投喂高蛋白的人工饲料、有机肥料等使养殖水体中富含有机质，有机质经分解后形成氨氮、亚硝氮、硝氮、磷酸盐和硫化氢等。光合细菌能在厌氧条件下利用体内的胞外蛋白酶和亚硝酸盐还原酶分解水体中的氨氮、亚硝氮等物质，从而改善和净化水质[27]。从本研究的结果来看，光合细菌菌剂PG组在实验第3天对水体
$ {\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的最大降解率为40.98%，而在实验第7天对水体${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 和${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 最大降解率分别为28.28%和20.12%。菌剂PG的降解效果与刘洋等[28]所报道光合细菌菌株对$ {\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 和${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 的降解能力相似。刘洋等[28]从市售的光合细菌菌液中分离出2株光合细菌GHJ-1和GHJ-2，用5 g·L–1菌株投放量在非灭菌状态下处理养殖污水。2个菌株从第6天开始对${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 、${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 和${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 表现出较明显的降解效果，对${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 的降解率分别为35.1%和45.7%，对${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 的降解率分别为13.5%和18.7%，对$ {\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 的降解率为25.8%和33.3%。本研究中PG-6组除第3天对${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的降解率显著高于PG-4组外(P<0.05)，两实验组的降解效果无显著差异。秦宇胜等[29]研究认为影响菌株对氮磷的降解能力的因素很多，菌剂的投加量主要影响细菌进入分裂期的时间，可能对菌剂利用氮磷的速率影响不大。菌剂PG与董艳珍等[30]所报道的光合细菌菌株的降解能力存在一定差距。董艳珍等[30]从养殖池塘底泥中分离获得的光合细菌在非灭菌状态下处理养殖池塘肥水，实验第8天对${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 和${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 的降解率可达74.8%和57.3%。菌剂PG组对实验水体水质因子的降解效果与已有报道存在差别的原因之一，是不同研究在采用的作用效果评价体系、施用菌量等方面存在差别，刘洋等[28]和董艳珍等[30]的研究是在非灭菌状态、高初始菌量的光照系统中进行，而本研究是以配制的养殖水在有氧自然光照条件下对菌剂产品和菌株的自身特性予以评价。从本研究细菌数量和高通量测序的结果来看，实验7 d后水体细菌数量增长至108 个·mL–1，且主要为异养细菌，水体微生物群落变为以变形菌门、γ-变型菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属菌株为主要优势菌，其在属水平上的相对丰度为53.46%~61.84%。由此可见，该系统下菌剂产品PG对水质因子的作用效果在实验前期为以红假单胞菌属为主要优势菌的复合菌群共同作用所致，而随着实验的进行，水体形成以异养细菌为主的菌群结构。这可能是本研究结果与已有报道存在差别的另一原因。渔用光合细菌菌剂的细菌种类主要有红假单胞菌属[31-32]、红螺菌属[33]、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)等[34]，其中最常用的为沼泽红假单胞菌[17-18]。本研究从菌株保藏中心购买的菌株沼泽红假单胞菌PSB-1组在实验第7天对水体的
${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 最大降解率为14.19%，而在实验第3天对水体$ {\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的最大降解率仅为9.88%。该菌株对主要水质因子的降解效果与Zhang等[35]和杨莺莺等[36]所报道的沼泽红假单胞菌的降解能力也存在差距。Zhang等[35]认为沼泽红假单胞菌能降低养殖水中${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N} $ 和${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 的质量浓度，实验第15天实验组的${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 质量浓度较对照组降低了94.90%，第12天实验组的$ {\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 质量浓度较对照组降低了29.81%。杨莺莺等[36]研究发现沼泽红假单胞菌PS1具有降解养殖废水中${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 、${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 和${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的功能，当温度为26 ℃时实验第4天PS1对其降解率分别为96.48%、73.84%和64.10%。由此可见，不同菌株之间的作用效果及起效时间等均存在差距。从本研究细菌数量和高通量测序的结果来看，实验7 d后水体细菌数量增长至107 个·mL–1，且主要为异养细菌，PSB-1-4组实验水体优势菌变为芽孢杆菌属，PSB-1-6组实验水体优势菌变为短芽孢杆菌属。水体微生物群落的改变导致其对水质因子作用效果的差异。沼泽红假单胞菌可通过体内的脱氮酶系、亚硝酸盐还原酶的作用降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质[19-20]，从而实现净化水质的作用。而不同光照、氧气、pH、盐度、温度和初始施菌量等都会对沼泽红假单胞菌的生长及其对有害氮素的去除效果产生影响[20,36]。此外，即使有研究报道证实沼泽红假单胞菌具有较强的水质净化功能，由于其在不同株系间的功能存在差别，也可能致使水质净化效果存在差异[37-38]。此外，还值得注意的是沼泽红假单胞菌的分类地位问题。根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》，基于菌株自身的生理生态特征，沼泽红假单胞菌属于光能自养细菌中红螺菌目、红螺菌科的红假单胞菌属[16]；而基于分子生态的高通量测序比对结果，沼泽红假单胞菌属于变形菌门、α-变形菌纲、根瘤菌目、慢生根瘤菌科的红假单胞菌属[26]。笔者认为在水产微生物制剂的功能菌株筛选及其产品研发方面，应更多关注菌株自身生理生态特性和功能。
综上，为保证菌剂产品的功能特性，应分离筛选适用于养殖池塘环境的高效光合细菌菌株，并定期更新用于菌剂生产的菌株，确保菌种种质资源的丰富和稳定；在后续对渔用光合细菌菌剂和光合细菌菌株的分析和评价中，不仅应分析菌剂和菌株对水质因子的作用效果，还应关注光合细菌菌株的生长特性及其对养殖水体中微生物群落、浮游植物的影响，以期通过系列研究，为建立健全光合细菌菌剂的产品评价体系提供科学依据。
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图 1 重组质粒pEGFP-ORF65在CCB-J细胞中的表达
CCB-J转染细胞明场观察(a)和CCB-J转染细胞荧光观察(b)；箭头表示部分表达融合蛋白的细胞
Figure 1. Expression of pEGFP-ORF65 fusion protein in CCB-J
Bright field image (a) and fluorescent image (b) of pEGFP-ORF65 transfected CCB-J cells; arrows indicate parts of transfected cells.
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图 2 重组质粒pEGFP-ORF65在建鲤尾柄中的表达
建鲤尾柄的荧光观察(a)和建鲤尾柄的明场与荧光叠加图片(b)；方框示不同实验组尾柄肌肉的绿色荧光蛋白表达情况(纵坐标示光密度值)；箭头示未去除的皮肤及黏液反射激发光造成的非特异性反光
Figure 2. Expression of pEGFP-ORF65 fusion protein in caudal peduncle
Fluorescent image (a) and merged image (b) of caudal peduncle after the intramuscular injections of PBS, pEGFP-N1 and pEGFP-ORF65; the box indicates the fluorescence from the caudal peduncle muscle tissue; the arrows indicate the non-specific reflected fluorescence caused by the skin and mucus.
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图 3 建鲤血清抗CyHV-3 pORF65特异性抗体水平检测
“*”或“**”表示显著性差异P<0.05或P<0.01；“ns”表示无显著性差异
Figure 3. Detection of anti-CyHV-3 pORF65 antibody in Jian carp serum after immunization of PBS, pEGFP-N1, pEGFP-ORF65
The asterisks or double asterisks indicate significant difference at P<0.05 or P<0.01, respectively. "ns" indicates no significant difference.
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图 4 CyHV-3攻毒后的免疫建鲤成活率曲线
Figure 4. Survival of Jian carps immunized with PBS, pEGFP-N1 and pEGFP-ORF65 post CyHV-3 infection
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