Changes of pigment-related enzyme activity and gene expression at early developmental stage of koi carp
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摘要:
通过显微观察、酶联免疫吸附及荧光定量PCR等方法，探究了红白、红黑锦鲤(Cyprinus carpio var. koi) 子一代 (F1)早期体色发育过程及不同发育时期色素代谢相关酶(酪氨酸酶、胱氨酸酶)的活性和基因(agouti、mc1r、mitf、tyr)的表达变化。结果表明，锦鲤出膜后呈淡黄色半透明，黑色素细胞在出膜8 d后开始出现。胱氨酸酶活性随锦鲤发育呈升高趋势，出膜7 d后显著升高(P<0.05)；7日龄仔鱼前，红黑组与红白组间无显著差异(P>0.05)；出膜7 d后红黑组比同时期红白组显著升高(P<0.05)。酪氨酸酶在锦鲤发育过程中也呈升高趋势，但略有起伏，眼色素积累期及出膜23 d后酪氨酸酶活性均比相邻各期高(P<0.05)；组间比较发现发育各期红黑组均比红白组高(P<0.05)。表明酪氨酸酶、胱氨酸酶活性变化与锦鲤色素细胞发育存在密切关联。agouti、mc1r、mitf及tyr 4个基因均在原肠期与神经胚期时表达最高(P<0.01)，随后均呈下降趋势，表明这4个基因可能在胚胎发育早期的体色形成过程中发挥着重要作用。
Abstract:We investigated the changes of tyrosinase and cystinase activities, as well as the expressions of tyr, mitf, agouti and mc1r mRNAs at the early developmental stage of Kohaku and Hi-Utsuri koi carp (Cyprinus carpio) by using histological observation, enzyme-linked immunoassay and quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction methods. The results show that the hatched carps became light yellow and translucent. The melanocytes occurred on 8 dph (day-post-hatching). The activity of cystinase increased with the koi carp development, and no significant difference was observed between Kohaku and Hi-Utsuri groups before 7 dph (P>0.05), while Hi-Utsuri group showed significantly higher enzyme activity than Kohaku group at the same stages after 7 dph (P<0.05). Tyrosinase activity showed an up-regulation trend with slight fluctuation during the development of koi carp, and peaked at the ocular pigment stage and on 23 dph (P<0.05). The enzyme activity was significantly higher in Hi-Utsuri group than in Kohaku group at each developmental stage (P<0.05), which indicates that tyrosinase and cystinase activities were closely associated with pigment cell development of koi carp. The expressions of agouti, mc1r, mitf and tyr mRNAs peaked in gastrula and blastula periods (P<0.01), then decreased. Thus, agouti, mc1r, mitf and tyr mRNAs might play an important role in the formation of body colors in early embryonic development.
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Keywords:
- koi carp /
- body color /
- tyrosinase /
- cystinase /
- tyr /
- mitf /
- agouti /
- mc1r
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鱼类体色是一类重要的表型性状，与其生存繁殖息息相关，参与拟态、求偶、伪装、环境适应等多种生物学过程，而观赏鱼类斑纹和体色的优劣直接决定了其市场价值[1-2]。鱼类具有多种色素细胞，如红色素细胞、黄色素细胞、虹彩细胞及黑色素细胞等[3]，其丰富多彩的体色是各种色素细胞共同作用的结果[4]。鱼类色素细胞由神经嵴细胞分化形成，研究表明大量基因参与到神经嵴细胞向色素细胞迁移和分化的过程[5]。其中黑素皮质素1受体(mc1r)基因是黑色素合成的关键基因，mc1r基因产物与α-促黑色素细胞激素(α-MSH)结合，启动腺苷酸循环(cAMP)，促进酪氨酸酶(tyr)基因表达，使酪氨酸(Tyr)在酪氨酸酶的催化下形成多巴醌(dopaquinone)。当细胞中的Tyr含量较高时，多巴醌在酪氨酸酶相关蛋白1基因(tyrp1)和相关蛋白2基因(tyrp2，或称多巴素异构酶基因，dct)产物的作用下，合成真黑色素；当细胞中的Tyr含量较低时，多巴醌将与半胱氨酸作用，合成褐黑色素[6]。刺豚鼠信号蛋白(agouti)基因编码的Asip蛋白会与α-MSH竞争性地与mc1r基因产物结合，抑制腺苷酸循环，减少Tyr的生成[6]，此外Asip蛋白抑制黑色素细胞分化，降低小眼畸形相关转录因子(mitf)基因在黑色素细胞中的表达，同时降低Mitf与酪氨酸酶的结合，而mitf基因可调控酪氨酸基因家族的表达，对黑色素细胞的发育、分化具有调控作用[7]，通过这2条途径，当agouti基因表达量较高时，则生物体更多的是合成褐色素细胞[8-9]。
锦鲤(Cyprinus carpio var. koi)，隶属鲤形目、鲤科、鲤属，素有“水中活宝石”之称，因其体色艳丽似锦，斑纹多样，食性杂且易饲养等特征，而倍受人们喜爱。作为一种高档观赏鱼类，锦鲤在其体色鉴赏上已形成一定系统，常见种类包括红白(Kohaku)、大正三色(Tajsho-sanke)、昭和三色(Showa-sanshoku)、写鲤(Utsuri)等，在国内外观赏鱼市场上占有相当重要的份额[10]。近年来，国内外学者就锦鲤体色调控相关的影响因素做了大量探究。如调控锦鲤的生长环境(pH、亚硝酸盐、光照)[11]，饲料中添加着色剂[12-13]，杂交后代体色遗传分离标记筛选[14-15]，色素细胞合成分子机制探究[16-19]等。然而，笔者发现在实际生产中仍采用传统的大批量繁育挑选，并配合着色饲料饲喂等方法，进而改善锦鲤的色泽，基础工作仍相较冗杂。
因此，本研究深入观察了不同体色锦鲤发育早期体色变化的规律；进一步分析了其对应各时期色素代谢相关酶的活性(酪氨酸酶、胱氨酸酶)及基因(agouti，mc1r，mitf，tyr)的表达变化。研究结果为进一步了解并预测锦鲤体色发生过程、体色变异的分子遗传基础，以及进一步培育出遗传性状稳定的锦鲤提供一定的技术和理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
实验用锦鲤取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴屺亭基地，分别挑选性成熟、无外伤、活力强的红白锦鲤(Kohaku)与红黑锦鲤(Hi-Utsuri) (♂∶♀=1∶1)。将1尾红白雌鱼与1尾红白雄鱼注射催产剂后置于水泥池中，记为红白组；红黑锦鲤通过同样操作记为红黑组。每组2个重复。受精后亲鱼捞出，受精卵置于孵化池中流水孵化，养殖过程水温保持在20~23 ℃，pH 6.8~7.5。
1.2 样品采集
定期从每组网片上取40~50粒受精卵，通过OLYMPUS CX31光学显微镜观察并拍照，发育时期划分以所观察胚胎数50%显示的发育特征为准。同时在对应各采样时间点，随机取90~100粒卵(在出膜后的各采样时期称取仔鱼个体150~200 g)，用滤纸吸干水，置于RNA Store保存液中备用。
1.3 检测分析
1.3.1 酶活测定
分别称取不同时期各组锦鲤胚胎、幼鱼或皮肤组织(60 mg)，加1 mL PBS溶液，匀浆后将匀浆液置于4 ℃、10 000 r·min−1离心10 min，取上清液于离心管，置于4 ℃冰箱中待测。酪氨酸酶、胱氨酸酶活性采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附进行测定(Zhen Ke，中国)，具体操作按试剂盒说明进行。
1.3.2 实时荧光定量PCR (qRT-PCR)
样品总RNA按照TRIzol法进行提取，使用核酸蛋白检测仪(OD260∶OD280) (Eppendorf，德国) 测定RNA浓度，并用1%琼脂糖检测RNA质量。荧光定量步骤按照PrimeScriptTM Real-time PCR试剂盒(TaKaRa，日本)说明进行，于CFX96TM Real-time System (Bio-Rad，美国)仪器上操作。根据GenBank中tyr、mitf、agouti、mc1r及β-actin相关序列设计定量引物(表1)。
表 1 实时荧光定量PCR引物Table 1. Primer sequences used in real-time quantitative RT-PCR引物名称
primer核苷酸序列 (5'−3')
sequencetyr F CACGGTCTCCGATCTTCCC tyr R CATCACGCCAGTCCCAGTA mitf F ACAACTCCTGCCCGTCTAAC mitf R CCGTTGTTGAGGTCCAGAGT agouti F AACTGCGTGCCGCTCTTGA agouti R TAAACAAGCCTTTGGGATCGGG mc1r F AGGAATCTCCACTCGCCAA mc1r R GCCCGTGCTCCGTCAATAA β-actin F AGTCAGCAGAGTTGGGTGCT β-actin R CACGGCATCATTACCAACTG 1.4 数据处理
实验结果以“平均值±标准差(
$\overline X \pm {\rm{SD}} $ )”表示。采用SPSS 22.0软件对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，并进行LSD和Duncan's比较，显著水平设为0.05。2. 结果
2.1 锦鲤早期发育体色观察
受精卵至8日龄仔鱼间各时期，红白组锦鲤与红黑组锦鲤之间未发现明显差异。锦鲤胚胎发育共经历了受精、卵裂、囊胚、原肠胚、神经胚、器官形成及孵化出膜7个阶段，整个发育过程约71.5 h。
通过显微观察，受精后46.5 h，锦鲤胚胎眼色素开始积累，视泡颜色逐渐加深成黑色(图1-a)。受精后约71.5 h，仔鱼开始陆续破膜，刚出膜仔鱼鱼体呈淡黄色、半透明，显微镜下明显观察到鱼体背部的黄色素细胞(图1-b)。
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图 1 锦鲤早期发育体色变化a. 眼色素积累期；b. 刚破膜膜仔鱼，黑色箭头示黄色素细胞；c. 8日龄红黑组锦鲤，黑色箭头示黑色素细胞；d. 8日龄红白组锦鲤Figure 1. Change of body color at early developmental stage of koi carpa. eye melanin stage; b. the black arrow indicates the yellow pigment cells that appeared on the back of the newly hatched larvae; c. 8 dph larvae in Hi-Utsuri groups (the black arrow shows melanocytes);d. 8 dph larvae in Kohaku groups出膜后红白组与红黑组仔鱼间未发现明显差别，鱼体背部的黄色素随时间推移进一步增多，并向尾部扩散。直到出膜后第8天，红黑组仔鱼背部开始出现零星的树枝状黑色素细胞，之后开始逐渐增多；而红白组锦鲤并未观察到黑色素细胞(图1-c、1-d)。
出膜后2个月，锦鲤仔鱼的形态与成鱼相似，体色与斑纹分化明显。统计发现，红白组子一代 (F1)性状有3种：全红、全白与红白；红黑组F1代体色分化较为复杂，包括全红、全白、红白、红黑、黑白及三色。取样分析结果显示实验组后代及组间体色分离比例差异较大，未发现明显的传统分离规律(表2、表3)。而将锦鲤黑色斑纹视为一个性状进行统计发现，F1子代中体表具有黑色斑纹个体数与体表无黑色斑纹个体数的比值大致为2∶1 (表4)。
表 2 红白组子一代体色性状分离Table 2. Segregation of body color characteristics of F1 generation in Kohaku group组别 group 全红 red 全白 white 红白 Kohaku 红白A Kohaku A 个体数 463 200 441 百分比/% 41.94 18.1 39.95 红白B Kohaku B 个体数 377 180 652 百分比/% 31.18 14.89 53.93 表 3 红黑组子一代体色性状分离Table 3. Segregation of body color characteristics of F1 generation in Hi-Utsuri group组别 group 全红 red 红黑 Hi-Utsuri 全白 white 红白 Kohaku 三色 Showa 黑白 Shiro-Utsuri 红黑A Hi-Utsuri A 个体数 312 498 2 97 233 13 百分比/% 27.01 43.12 0.17 8.40 20.17 1.13 红黑B Hi-Utsuri B 个体数 96 134 66 218 403 216 百分比/% 8.47 11.83 5.83 19.24 35.57 19.06 表 4 红黑组子一代黑色斑纹分离Table 4. Segregation of black pattern characteristics of F1 generation in Hi-Utsuri group组别
group有黑斑 pigmented 无黑斑 unpigmented 红黑A Hi-Utsuri A 个体数 744 411 比例 1.81∶1 红黑B Hi-Utsuri B 个体数 753 380 比例 1.98∶1 2.2 锦鲤早期发育不同时期胱氨酸酶与酪氨酸酶活性变化
通过对锦鲤子代体色发育的显微观察，选取了9个关键时期：囊胚期、眼色素积累期、出膜期、1日龄、3日龄、7日龄、13日龄、23日龄及43日龄，测量对应时间点酶活性的变化。结果表明，红白组锦鲤自囊胚期至3日龄的发育过程中，胱氨酸酶呈上升趋势，但差异不显著(P>0.05)；发育至7日龄时，活性开始逐步升高，第43天达到峰值(P<0.05)。红黑组锦鲤，囊胚期至3日龄仔鱼阶段，胱氨酸酶活性差异也不显著(P>0.05)；发育至7日龄时，显著高于之前各阶段(P<0.01)，13日龄时略有降低(P<0.05)，之后又升高；发育至43日龄时达到峰值(P<0.05)。组间比较发现，从囊胚期到3日龄仔鱼各期胱氨酸酶活性差异不显著(P>0.05)，至7日龄时，红黑组相较同期红白组显著升高(P<0.05，图2)。
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图 2 红黑组与红白组发育过程中胱氨酸酶活性的变化同一组内不同字母表示不同时期差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，*. 同一时期不同组之间差异显著(P<0.05)，图3同此Figure 2. Change of cystinase activity during embryonic development of Kohaku group and Hi-Utsuri groupDifferent letters in the same group indicate significant difference at different periods (P<0.05); the same letters indicate no significant difference (P>0.05); *. significant difference between different groups in the same period (P<0.05). The same case in Fig.3.酪氨酸酶结果表明，红白组内，囊胚期至1日龄仔鱼阶段，除眼色素积累期时活性显著偏高(P<0.05)，其他各期均较低，且差异不显著(P>0.05)；出膜3 d后，酪氨酸酶活性逐渐升高，并在第23天达峰值(P<0.05)。红黑组内，囊胚期至3日龄仔鱼阶段，同样观察到眼色素积累期时活性最高(P<0.05)，其他各期差异不显著(P>0.05)；出膜后7 d，酪氨酸酶活性持续升高，第23天达到峰值(P<0.05)。组间比较发现，红黑组子代早期各发育阶段酪氨酸酶活性均比同时期红白组高(P<0.05，图3)。
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图 3 红黑组与红白组发育过程中酪氨酸酶活性的变化Figure 3. Chang of tyrosinase activity during embryonic development of Kohaku group and Hi-Utsuri group2.3 锦鲤早期发育不同时期agouti、mc1r、tyr及mitf基因表达
本研究选取了10个关键时期：囊胚期、原肠期、神经胚期、眼基形成期、眼色素积累期、出膜期、1日龄、7日龄、23日龄、43日龄，测量对应时间点agouti、mc1r、tyr及mitf 4个基因的表达量变化。agouti基因在两组锦鲤发育不同阶段均有表达，红白组与红黑组子代锦鲤在早期发育的不同阶段差异均不显著(P>0.05)；而两组在原肠期与神经胚期的表达量显著高于其他时期(P<0.01)，之后降低，出膜23 d与43 d后表达量降至极低且显著低于眼基形成期(P<0.05，图4)。
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图 4 agouti基因在锦鲤不同发育时期表达量不同字母表示差异显著(P<0.05)，后图同此Figure 4. agouti gene expression at different developmental stageDifferent letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.mc1r基因在锦鲤不同时期均有表达，两组子代锦鲤在早期发育的不同阶段差异性均不显著(P>0.05)。原肠期表达量极显著高于其他时期(P<0.01)，神经胚期显著高于另外8个时期(P<0.05)，囊胚期、眼基形成期、眼色素积累期、出膜期、1日龄、7日龄、23日龄与43日龄8个时期表达水平较低，且不存在显著性差异(P>0.05，图5)。
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图 5 mc1r基因在锦鲤不同发育时期表达量Figure 5. mc1r gene expression at different developmental stagemitf基因在每组锦鲤各期亦均有表达，红白组与红黑组子代锦鲤在早期发育的不同阶段差异性均不显著(P>0.05)。两组子代锦鲤在原肠期表达量显著高于其他时期(P<0.01)，神经胚期次之(P<0.05)，之后逐渐降低，并在7日龄、23日龄与43日龄降至极低(P<0.05，图6)。
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图 6 mitf基因在锦鲤不同发育时期表达量Figure 6. mitf gene expression at different developmental stagetyr基因在红白与红黑组早期发育不同阶段无显著性差异(P>0.05)。原肠期时表达水平极显著高于其他各期(P<0.01)，神经胚期次之(P<0.01)，囊胚期与眼色素积累期显著高于眼基形成期、出膜期、1日龄、7日龄、23日龄及43日龄6个时期(P<0.05)；7日龄、23日龄与43日龄间无显著差异(P>0.05)，且显著低于其他各期(P<0.05，图7)。
3. 讨论
3.1 锦鲤早期体色变化观察
红白与红黑组锦鲤，在胚胎发育过程中，其胚胎形态和特征未发现明显差异。受精卵均为沉水粘性卵，胚胎因受卵黄囊影响而呈淡黄色，这与鲤鱼及其他品系锦鲤中描述的结果基本一致[19-22]。田雪等[23]发现，红色锦鲤出膜后，1日龄仔鱼除眼部呈黑色外，身体呈透明，未观察到其他色素细胞形成，而本研究发现红白、红黑组仔鱼出膜后，身体呈淡黄色，显微镜下能观察到仔鱼背部有成片的黄色素细胞，这与张哲等[22]在红白锦鲤出膜仔鱼中所观察的结果一致。8日龄的仔鱼，其背部发现呈树枝状的黑色素细胞，随着时间的推移，黑色素细胞逐渐扩散至其他部位；文胜[24]也发现三色锦鲤出膜后9 d背部开始出现黑色素细胞，后扩散至尾部，这与本研究所观察到的结果基本一致。此外，本研究还发现无论是红色素细胞或黑色素细胞均首先出现在鱼体背部，随后逐渐扩散至鱼体两侧及腹部，证实了锦鲤的色素细胞可能同其他硬骨鱼类色素细胞发育规律相同，均是通过神经嵴细胞向背腹轴进行迁移[25]。
在对发育至二月龄的锦鲤体色统计中，红白组子代的体色有3种：全红、全白与红白；而红黑组子代包含全红、全白、红白、红黑、黑白、三色，子代锦鲤体色的分化比例较为复杂，并且无明显的遗传规律。Gomelsky等[26]做了大量锦鲤黑色斑纹的杂交实验，表明具有黑色斑纹的锦鲤父母之间的杂交导致3∶1的分离(着色∶未着色)，而它们与红白锦鲤的杂交则导致1∶1的分离，从而认为锦鲤中黑斑的发育受一个显性基因(B1)的控制。而本研究发现，体表有黑色斑纹与无黑色斑纹的比例约为2∶1，这与David等[14]的部分研究结果相同，而David等认为控制黑色体色的可能不止有一个显性基因。由此可见锦鲤的体色遗传机制十分复杂，目前对于锦鲤多体色的遗传规律研究尚无定论，仍有待于后续进一步的研究。
3.2 锦鲤早期发育不同阶段胱氨酸酶及酪氨酸酶活性变化
黑色素合成通路是目前国内外体色研究中，最为广泛而深入的通路之一。在鱼类的黑色素合成途径中，酪氨酸由酪氨酸酶经一系列氧化催化形成；当酪氨酸酶具有较高活性时，促使多巴醌形成真黑色素，从而使机体呈现黑色；当酪氨酸酶活性不足时，多巴醌会进一步与胱氨酸、谷胱甘肽等结合，并最终形成褐黑色素，进而使机体呈现黄色或红色[27-29]。
锦鲤早期发育过程中，在显微镜观察下8日龄仔鱼背部开始出现树枝状黑色素细胞，同时胱氨酸酶活性数据表明，红黑组与红白组锦鲤在发育至7日龄之前胱氨酸酶活性无明显差异(P>0.05)；7日龄仔鱼，红黑组胱氨酸酶活性相比红白组显著升高(P<0.05)，推测这是由于此时黑色素开始合成，而胱氨酸参与了褐黑色素合成，进而导致胱氨酸酶活性升高[27]。
锦鲤早期发育不同时期，红黑组酪氨酸酶活性均比红白组高，这可能与红黑组仔鱼需要产生更多的黑色素细胞来维持其黑色斑纹相关。此外，本研究发现，当胚胎发育至眼色素积累期时，红黑组与红白组中酪氨酸酶的活性均开始上升，结合显微镜下对该时期的观察，胚胎眼基颜色开始逐渐加深，推测可能是由于该阶段黑色素细胞开始在胚胎视网膜上积累所造成[30]。
3.3 agouti、mc1r、tyr及mitf基因在锦鲤早期发育不同阶段的表达差异
本研究中，agouti、mc1r、tyr、mitf 4种基因在红白实验组与红黑实验组早期发育过程中的表达量差异均不显著，推测可能是由于8日龄仔鱼之前，红白组与红黑组形态上并无明显差别，黑色素细胞尚未开始形成；而子代出膜8 d后，4种基因的表达量与出膜前相比均达到极低水平，所以难以观察到差异。
无论是红白组还是红黑组，agouti、mc1r、tyr、mitf 4种基因在原肠期与神经胚期的表达量均比其他时期要高，分析可能是由于神经嵴细胞在原肠胚时期开始形成，而鱼类的色素细胞起源于神经嵴细胞[5]，此时色素细胞前体开始大量生成；另外可能与各基因不仅参与了色素细胞的形成与分化，还参与了早期发育过程中其他细胞形成的调控相关[31-34]。其中mitf与tyr基因表达量的趋势大致相同，推测可能是由于mitf基因对tyr基因具有调控作用[7]。出膜后mitf与tyr基因在1日龄阶段表达量较高，之后开始逐渐降低，这与田雪等[23]的研究结果相似，推测是由于色素前体细胞向色素细胞分化所致[32]。同时本研究发现，在红白组与红黑组子代发育至眼色素积累期时，tyr基因的表达量均明显升高；而此时的酪氨酸酶活性也开始升高，推测主要是由于鱼类视网膜色素上皮细胞中含大量的黑色素细胞造成的[30]。
4. 总结
鱼类体色调控机制十分复杂，目前针对鱼类体色调控机制已经开展了大量研究[16-18,35-36]，而对于锦鲤早期发育过程中体色发生机制的研究却鲜有报道[23-24]。本研究揭示了锦鲤早期发育过程中酪氨酸酶、胱氨酸酶的活性变化及agouti、mc1r、mitf、tyr基因的表达规律与体色形成的相关性，而锦鲤的色素细胞合成涉及到其他相关理化因子，因此针对于锦鲤体色早期的发生机制，还有待进一步研究。
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图 1 锦鲤早期发育体色变化
a. 眼色素积累期；b. 刚破膜膜仔鱼，黑色箭头示黄色素细胞；c. 8日龄红黑组锦鲤，黑色箭头示黑色素细胞；d. 8日龄红白组锦鲤
Figure 1. Change of body color at early developmental stage of koi carp
a. eye melanin stage; b. the black arrow indicates the yellow pigment cells that appeared on the back of the newly hatched larvae; c. 8 dph larvae in Hi-Utsuri groups (the black arrow shows melanocytes);d. 8 dph larvae in Kohaku groups
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图 2 红黑组与红白组发育过程中胱氨酸酶活性的变化
同一组内不同字母表示不同时期差异显著(P<0.05)，相同字母表示差异不显著(P>0.05)，*. 同一时期不同组之间差异显著(P<0.05)，图3同此
Figure 2. Change of cystinase activity during embryonic development of Kohaku group and Hi-Utsuri group
Different letters in the same group indicate significant difference at different periods (P<0.05); the same letters indicate no significant difference (P>0.05); *. significant difference between different groups in the same period (P<0.05). The same case in Fig.3.
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图 3 红黑组与红白组发育过程中酪氨酸酶活性的变化
Figure 3. Chang of tyrosinase activity during embryonic development of Kohaku group and Hi-Utsuri group
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图 4 agouti基因在锦鲤不同发育时期表达量
不同字母表示差异显著(P<0.05)，后图同此
Figure 4. agouti gene expression at different developmental stage
Different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.
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图 5 mc1r基因在锦鲤不同发育时期表达量
Figure 5. mc1r gene expression at different developmental stage
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图 6 mitf基因在锦鲤不同发育时期表达量
Figure 6. mitf gene expression at different developmental stage
表 1 实时荧光定量PCR引物
Table 1 Primer sequences used in real-time quantitative RT-PCR
引物名称
primer核苷酸序列 (5'−3')
sequencetyr F CACGGTCTCCGATCTTCCC tyr R CATCACGCCAGTCCCAGTA mitf F ACAACTCCTGCCCGTCTAAC mitf R CCGTTGTTGAGGTCCAGAGT agouti F AACTGCGTGCCGCTCTTGA agouti R TAAACAAGCCTTTGGGATCGGG mc1r F AGGAATCTCCACTCGCCAA mc1r R GCCCGTGCTCCGTCAATAA β-actin F AGTCAGCAGAGTTGGGTGCT β-actin R CACGGCATCATTACCAACTG 
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表 2 红白组子一代体色性状分离
Table 2 Segregation of body color characteristics of F1 generation in Kohaku group
组别 group 全红 red 全白 white 红白 Kohaku 红白A Kohaku A 个体数 463 200 441 百分比/% 41.94 18.1 39.95 红白B Kohaku B 个体数 377 180 652 百分比/% 31.18 14.89 53.93
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表 3 红黑组子一代体色性状分离
Table 3 Segregation of body color characteristics of F1 generation in Hi-Utsuri group
组别 group 全红 red 红黑 Hi-Utsuri 全白 white 红白 Kohaku 三色 Showa 黑白 Shiro-Utsuri 红黑A Hi-Utsuri A 个体数 312 498 2 97 233 13 百分比/% 27.01 43.12 0.17 8.40 20.17 1.13 红黑B Hi-Utsuri B 个体数 96 134 66 218 403 216 百分比/% 8.47 11.83 5.83 19.24 35.57 19.06
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表 4 红黑组子一代黑色斑纹分离
Table 4 Segregation of black pattern characteristics of F1 generation in Hi-Utsuri group
组别
group有黑斑 pigmented 无黑斑 unpigmented 红黑A Hi-Utsuri A 个体数 744 411 比例 1.81∶1 红黑B Hi-Utsuri B 个体数 753 380 比例 1.98∶1
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