Effects of periodic hypoxia stress on intestinal microflora structure of Lateolabrax maculatus
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摘要:
该研究基于Illumina MiSeq高通量测序技术，对周期性缺氧应激下花鲈(Lateolabrax maculatus)肠道菌群结构的变化进行分析，为研究其幼鱼肠道菌群对环境缺氧的适应机制提供参考依据。结果显示，周期性缺氧导致花鲈肠道菌群多样性和丰富度显著增加(P<0.05)，群落结构复杂化，缺氧组和常氧组群落组成存在较大差异。缺氧组肠道菌群分类操作单元相比常氧组显著增加(P<0.05)，其特有操作分类单元 (operational taxonomic unit, OTU)数达1 003个。门分类水平上，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门为2组肠道菌群的主要组成菌门。与常氧组相比，缺氧组变形菌门相对丰度显著降低(P<0.05)，而拟杆菌门相对丰度显著升高(P<0.05)；纲水平上，缺氧组α变形菌纲和芽孢杆菌纲相对丰度显著降低(P<0.05)，梭菌纲、γ变形菌纲和拟杆菌纲相对丰度显著升高(P<0.05)。此外，周期性缺氧应激还引起花鲈肠道内厌氧绳菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科等厌氧或兼性厌氧菌和绿硫菌科等光合产氧菌类相对丰度升高。
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关键词:
- 花鲈 /
- 肠道菌群 /
- 周期性缺氧 /
- Illumina MiSeq高通量测序
Abstract:Based on the technology of Illumina MiSeq high throughput sequencing, we analyzed the effects of periodic hypoxia stress on intestinal microflora structure of Lateolabrax maculatus, so as to provide references for the study of the adaptation mechanism of intestinal flora of the juveniles to environmental hypoxia. The results show that hypoxia caused a significant increase in the diversity and richness of intestinal microflora (P<0.05). The species richness was rather different between the two groups. The operational taxonomic units (OTUs) of hypoxic group were significantly more than those of normoxic group (P<0.05). At the level of Class classification, the dominant bacteria of both groups were Proteobacteria, Firmicutes and Bacteroidetes. Compared with the normoxic group, the relative abundance of Proteobacteria decreased significantly in hypoxic group, while that of Bacteroidetes increased significantly (P<0.05). At the level of Genus classification, the relative abundance of Alphaproteobacteria and Bacilli in hypoxic group decreased significantly, while those of Clostridia, Gammaproteobacteria and Bacteroidia increased significantly (P<0.05). Periodic hypoxia stress also led to an increase of relative abundance of anaerobes or facultative anaerobes (Anaerolineaceae, Lachnospiraceae and Ruminococcaceae) and oxygen-producing bacteria (Chlorobiaceae) in the intestine of L. maculatus.
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花鲈(Lateolabrax maculatus)属鲈形目、鮨科、花鲈属，又称中国鲈鱼、海鲈，主要分布于中国、日本和朝鲜半岛近海及河口地带，在海水中繁殖，海淡水水域均可生长，是中国南方重要的网箱与池塘养殖经济鱼类[1]。然而，随着养殖密度增加，加之南方地区夏季水温高且持续时间长，极易造成养殖水体溶解氧(digestive oxygen, DO)昼夜变化大、夜间DO不足，尤其在养殖中后期，长期周期性缺氧应激严重制约了花鲈的生长与存活。
鱼类肠道中的微生物菌群作为一个独特、多变的生态系统，在与宿主相互影响、共同进化的动态过程中，组建成一个超级生物体，可以说是已发现的生态系统中细胞密度最高的系统之一[2-3]。肠道菌群被看作是调节宿主新陈代谢和免疫系统的器官[4]。越来越多的研究证明肠道菌群对机体的健康和生长起着复杂和重要的作用[5-6]。鱼类在生长发育过程中，由于肠道直接和水体环境相连，肠道内菌群结构极易受到多种应激因子的影响。目前，国内外关于温度[7]、pH[8]、氨氮[9]等胁迫对鱼类肠道菌群结构的影响已有较多报道，但关于周期性缺氧应激对鱼类肠道菌群结构的影响研究较少。本文研究了花鲈幼鱼在周期性缺氧应激条件下的肠道菌群结构变化特征，以期为研究花鲈幼鱼肠道菌群对缺氧环境的适应机制和其健康养殖提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 实验鱼及暂养管理
实验用花鲈幼鱼购自广东省珠海市白蕉镇某养殖场，于室内方形水泥池(长4 m、宽2.5 m、水深0.8 m)中暂养14 d，暂养期间投喂商用鲈鱼配合饲料，每天上午8:00饱食投喂1次，投喂量为鱼体质量的(5±1)%。每天16:00进行底部吸污排水，日换水量15%。暂养期间养殖用水为曝气24 h后的自来水，水温为(29±1) ℃，pH为7.5±0.2，DO≥6.0 mg·L–1，自然光周期。
1.2 实验设计
鱼类可通过在水面呼吸来抵抗水环境中的突发缺氧，此时水体DO水平被称为水面呼吸氧压(aquatic surface respiration，ASR)[10]。研究表明，ASR是评估鱼类承受缺氧压力程度的重要指标之一[11]。通过预实验发现当水温(29±0.5) ℃、pH 7.5±0.2、水体DO降至(2.5±0.2) mg·L–1时，有一半的实验鱼游至水面呼吸，且维持低氧2 h恢复后实验鱼24 h成活率为100%。因此，本实验选取(2.5±0.2) mg·L–1作为缺氧处理氧浓度。
暂养结束后，随机选取体表无伤、规格相近的花鲈幼鱼共120尾[平均体质量为(30±2.52) g)]置于6个300 L圆形养殖桶。实验设常氧对照组(NC组)和缺氧处理组(HC组)，每组3个重复，每个重复20尾。NC组水体DO每天24 h均维持在(6.0±0.2) mg·L–1，HC组水体DO水平每天分为4个阶段。阶段1，3:00—24:00，DO维持在(6.0±0.2) mg·L–1；阶段2，0:00—0:30，DO由(6.0±0.2) mg·L–1逐渐降至(2.5±0.2) mg·L–1；阶段3，0:30—2:30，DO维持在(2.5±0.2) mg·L–1；阶段4，2:30—3:00，DO由(2.5±0.2) mg·L–1逐渐恢复至(6.0±0.2) mg·L–1。周期性缺氧实验时间为7 d，实验期间2组实验鱼除DO外，其他日常管理同暂养期间保持一致。
采用稍加改进的吴鑫杰[12]的方法检测和调整水体DO，其基本原理是以实时监控装置检测水体DO，通过充入氮气和空气来调节水体DO水平，并通过控制气体充入速率精确控制DO范围。通过底部循环水泵的运作，促进水体流动，保证养殖桶中各个部分水体DO水平保持均等。
1.3 样品采集
在周期性缺氧实验结束第2天上午8:00，于每个养殖桶随机选取实验鱼6尾为1个重复样，200 mg·L–1 MS-222中迅速麻醉，冰盘上解剖，取肠部分，放入提前标记好的1.5 mL无菌离心管中，−80 ℃保存。
1.4 DNA提取和16S rDNA宏基因组测序
按照EZNA® Soil DNA试剂盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，US)操作要求提取实验花鲈肠道样品中微生物总DNA。用1%琼脂糖凝胶电泳进行样品条带检测，用NanoDrop 2000c微量核酸检测仪检测DNA质量。针对细菌的16S rDNA基因V4-V5片段设计通用引物。测序区域为515F-806R，引物为515F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA)和806R (CCGTCAATTCMTTTRAGTTT)。
PCR反应体系为20 μL，包括5×FastPfu Buffer 4 μL、2.5 mmol·L–1 dNTPs 2 μL、5 μmol·L–1 正反引物各0.8 μL、FastPfu Polymerase 0.4 μL和模板 DNA 10 ng。反应程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，25个循环；72 ℃ 5 min。2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物后，利用胶回收试剂盒(Axygen Biosciences)对目的片段进行切胶回收。纯化后的片段用QuantiFluor™ -ST (Promega，US)定量。各样本根据定量结果，进行相应比例混合，通过Illumina MiSeq平台进行双末端测序(Illumina PE250)。
1.5 生物信息学分析
1.5.1 测序数据处理
Illumina PE250测序序列首先需要根据barcode得到所有样品的有效序列，然后对reads的质量进行质控过滤，过滤read尾部质量值20以下的碱基，设置50 bp的窗口，若窗口内的平均质量值低于20，从窗口开始截去后端碱基，过滤质控后50 bp以下的read；接着根据PE reads之间的overlap关系，将成对的reads拼接成一条序列，最小overlap长度为10 bp；拼接序列的overlap区允许的最大错配比率为0.2，筛除不符合序列；根据序列首尾两端的barcode和引物区分样品，并调整序列方向，barcode允许的错配数为0，最大引物错配数为2；用Usearch软件和gold数据库，采用denovo和reference结合的方式去除嵌合体。
1.5.2 操作分类单元 (operational taxonomic unit，OTU)聚类分析
对优化序列提取非重复序列，以便于降低分析中间过程冗余计算量(http://drive5.com/usearch/manual/dereplication.html)。去除没有重复的单序列(http://drive5.com/usearch/manual/singletons.html)。按照97%相似性对非重复序列(不含单序列)进行OTU聚类，在聚类过程中去除嵌合体，得到OTU的代表序列。将所有优化序列map至OTU代表序列，选出与OTU代表序列相似性在97%以上的序列，生成OTU表格。采用RDP classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类水平：域、界、门、纲、目、科和属统计各样本的群落组成。所用软件与平台为Qiime平台(http://qiime.org/-scripts/assign_taxonomy.html)和RDP Classifier 2.2 (http://sourceforge.net/projects/-rdpclassifier/)，置信度阈值为0.7。最后对样品数据进行抽平处理，按照所有样本中最低的数据量进行抽平，后续物种组成分析、beta比较分析、差异分析等，均为基于抽平后的数据。
1.6 数据分析
使用Mothur 1.30.1软件(http://www.mothur.org/wiki-Schloss-SOP#Alphadiversity)进行指数分析，用于指数评估的OTU相似水平为0.97。结合R语言工具、Excel 2016、SPSS 20.0和Origin 8.0软件进行数据分析。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)、LSD多重比较检验，P<0.05表示差异显著，结果用“平均值±标准误 (
$\overline X \pm {\rm SE}$ )”表示。2. 结果
2.1 肠道菌群多样性
先对样品测序深度进行评估。2组肠道菌群样品Coverage指数接近1，组间差异不显著(P>0.05，表1)，表明样品序列的测序数量可有效覆盖文库。基于丰富度(Chao1)指数、香农(Shannon)指数和辛普森(Simpson)指数评估周期性缺氧应激对花鲈肠道菌群α多样性的影响。结果显示，与NC组相比，HC组的α多样性显著升高(P<0.05，表1)。根据2组花鲈肠道菌群OTUs绘制Venn图(图1)，2组有效OTUs共2 359个，共有OTUs 1 066个，HC组OTUs显著高于NC组，为2 069个，约为NC组的1.53倍。基于加权和非加权的PCoA分析显示，2组花鲈肠道菌群结构存在一定差异(图2)。
表 1 不同处理组花鲈肠道菌群α多样性指数Table 1. Index of α-diversity of intestine microbiota in L. maculatus组别
groupα 多样性指数 α diversity index 丰富度
Chao1香农指数
Shannon辛普森指数
Simpson测序深度指数
coverage常氧对照组 NC 909.67±83.00b 3.08±0.32b 0.17±0.04a 0.99±0.01a 缺氧处理组 HC 1 509.33±314.41a 4.93±0.44a 0.03±0.01b 0.98±0.02a 注：同一列数据上标字母不同表示各组之间差异显著 (P<0.05) Note: Different letters within the same column indicate significant difference (P<0.05). ![]()
图 1 花鲈肠道菌群OTUs分析图Figure 1. Venn diagram analysis of intestine microbial with OTUs of L. maculatus![]()
图 2 花鲈肠道菌群PCoA分析图左：Unifrac权重的PCoA分析；右：非Unifrac权重的PCoA分析Figure 2. PCoA of intestine microbial with OTUs of L. maculatusLeft: PCoA Plots based on weighted Unifrac metrics; Right: PCoA Plots based on unweighted Unifrac metrics2.2 肠道菌群结构组成的变化
将有效序列进行系谱分类，统计2组鱼类肠道菌群丰度在门和纲分类学水平上的差异。结果表明，在门分类水平上(图3)，变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门在2组鱼类肠道菌群的相对丰度均达93%以上，是其肠道内的主要菌落组成菌门。相较于NC组，HC组变形菌门相对丰度显著降低，而拟杆菌门、绿弯菌门和蓝藻菌门相对丰度显著升高，其中拟杆菌门相对丰度升高最为明显，约为NC组的6.5倍。2组厚壁菌门和放线菌门相对丰度差异不显著(P>0.05)。
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图 3 肠道菌群在门 (左) 和纲 (右) 分类水平上的相对丰度同种菌群小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)Figure 3. Relative abundance of intestine microbial at Phyla (left) and Class (right) levelsDifferent letters above the same microbiota indicate significant difference (P<0.05).在纲的分类水平上(图3)，NC组优势菌群相对丰度由大到小排序依次为α变形菌纲、梭菌纲、γ变形菌纲和拟杆菌纲等，而NC组优势菌群相对丰度由大到小排序为α变形菌纲、拟杆菌纲、梭菌纲和γ变形菌纲等。与NC组相比，HC组α变形菌纲和芽孢杆菌纲相对丰度显著降低，梭菌纲、γ变形菌纲和拟杆菌纲相对丰度显著升高，其中HC拟杆菌纲相对丰度(22.1%)约为HC组(3.8%)的5.8倍。2组放线菌纲相对丰度差异不显著(P>0.05)。
将2组鱼类肠道菌群结果进行LEfSe分析(图4)。结果显示，2组肠道菌落组成差异显著(P<0.05)。HC组肠道群落主要在拟杆菌科、绿硫菌科、厌氧绳菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科等与NC组有显著差异(P<0.05)。
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图 4 不同组肠道菌群的LEfSE分析图左: LDA分析柱状图；右: 进化分枝图Figure 4. LEfSE analysis of intestinal microbial between different groupsLeft: LDA analysis of columnar graph; Right: evolutionary branching diagram3. 讨论
鱼类肠道菌群是一个由好氧菌、兼性厌氧菌和厌氧菌共同构成的动态菌群。这种特殊动态菌群环境被称作肠道“岛屿”微生物群落。肠道微生态平衡是鱼体健康生长的保证，而微生态的平衡需要多种肠道有益菌的共同维持[13]。正常情况下，鱼类肠道的微生物生长良好，各微生物相对丰度处于动态平衡，占主导优势的有益微生物菌群如变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等菌群[14-15]提供外源性消化酶，将食物分解为肠道可吸收的小分子营养物质，保证鱼类消化道的正常消化和吸收功能[16]；另外，有益微生物菌群定植于肠黏膜，形成非特异性的菌膜屏障，抑制病原菌在肠壁内定植，维持肠道正常的微生态平衡[17]。
当饵料或环境变更等应激状态出现时，肠道与其中所定植的微生物菌群所形成的“岛屿”微生态系统平衡会受到冲击；当应激程度进一步加大，宿主的正常防御系统被破坏，条件致病菌会转移、定植甚至侵袭鱼体组织器官，并导致细菌性疾病的暴发[18]。肠道菌群结构的变化往往伴随着疾病的发生，如Lopetuso等[19]对憩室病、肠易激综合征和炎性肠病患者的肠道菌群组成进行研究发现，每种病症都具有明确的整体菌群特征；Hale等[20]研究表明，不同肿瘤亚型患者的肠道微生物组成存在显著差异；Felipe等[21]研究发现，健康与肠炎大西洋鲑(Salmo salar)的肠道菌群结构同样存在显著差异。
本实验中HC组花鲈肠道菌群结构与NC组差异显著(P<0.05)。丰富度指数、香农指数和辛普森指数的α多样性结果显示，周期性缺氧导致花鲈肠道菌群多样性和丰富度显著增加，群落结构复杂化。Venn图与PCoA分析同样显示2组菌群结构组成存在差异，HC组特的有OTUs达1 003个，较NC组有较大差异。有研究指出，长期饥饿同样可以引起花鲈肠道菌群多样性增加，恢复投喂后其菌群结构和多样性指数逐渐与对照组一致[22]。而Duan等[23]研究发现，急性氨氮胁迫引起凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肠道菌群丰富度的降低，这与上述研究结果不符，可能是由于急性胁迫下，机体正常肠道菌群稳态被打破，肠道固有优势菌种脱落，而在长期胁迫下，机体肠道菌群稳态得以重建，水体环境中的微生物成为重塑机体肠道菌群稳态的主要来源，菌群丰富度增加。如对鲫(Carassius auratus)肠道菌群的研究中发现，在30 d高浓度氨氮胁迫下，其肠道菌群丰富度呈先降低后升高的趋势[9]。
高通量16S rRNA序列分析显示，变形菌门相对丰度在2组花鲈肠道菌群中所占比例最高，其次为厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门。已有研究表明，鱼类肠道细菌主要为变形菌门、厚壁菌门、放线菌门和拟杆菌门[14-15]，而变形菌门是其中最主要的菌群[24]，这与本研究结果一致。2组鲈鱼肠道菌群组成相对丰度的比较结果显示，周期性缺氧导致变形菌门相对丰度显著降低，而拟杆菌门和蓝藻菌门相对丰度显著升高。郁维娜等[25]研究发现，患病组对虾肠道拟杆菌门含量显著增加。本研究结果与其一致，这可能是由于周期性缺氧应激使得花鲈处于亚健康状态。对长江口低氧区和非低氧区水体菌群结构的研究发现，蓝藻菌门为低氧区特有[26]。鱼类肠道和周围的水体环境紧密相关，其肠道菌群结构易受到外界水环境的影响[27]。因此，推测本实验中缺氧组蓝藻菌门相对丰度的增高，可能是由于周期性缺氧首先引起养殖水环境中光合产氧生物如蓝藻菌门相对丰度的升高，而后水体菌落组成影响到花鲈肠道菌群丰度变化。
在纲的分类水平上，本实验结果显示NC组花鲈肠道α变形菌纲占绝对优势，其相对丰度约61.2%，而HC组α变形菌纲相对丰度约32.7%，缺氧导致花鲈肠道α变形菌纲相对丰度显著降低。然而，HC组梭菌纲、γ变形菌纲和拟杆菌纲相对丰度显著升高。有研究发现，健康对虾肠道中α变形菌纲丰度较高，而患病对虾中γ变形菌纲丰度较高[25, 28]，这与本实验结果一致。拟杆菌纲是肠道内数量最大的革兰氏阴性厌氧菌，其作为条件致病菌，当正常的微生态平衡被打破时会引发内源性感染[29-30]。梭菌纲多属厌氧菌，其相对丰度的提高往往也伴随着机体亚健康状态的发生[9]。本实验中，周期性缺氧所致拟杆菌纲、梭菌纲等条件致病菌丰度的上升是否会进一步引起花鲈肠道疾病的发生，仍需进一步研究。
除了上述常见条件致病菌丰度在HC组升高之外，本研究还发现厌氧绳菌科、毛螺菌科、瘤胃菌科和绿硫细菌科等相对丰度在HC组显著提高。厌氧绳菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科作为常见的厌氧或兼性厌氧菌科，其在缺氧环境下大量增殖[31]。绿硫菌科多为利用分子态氢作为电子供体进行厌氧光合作用的绿色光合细菌[32]，可在一定程度上缓解缺氧造成的环境压力。Sakata等[27]研究表明，鱼类肠道菌群与养殖水体密切相关。本实验中，HC组上述菌群相对丰度的增加可能是缺氧环境定向改变了水体中菌群丰度所致。
综上，本研究基于高通量测序技术和16S rDNA V4-V5区序列分析技术，分析周期性缺氧应激对花鲈肠道菌群结构的影响。研究结果表明，周期性缺氧应激引起了花鲈肠道菌群相对丰度和种类的显著增加，虽然变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门等菌群依然是优势菌，但各类菌门相对丰度显著降低或升高。周期性缺氧导致花鲈肠道内有益菌种(如α变形菌纲)相对丰度降低，条件致病菌(如拟杆菌纲)相对丰度升高。此外，周期性缺氧引起花鲈肠道内厌氧或兼性厌氧菌(如厌氧绳菌科、毛螺菌科和瘤胃菌科等)相对丰度升高，而这种变化是否与水体环境中微生物群落改变有关，仍需进一步研究。
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图 1 花鲈肠道菌群OTUs分析图
Figure 1. Venn diagram analysis of intestine microbial with OTUs of L. maculatus
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图 2 花鲈肠道菌群PCoA分析图
左：Unifrac权重的PCoA分析；右：非Unifrac权重的PCoA分析
Figure 2. PCoA of intestine microbial with OTUs of L. maculatus
Left: PCoA Plots based on weighted Unifrac metrics; Right: PCoA Plots based on unweighted Unifrac metrics
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图 3 肠道菌群在门 (左) 和纲 (右) 分类水平上的相对丰度
同种菌群小写字母不同表示组间差异显著(P<0.05)
Figure 3. Relative abundance of intestine microbial at Phyla (left) and Class (right) levels
Different letters above the same microbiota indicate significant difference (P<0.05).
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图 4 不同组肠道菌群的LEfSE分析图
左: LDA分析柱状图；右: 进化分枝图
Figure 4. LEfSE analysis of intestinal microbial between different groups
Left: LDA analysis of columnar graph; Right: evolutionary branching diagram
表 1 不同处理组花鲈肠道菌群α多样性指数
Table 1 Index of α-diversity of intestine microbiota in L. maculatus
组别
groupα 多样性指数 α diversity index 丰富度
Chao1香农指数
Shannon辛普森指数
Simpson测序深度指数
coverage常氧对照组 NC 909.67±83.00b 3.08±0.32b 0.17±0.04a 0.99±0.01a 缺氧处理组 HC 1 509.33±314.41a 4.93±0.44a 0.03±0.01b 0.98±0.02a 注：同一列数据上标字母不同表示各组之间差异显著 (P<0.05) Note: Different letters within the same column indicate significant difference (P<0.05). 
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