斜带石斑鱼对实用饲料中维生素D3的需求量

谢诗玮, 田丽霞, 刘永坚, 张海涛, 牛津, 梁键钧, 方蔚平, 苏积财

谢诗玮, 田丽霞, 刘永坚, 张海涛, 牛津, 梁键钧, 方蔚平, 苏积财. 斜带石斑鱼对实用饲料中维生素D3的需求量[J]. 南方水产科学, 2019, 15(4): 61-67. DOI: 10.12131/20190029
引用本文: 谢诗玮, 田丽霞, 刘永坚, 张海涛, 牛津, 梁键钧, 方蔚平, 苏积财. 斜带石斑鱼对实用饲料中维生素D3的需求量[J]. 南方水产科学, 2019, 15(4): 61-67. DOI: 10.12131/20190029
XIE Shiwei, TIAN Lixia, LIU Yongjian, ZHANG Haitao, NIU Jin, LIANG Jianjun, FANG Weiping, SU Jicai. Vitamin D3 requirement of grouper (Epinephelus coioides) in practical diet[J]. South China Fisheries Science, 2019, 15(4): 61-67. DOI: 10.12131/20190029
Citation: XIE Shiwei, TIAN Lixia, LIU Yongjian, ZHANG Haitao, NIU Jin, LIANG Jianjun, FANG Weiping, SU Jicai. Vitamin D3 requirement of grouper (Epinephelus coioides) in practical diet[J]. South China Fisheries Science, 2019, 15(4): 61-67. DOI: 10.12131/20190029

斜带石斑鱼对实用饲料中维生素D3的需求量

基金项目: 湛江市科技计划项目(2016A02004);国家自然科学基金面上项目(31672665)
详细信息
    作者简介:

    谢诗玮(1989—),男,博士研究生,从事水生动物营养与饲料研究。E-mail: xswzsdx@163.com

    通讯作者:

    刘永坚(1956—),男,教授,从事水生动物营养与饲料研究。E-mail: edls@mail.sysu.edu.cn

  • 中图分类号: S 963.71

Vitamin D3 requirement of grouper (Epinephelus coioides) in practical diet

  • 摘要:

    实验设计了6个不同维生素D3水平(0,1 000 IU·kg−1,2 000 IU·kg−1,4 000 IU·kg−1,8 000 IU·kg−1,100 000 IU·kg−1)的等氮等能饲料(组1、组2、组3、组4、组5和组6)来研究斜带石斑鱼对维生素D3的需求量。结果显示,摄食组3饲料的斜带石斑鱼增重率、特定生长率以及饲料效率显著高于其他组(P<0.05)。不同水平的维生素D3不影响石斑鱼的肥满度和肝体比,添加量大于2 000 IU·kg−1时,石斑鱼肠系膜脂肪和脏体比随着维生素D3水平的升高而降低(P<0.05)。鱼体肌肉和全鱼中蛋白含量随着维生素D3水平的升高而降低,粗脂肪含量各组之间没有显著性差异。维生素D3添加量低于2 000 IU·kg−1时,石斑鱼骨骼中钙(Ca)、磷(P)含量与维生素D3的添加量呈正相关。以增重率以及骨骼Ca、P含量为指标,斜带石斑鱼幼鱼实用饲料中维生素D3的适宜添加量为2 000 IU·kg−1

    Abstract:

    Six isonitrogenous and isoenergetic diets supplemented with different levels of vitamin D3 (0, 1 000 IU·kg−1, 2 000 IU·kg−1, 4 000 IU·kg−1, 8 000 IU·kg−1, 100 000 IU·kg−1) were formulated to evaluate the requirement of vitamin D3 to Epinephelus coioides, namely Diet 1, Diet 2, Diet 3, Diet 4, Diet 5 and Diet 6. Diet 3 obtained higher weight gain rate, specific growth rate and feed efficiency than the other groups (P<0.05). With dietary supplemental vitamin D3 higher than 2 000 IU·kg−1, the intraperitoneal fat ratio (IPF) and viscerosomatic index (VSI) decreased significantly with increasing dietary vitamin D3 levels (P<0.05). The protein contents in whole body and muscle decreased with increasing dietary vitamin D3 levels (P<0.05), but the lipid and ash contents showed no difference in whole body and muscle among all the groups. When the dietary supplemental vitamin D3 was lower than 2 000 IU·kg−1, the calcium (Ca) and phosphorus (P) contents in fish bone were positively correlated with the vitamin D3 levels. Based on Ca and P contents in bones, the optimal supplementation level of vitamin D3 in practical diet should be 2 000 IU·kg−1.

  • Subfatin作为脂肪因子,是一类由脂肪细胞产生和分泌的具有生物活性的活性肽,在胰岛素敏感性、代谢稳态和免疫反应等多种生理过程中发挥着重要的调节作用[1-2],其作为代谢性疾病的关键生物标志物而备受关注[3]

    Subfatin是2014年被发现的一种新型脂肪因子[4],参与糖脂代谢、胰岛素抵抗、炎症反应和白色脂肪组织褐变等多种生物功能[5-7]。由于其序列与METRN蛋白相似,最初被命名为Meteorin-like[6]。但之后的研究发现,与Meteorin主要分布于大脑中不同,多个组织和器官中均能检测到Subfatin,且其在皮下脂肪中的水平最高[6]。由于在皮下脂肪组织中的高表达特性,将Meteorin-like更名为Subfatin[2,6]。另外,由于Subfatin在免疫等功能中发挥作用,因此也被称为IL-39[8]、IL-41[9]和Cometin[10]。Subfatin水平与长期高脂饮食、糖尿病等因素有关。妊娠期糖尿病患者血液中的Subfatin明显高于正常水平,且母乳中的Subfatin水平高于血液[11]。与健康人群相比,II型糖尿病和糖尿病前期患者血清中的Subfatin含量较低[12];且与瘦型二型糖尿病 (T2DM) 患者相比,肥胖T2DM患者的Subfatin水平更低[13]。即Subfatin水平与肥胖[14]和胰岛素水平[15]呈负相关。研究表明,Subfatin可以通过过氧化物酶体增殖激活受体δ (PPAR-δ) 或AMP活化蛋白激酶(AMPK) 通路影响胰岛素敏感性[6]。在脂多糖 (LPS) 处理的脐静脉内皮细胞中,Subfatin可通过AMPK和PPAR-δ依赖途径改善炎症反应[9]。此外,Subfatin可上调过氧化物酶体增殖激活受体γ辅激活子1α (PGC-1α) 的水平,从而调控白色脂肪组织褐变[4,8]。提高脂肪细胞Subfatin水平后,可以通过减少脂肪生成及过氧化物酶体增殖激活受体γ (PPARγ) 水平抑制其分化[16]。此外,Subfatin水平与血清黏附分子呈负相关,这表明Subfatin可能在内皮功能障碍中也发挥作用[13]

    草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 是中国广泛养殖的淡水鱼类。随着水产养殖业的蓬勃发展,对饲料蛋白质的需求量正急剧攀升,而饲用蛋白质资源的稀缺,导致饲料价格不断上涨,严重影响了养殖效益。碳水化合物和脂质作为自然界中广泛存在的能源物质,不仅价格低廉,还具有节约蛋白质的作用。然而,鱼类对碳水化合物和脂质的利用有限,摄食过量的碳水化合物和脂质会造成鱼体能量过剩、脂质代谢紊乱及免疫力下降,从而导致鱼类脂肪肝等代谢疾病的发生。Subfatin在哺乳动物中葡萄糖和脂质代谢方面的作用已有报道,但其在鱼类中的功能研究尚少。目前Subfatin在草鱼中的研究主要集中在免疫及炎症方面[17-18],在糖、脂代谢方面未见相关报道。本研究以草鱼为动物模型,通过葡萄糖灌喂、饥饿再投喂、诱导脂肪沉积及原代肝细胞实验探究了Subfatin在鱼类糖脂代谢过程中的生理功能。

    本研究于河南师范大学水产实验基地开展,实验用鱼均采购于河南省延津县渔场。在实验前,所有实验草鱼均于室内养殖循环系统暂养2周。具体条件如下:平均水温为(25±1) ℃,氨氮质量浓度 <0.01 mg·L−1,溶解氧质量浓度 >5 mg·L−1,亚硝酸盐质量浓度 ≤0.05 mg·L−1。每天于8:30、12:30、17:30对实验鱼进行饲喂,每天保持12 h∶12 h光暗循环 (8:00—20:00)。

    本研究采用反转录PCR (Reverse transcription PCR, RT-PCR)对草鱼subfatin基因进行分子克隆。用FreeZol Reagent (诺唯赞,中国)提取草鱼脑组织总RNA,根据反转录试剂盒 (艾科瑞,中国) 的操作方法,对草鱼脑组织总RNA进行反转录,合成cDNA。将NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)草鱼转录组数据库中序列与斑马鱼 (Danio rerio)的subfatin (KM655583.1) 序列进行比对,预测得到草鱼subfatin基因序列。根据预测草鱼subfatin基因序列设计克隆引物 (F: ATGCTCTCGCCGTTCTTG, R: TCAGTCTGTGTCCAAATG)。以草鱼脑组织cDNA为模板,通过基因克隆获得草鱼subfatin基因。经过测序后,对基因序列进行分析,信号肽序列分析:Signal-5.0 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);糖基化位点预测分析:YinOYang 1.2 Server (https://services.healthtech.dtu.dk/services/YinOYang);蛋白三级结构预测分析:SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/interactive);序列比对分析:ClustalW2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2);进化树构建:MEGA X软件。

    在组织表达分析实验中,随机选取3尾体质量为200~250 g的健康草鱼,用三卡因甲磺酸盐 (MS-222, 100 mg·L−1) 麻醉后断头处死,解剖后取端脑、中脑、后脑、下丘脑、垂体、鳃、头肾、心脏、肝脏、脾脏、肾脏、前肠、中肠、后脑、脂肪、白肌、红肌各组织样品分别放入无菌、无酶的EP管中,迅速放入液氮速冷。取样结束后,样品放入−80 ℃冰箱中保存,以备总RNA提取。

    灌喂葡萄糖实验方法参考笔者课题组之前的研究[19],选取72尾体质量为40~50 g的健康草鱼随机分为对照组和处理组。每组3个重复实验桶,每个实验桶12尾实验鱼。配置磷酸缓冲盐溶液 (PBS):称取氯化钠 (NaCl) 8 g、氯化钾 (KCl) 0.2 g、磷酸二氢钾 (KH2PO4) 0.27 g、十二水磷酸氢二钠 (Na2HPO4·12H2O ) 3.58 g溶解于水中,随后定容至1 L。处理组每尾鱼灌喂葡萄糖溶液 (溶剂为PBS),且葡萄糖剂量为1.67 mg·g−1鱼体质量,对照组按照每尾鱼体质量灌喂相应体积的PBS。灌喂后分别于第1、第3和第6小时,分批次将实验鱼用MS-222麻醉后处死,取实验鱼肝脏、前肠、肾脏和脑组织样品,液氮速冻后转入 −80 ℃冰箱,用于提取总RNA。

    选取90尾体质量为80~100 g草鱼随机分为对照组、饥饿组和再投喂组,每组30尾。草鱼商品饲料购自通威 (质量分数,粗蛋白≥28%,粗纤维≤12%,粗脂肪≥5%,粗灰分≤15%)。对照组草鱼以3%的投喂率投喂商品饲料,每天分3次投喂(08:30、12:30和17:30);饥饿组与再投喂组不进行饲料投喂。养殖14 d后对再投喂组进行投喂,投喂6 h后取样。实验结束后,每桶随机选取12尾实验鱼用MS-222麻醉后断头处死,取实验鱼脑、肝脏、前肠和脂肪样品置于无菌无酶EP管中,液氮速冻后转入 −80 ℃冰箱保存,用于提取总RNA。

    为了评估过量营养水平对草鱼subfatin基因表达的影响,开展了食物诱导脂肪沉积实验。选取体质量40~50 g健康草鱼随机分为对照组和诱导组,每组3个重复,每个重复30尾。对照组以体质量的3%投喂率饲喂商品饲料,诱导组每天饱食饲喂3次 (08:30、12:30和17:30)以诱导脂肪沉积。每2周记录体质量,并根据体质量调整对照组投喂量。饲喂实验6周后,用MS-222对实验鱼进行麻醉,每桶随机选取12尾鱼,解剖后迅速取出脑、前肠、脂肪和肝脏样品,液氮速冻后转入 −80 ℃冰箱保存,用于提取总RNA。

    采用胶原酶IV (Cls IV,Gibco,英国) 和脱氧核糖核酸酶 (DNase II,Gibco,英国) 消化法分离草鱼肝细胞,分离方法参照文献[19-20]。将分离的肝细胞以每孔8×105个细胞的密度种于聚乙烯亚胺 (PEI) 包被的24孔细胞培养板中,过夜培养后更换为无血清细胞培养基 (Gibco,英国),参照笔者课题组之前的研究方法[20-21]对细胞分别进行以下处理:1) 草鱼原代肝细胞分别用含有葡萄糖 (终物质的量浓度为35 mmol·L−1) 的培养基和含有油酸 (终质量浓度为80 μg·mL−1) 的培养基分别培养12和24 h;2) 草鱼原代肝细胞分别用终物质的量浓度分别为10、100和1000 nmol·L−1的胰岛素 (CYT-614,ProSpec-Tany TechnoGene Company,以色列) 和胰高血糖素 (HOR-237,ProSpecTany TechnoGene Company,以色列) 的培养基分别培养3和6 h。细胞培养结束后用RNAiso Plus提取细胞总RNA。

    用RNAiso Plus提取所有实验样品总RNA,测定总RNA浓度后,按照反转录试剂盒 (PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser, TaKaRa,日本) 的操作方法进行反转录。设计并合成subfatin定量引物 (F: GTGTATCTCCGCTGTGCC, R: CTGGACTCCTTAGAGGGTTT)。在荧光定量PCR仪(LightCycler 480 II)上进行荧光定量PCR反应,反应体系为:2×SYBR Green (GDSBio,中国) 5 μL,正反向引物各0.5 μL,模板1 μL,ddH2O 3 μL。反应程序为:95 ℃预变性3 min;95 ℃ 15 s,56 ℃ 15 s,72 ℃ 30 s,40个循环。以草鱼的18S rRNA (F: ATTTCCGACACGGAGAGG, R: CATGGGTTTAGGATACGCTC) 为内参基因,subfatin基因相对表达量用2−ΔΔCT方法进行计算。

    实验数据用SPSS 24.0软件进行单因素方差分析,结果用“平均值±标准误 ($\bar x \pm s_{\bar x}$)”表示,葡萄糖灌喂、诱导脂肪沉积、葡萄糖和油酸孵育实验结果用t检验进行显著性差异分析,饥饿再投喂、胰岛素和胰高血糖素孵育实验结果用ANOVA中的Duncan’s的统计方法进行显著性差异分析,p<0.05具有显著性差异。

    通过分子克隆得到草鱼subfatin基因全长为861 bp,编码286个氨基酸,其中前21个氨基酸为信号肽序列。经过序列分析发现,草鱼Subfatin蛋白中存在3个O-连接的糖基化位点,分别为Ser160、Ser217和Thr226 (图1-a)。三维结构预测分析发现,本研究中的草鱼Subfatin与斑马鱼 (Danio rerio) METRL蛋白的三维结构 (Q7ZV46.1.A) 相似性为94.41% (图1-b)。序列比对结果发现,草鱼Subfatin蛋白与鱼类Subfatin蛋白的同源性超70% (表1)。进化树分析发现,草鱼subfatin基因与鱼类subfatin基因聚为一簇,与斑马鱼subfatin基因聚为一支 (图2)。组织表达分析结果表明,草鱼subfatin基因在各个组织中均有表达,但在肾脏、脑区、鳃及肠道组织中的表达量相对较高 (图3)。

    图  1  草鱼Subfatin cDNA和氨基酸序列 (a) 和草鱼Subfatin三维结构预测 (b)
    注:图中单下划线表示信号肽;方框为O-连接糖基化位点;星号表示终止密码子。
    Figure  1.  cDNA and deduced amino acids (a) and predicted three-dimensional structure (b) of grass carp subfatin
    Note: The single underlines represent signal peptide; boxes represent the O-linked glycosylation sites; the asterisk represents the stop codon.
    表  1  草鱼Subfatin与其他物种的同源性分析
    Table  1.  Identity analysis of grass carp Subfatin compared with other species
    物种 Species     同源性 Identity
    草鱼
    Ctenopharyngodon idella
    100%
    银鲑
    Oncorhynchus kisutch
    77.54%
    XM_031822203.1
    剑尾鱼
    Xiphophorus hellerii
    76.49%
    XM_032587853.1
    大刺鳅
    Mastacembelus armatus
    75.27%
    XM_026325842.2
    大西洋鳕
    Gadus morhua
    74.83%
    XM_030350146.1
    橙喉镖鲈
    Etheostoma spectabile
    74.48%
    XM_032537892.1
    红鳍东方鲀
    Akifugu rubripes
    72.63%
    XM_003964696.3
    智人
    Homo sapiens
    56.49%
    NM_001004431.3
    大鼠
    Rattus norvegicus
    54.74%
    NM_001014104.1
    小鼠
    Mus musculus
    54.04%
    NM_144797.3
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    图  2  草鱼与其他物种Subfatin氨基酸进化树分析
    Figure  2.  Phylogenetic tree based on amino acid alignment for Subfatin in different species
    图  3  定量PCR检测subfatin在草鱼各组织中的表达水平
    注:1. 端脑;2. 中脑;3. 后脑;4. 下丘脑;5. 垂体;6. 鳃;7. 头肾;8. 心脏;9. 肝脏;10. 脾脏;11. 肾脏;12. 前肠;13. 中肠;14. 后肠;15. 脂肪;16. 白肌;17. 红肌。
    Figure  3.  Analysis of expression levels of subfatin in different tissues of grass carp by real-time PCR
    Note: 1. Telencephalon; 2. Mesencephalon; 3. Cerebellum; 4. Hypothalamus; 5. Pituitary; 6. Gill; 7. Head kidney; 8. Heart; 9. Liver; 10. Spleen; 11. Kidney; 12. Foregut; 13. Midgut; 14. Hindgut; 15. Fat; 16. White muscle; 17. Red muscle.

    图4所示,葡萄糖处理1和3 h后,草鱼肝脏和前肠subfatin mRNA表达量与对照组相比显著增加 (p<0.05);葡萄糖处理3 h后,脑和肾脏中subfatin mRNA表达量均显著增加 (p<0.05);而葡萄糖处理6 h后,与对照组相比各组织中subfatin基因表达量无显著性变化 (p>0.05)。

    图  4  葡萄糖灌喂对草鱼肝脏、前肠、脑 和肾脏中subfatin基因表达的影响
    注:*. p<0.05;**. p<0.01;***. p<0.001。
    Figure  4.  Effects of OGTT on mRNA expressions of subfatin in liver, foregut, brain and kidney
    Note: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.

    图5所示,在饥饿再投喂实验中,草鱼饥饿处理14 d后,与对照组相比,脑、脂肪、前肠和肝脏组织subfatin基因表达量均显著降低 (p<0.05);饥饿再投喂后,脑、脂肪和前肠组织subfatin mRNA表达量与饥饿组相比显著增加 (p<0.05);而肝脏组织中subfatin mRNA表达量与饥饿组和对照组相比显著增加 (p<0.05)。如图6所示,诱导脂肪沉积实验表明,与对照组相比,诱导组草鱼脑、脂肪、前肠和肝脏组织中subfatin mRNA表达量均显著上调 (p<0.05)。

    图  5  饥饿再投喂对草鱼脑、脂肪、前肠和肝脏中subfatin基因表达的影响
    注:不同字母间代表有显著性差异。
    Figure  5.  Effects of fast and refeeding on mRNA expressions of subfatin in brain, fat, foregut and liver
    Note: Different letters represent significant differences.
    图  6  脂肪沉积对草鱼脑、脂肪、前肠和肝脏中subfatin基因表达的影响
    注:*. p<0.05;**. p<0.01;***. p<0.001。
    Figure  6.  Effects of lipid accumulation on mRNA expressions of subfatin in brain, fat, foregut and liver
    Note: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.

    图7所示,葡萄糖、油酸、胰岛素或胰高血糖素处理对草鱼原代肝细胞中subfatin基因表达结果显示,葡萄糖处理12和24 h后subfatin基因的表达量显著增加 (p<0.05);油酸处理24 h可显著促进肝细胞中subfatin基因的表达 (p<0.05);胰岛素处理3和6 h能显著降低肝细胞中subfatin基因的表达 (p<0.05);胰高血糖素处理3和6 h可显著提高肝细胞中subfatin基因的表达 (p<0.05)。

    图  7  葡萄糖、油酸、胰岛素和胰高血糖素对草鱼原代肝细胞中subfatin基因表达的影响
    注:*. p<0.05;**. p<0.01;***. p<0.001。
    Figure  7.  Effects of glucose, oleic acid, insulin and glucagon on subfatin expression in grass carp primary hepatocytes
    Note: *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.

    草鱼对碳水化合物和脂质的利用能力差,且高碳水化合物或高脂饲料会导致其糖代谢紊乱、免疫力下降、疾病高发甚至死亡。因此,深入探讨草鱼的糖、脂代谢机制可为提高草鱼对糖脂代谢的利用提供一定参考。

    Subfatin作为一种新型脂肪因子备受关注。本研究从草鱼中分离得到subfatin基因序列,分析发现草鱼Subfatin 蛋白包含信号肽和3个糖基化位点。同样,在哺乳动物的Subfatin蛋白中存在N端信号肽和糖基化位点[6]。在小鼠 (Mus musculus) Subfatin蛋白的第103位氨基酸处存在N-糖基化位点,并且通过糖苷酶降解实验验证了糖基化位点的存在[8,22]。然而,在人类Subfatin蛋白中却没有糖基化位点,以上结果推测糖基化位点在小鼠Subfatin的功能中不起主要作用[8,22]。糖基化在鱼类Subfatin中的功能还需深入探究。通过三维结构、序列比对和进化树分析发现,草鱼Subfatin与斑马鱼METRL蛋白的三维结构最为相似,与鱼类Subfatin蛋白有较高同源性,并且亲缘关系更近。最初发现Subfatin由脂肪组织和骨骼肌合成并分泌[23]。但后续研究发现,subfatin基因在人类和啮齿动物的多个组织 (如肝、脾、肌肉、心脏、胸腺、前脑、中脑、后脑等) 中均有表达[24]。在对小鼠的研究中发现,Subfatin在小鼠体内广泛存在,且在骨骼肌、心肌、脂肪组织、肾脏、脾脏等组织中水平较高[24]。本研究通过分子克隆成功得到草鱼subfatin基因序列。进一步研究发现subfatin基因在草鱼多个组织中均有表达,在肾脏、脑区、鳃及肠道组织中的表达量相对较高。

    Subfatin在哺乳动物中的相关研究较多,但在鱼类糖脂代谢中的功能研究还未见报道。在本研究的葡萄糖灌喂和葡萄糖孵育原代肝细胞实验中,葡萄糖处理后能够显著增加subfatin基因的表达。笔者课题组前期实验表明给草鱼灌喂葡萄糖后其血糖水平显著升高[19]。同样在对II型糖尿病人的研究中发现,病人血糖水平显著高于对照组,且血清中的Subfatin水平也显著高于对照组[25-27];妊娠期糖尿病患者血清中的Subfatin水平也显著高于对照组[27]。在饥饿再投喂实验中,subfatin基因的表达量在再投喂后显著增加。笔者课题组前期实验表明,饥饿能显著降低血糖水平,再投喂后血糖水平显著增加[20]。上述结果表明,Subfatin的水平受营养物质摄入影响,并与血糖水平呈正相关。但也有研究发现,Subfatin水平与血糖水平呈负相关。例如,糖尿病患者血清Subfatin水平显著低于非糖尿病患者[23,28-29],用Subfatin处理C2C12细胞系发现Subfatin可通过AMPKa2和P38 MAPK通路增加葡萄糖摄取,并调节组蛋白去乙酰化酶5 (HDAC5)与葡萄糖转运蛋白4 (GLUT4)的结合,使血糖水平降低[30]。但Subfatin与血糖水平的具体调控关系及机制仍有待深入探究。

    Subfatin不仅可以促进葡萄糖摄取,改善胰岛素抵抗,还能影响血脂成分及水平、减少脂肪堆积,在脂质代谢过程中也发挥着重要作用[16]。Subfatin可以抑制脂肪细胞分化,使脂肪生成数量减少[16],还可作为肥胖和代谢性综合征的生物标志物[31]。在对小鼠的研究中也发现,高脂饮食可特异性升高其白色脂肪组织中的subfatin基因表达[31]。对肥胖人群的研究表明,肥胖者体内subfatin基因的表达显著高于非肥胖人群[32];在分离的肥胖儿童脂肪细胞中subfatin基因的表达量显著高于体型较瘦的儿童,且其表达量与脂肪细胞直径呈正相关[16]。高脂饮食诱导的肥胖小鼠皮下脂肪组织中subfatin基因的表达量显著增加,而限制饮食组脂肪组织subfatin基因的表达量显著低于正常组[4]。本研究中,诱导脂肪沉积和油酸孵育原代肝细胞能显著增加subfatin基因的表达。笔者课题组的前期研究表明,油酸孵育和诱导脂肪沉积实验均可显著增加脂质蓄积引起的肥胖[21,33]。上述结果表明,Subfatin与细胞脂肪水平呈正相关。

    作为重要的内分泌激素,胰岛素和胰高血糖素在鱼的葡萄糖和脂质代谢中发挥着至关重要的作用。本研究表明,胰岛素处理原代肝细胞能显著抑制subfatin基因的表达。对小鼠的研究表明,脂肪细胞subfatin基因的特异性敲除加剧了高脂肪饮食 (High fat diet, HFD) 诱导的胰岛素抵抗,而脂肪细胞特异性转基因过表达subfatin防止了HFD或瘦素缺失诱导的胰岛素抵抗。脂肪细胞Subfatin与胰岛素敏感性的关系是通过PPARγ途径的局部自分泌或旁分泌作用来调控的[5]subfatin基因的过表达抑制了人脂肪细胞分化,表现为PPARγ和脂肪生成标志物的水平降低[16]。同样,对人类的研究也发现,血清中胰岛素与subfatin基因表达量呈负相关[11,13,15,23]。上述结果表明,胰岛素和Subfatin间呈负调控关系,但具体调控机制有待深入探究。胰高血糖素与Subfatin的调控关系尚未见报道,但本研究发现,胰高血糖素处理原代肝细胞能显著促进subfatin基因表达,推测可能是因胰高血糖素引起细胞中的葡萄糖水平增加从而促进细胞subfatin基因表达,但其调控机制还需进一步探究。

    综上,本研究以草鱼为待试动物,探究了Subfatin在调控草鱼葡萄糖和脂质代谢中的作用。实验结果表明,葡萄糖灌喂能显著增加subfatin基因表达;饥饿再投喂实验发现,饥饿后subfatin基因的表达量显著下调,再投喂后subfatin基因的表达量显著增加;诱导脂肪沉积实验中,subfatin基因的表达量在诱导组显著增加;葡萄糖、油酸和胰高血糖素孵育原代肝细胞均可显著增加细胞中subfatin基因的表达量,而胰岛素却会显著降低细胞中subfatin基因的表达。综上所述,Subfatin在草鱼糖脂代谢过程中起重要的调控作用。

  • 表  1   实验饲料配方

    Table  1   Experimental diet formulation

    成分
    ingredient
    含量/%
    content
    白鱼粉 white fishmeal43
    豆粕 soybean meal20.2
    小麦面筋蛋白 wheat gluten12.5
    玉米淀粉 corn flour10
    酵母粉 yeast powder2
    玉米油 corn oil7
    维生素预混物1 (${\rm V}_{\rm D_3} $-free) vitamin per-mixture2
    矿物盐预混合物2 mineral per-mixture1
    氯化胆碱 (50%) choline chloride0.8
    诱食剂 attractant0.5
    磷酸二氢钙 CaH2PO41
    饲料组成 dietary composition
     粗蛋白 crude protein44.73
     粗脂肪 crude lipid10.01
     粗灰分 ash8.20
     注:1. 维生素预混物 (mg·g−1):肌醇0.30;维生素A 1;维生素E 20;维生素K 2;维生素B1 2.5;核黄素10;维生素B6 2.5;烟酸37.5;泛酸钙25;生物素0.25;叶酸0.75;维生素B12 0.05;纤维素808.25;2. 矿物盐预混物 (mg·g−1):硫酸镁274;柠檬酸铁73.8;碳酰氯2.1;硫酸锰1.1;碘化钾0.34;三氯化铝0.36;硫酸铜0.41;氯化钾207.2;硫酸锌7.04;亚硒酸钠0.03;纤维素433.7  Note: 1. vitamin prmix (mg·g−1): inositol 0.30; VA 1; VE 20; VK 2; ${\rm{V_{\rm{B_1}}}}$ 2.5; riboflavin 10; ${\rm{V_{\rm{B_6}}}}$ 2.5; nicotinic acid 37.5; calcium pantothenate 25; biotin 0.25; folic acid 0.75; ${\rm{V_{\rm{B_{12}}}}}$ 0.05; cellulose 808.25; 2. mineral premix (mg·g−1): MgSO4·7H2O 274; ferric citrate 73.8; CoCl2·6H2O 2.1; MnSO4·H2O 1.1; KI 0.34; AlCl3·6H2O 0.36; CuSO4·5H2O 0.41; KCl 207.2; ZnSO4·7H2O 7.04; Na2SeO3 0.03; cellulose 433.7
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    表  2   石斑鱼生长性能

    Table  2   Growth performance of grouper n=3;$ \overline {\mathit{\boldsymbol{X }}} \pm {\bf SEM}$

    组别
    group No.
    维生素D3水平/IU·kg−1
    ${\rm{V_{\rm{D_3}}}}$ level
    起始质量/g
    IBW
    末质量/g
    FBW
    增重率/%
    WG
    特定生长速率
    SGR
    饲料效率/%
    FE
    成活率/%
    survival
    171018.27±0.2355.76±2.39a205.2±13.4a1.99±0.08a76.72±4.23a97±3
    21 32018.33±0.1555.95±3.56a205.3±21.9a1.99±0.13a87.03±5.75b100
    32 25018.54±0.1067.74±1.08d265.3±4.68c2.31±0.02c100.12±4.83c100
    43 87018.36±0.0162.20±1.63bc238.8±8.68b2.18±0.05b92.17±6.41bc100
    57 56018.26±0.0958.94±0.80ab222.9±5.93ab2.09±0.03ab83.66±6.48ab98±2
    683 00018.47±0.1862.62±0.40c239.6±0.473b2.19±0.02b91.15±1.54bc99±2
     注:在每一列数据中不用的字母脚本表示数据之间有显著性差异 (P<0.05);下表同此
     Note: Values in the same line with different letters were significantly different (P<0.05); the same case in the following tables.
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    表  3   石斑鱼形态数据

    Table  3   Morphometry indices of grouper n=12;$ \overline {\mathit{\boldsymbol{X }}} \pm {\bf SEM}$

    组别
    group No.
    维生素D3水平/IU·kg−1
    ${\rm{V_{\rm{D_3}}}}$ level
    肥满度
    CF
    肝体比
    HSI
    肠系膜系数
    IPF
    脏体比
    VSI
    17102.97±0.191.85±0.213.72±0.41c9.05±0.26b
    21 3202.95±0.081.96±0.183.25±0.34bc8.93±0.89b
    32 2502.86±0.061.93±0.252.96±0.38ab8.81±0.45b
    43 8702.86±0.131.93±0.122.90±0.24ab8.50±0.54ab
    57 5602.79±0.051.60±0.392.74±0.41ab7.58±0.51a
    68 3002.84±0.252.09±0.362.42±0.28a8.02±0.71ab
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    表  4   石斑鱼体组成

    Table  4   Body composition of grouper %,n=3;$ \overline {\mathit{\boldsymbol{X }}} \pm {\bf SEM}$

    项目
    item
    组别 group No.
    123456
    全鱼 whole body
     粗蛋白 crude protein58.89±1.52ab58.81±1.33ab57.03±2.56a58.74±0.83ab56.66±1.52a57.72±1.85b
     粗脂肪 crude lipid23.5±0.7124.2±0.1725.7±1.526.0±1.7124.8±0.8723.9±2.50
     水分 moisture68.08±0.2467.89±0.5768.47±0.7668.17±0.5167.00±1.1768.20±1.13
     灰分 ash17.5±0.2517.1±0.7216.8±0.2817.2±0.5716.7±0.6317.2±0.34
    肌肉 muscle
     粗蛋白 crude protein86.83±1.62a86.81±0.86a86.82±1.02a88.48±1.18a83.82±2.41b82.40±1.44b
     粗脂肪 crude lipid9.1±1.47.9±1.28.5±0.98.4±0.810.2±1.811.2±2.0
     水分 moisture73.10±0.4273.12±0.2073.90±0.3573.09±0.1373.28±0.3374.19±0.20
     灰分 ash7.7±0.187.7±0.37.7±0.177.8±1.037.4±0.47.5±0.7
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    表  5   石斑鱼骨骼中钙、磷含量

    Table  5   Calcium and Phosphorus contents in groupers bones %,n=3;$ \overline {\mathit{\boldsymbol{X }}} \pm {\bf SEM}$

    组别
    group No.
    维生素D3测量值/IU·kg−1
    ${\rm{V_{\rm{D_3}}}}$ measurement
    脊椎中钙含量/%
    calcium content in spine
    脊椎中磷含量/%
    phosphorus content in spine
    171018.2±0.38a8.8±0.16a
    21 32020.2±0.33b10.2±0.43ab
    32 25021.1±0.29c10.3±0.17ab
    43 87021.1±0.05c10.1±1.82ab
    57 56021.0±0.48c9.6±0.26ab
    683 00021.1±0.58c10.5±0.24b
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    表  6   石斑鱼肝脏碱性磷酸酶活性

    Table  6   AKP activity in liver of grouper n=3;$ \overline {\mathit{\boldsymbol{X }}} \pm {\bf SEM}$

    组别
    group No.
    维生素D3/IU·kg−1
    ${\rm{V_{\rm{D_3}}}}$
    碱性磷酸酶活性/U·g−1
    AKP enzyme activity
    171016.43±2.30
    21 32023.13±3.20
    32 25019.13±4.05
    43 87017.63±3.12
    57 56020.29±3.19
    683 00021.52±3.18
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-30
  • 修回日期:  2019-04-09
  • 录用日期:  2019-04-18
  • 网络出版日期:  2019-04-24
  • 刊出日期:  2019-08-04

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