大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 是中国养殖的高档淡水经济鱼种之一^[1]，又称为加州鲈，原产地为美国^[2]。该鱼含有丰富的蛋白质及不饱和脂肪酸，肉质鲜嫩，无肌间刺，深受消费者青睐，但其肌肉组织水分含量高，肉质柔软细嫩，内源蛋白酶活性强，自溶速度快，在运输、贮藏、加工及销售过程中，新鲜度极易下降，导致腐败变质，使其货架期缩短。

冰藏保鲜是以冰为贮藏介质，将鱼、虾、贝类等水产品的温度降低，待温度达到冰的融点附近时在此温度下贮藏。冰藏保鲜在水产品方面的应用十分广泛，具有可大批量冷却水产品、使用安全、价格低廉、保持水产品表面湿润等优点^[3-4]。越来越多的研究发现预冷处理也是影响水产品冷藏品质的重要因素。高萌等^[5]认为流化冰预冷处理可明显维持鲣鱼 (Katsuwonus pelamis) 肌肉组织的质构和相关蛋白质功能特性，满足冰鲜水产品远洋、长距离运输和保鲜贮藏要求。但目前的预冷研究多集中在水产品的宰后处理环节^[6]，对鲜活水产品预冷的影响研究鲜少。而活鱼运输的经验表明低温可降低鱼体的代谢水平，但这种低温预冷处理是否会对鱼肉后期贮藏品质产生影响尚未可知。鉴于此，本文以鲜活大口黑鲈为研究对象，通过宰前预冷降低活鱼代谢水平，以感官指标、理化 [ pH、挥发性盐基氮 (total volatile base nitrogen，TVB-N)、鲜度指标 (K值)、硫代巴比妥酸 (thiobarbituric acid，TBA)值] 及微生物 [菌落总数 (total viable counts，TVC) ] 作为评价参数，研究不同预冷温度对大口黑鲈冰藏品质的影响，为提高其保鲜品质提供参考依据。

1.   材料与方法

1.1   材料与试剂

鲜活养殖大口黑鲈60尾，购于广州市海珠区大江苑肉菜市场，鱼体质量约为0.5~0.6 kg。平板计数琼脂(广东环凯微生物科技有限公司)；无水乙醇、冰乙酸、甲基红、氯化钠、三氯乙酸，氢氧化钠、硼酸、盐酸、酚酞、次甲基蓝、乙二胺四乙酸二钠、三氯甲烷和柠檬酸、2-硫代巴比妥酸和三乙胺等均为分析纯，购于广州化学试剂厂。甲醇为色谱纯，购于德国CNW公司。标准品腺苷酸 (adenosine monophos-phate，AMP)、二磷酸腺苷 (adenosine diphosphate，ADP)、三磷酸腺苷 (adenosine triphosphate，ATP)、肌苷酸 (inosinic acid，IMP)、次黄嘌呤 (hypoxanthine，Hx) 和次黄嘌呤核苷 (inosine，HxR) 纯度均≥99%，购于美国Sigma-aldricha公司。

1.2   仪器与设备

GB204分析天平 (瑞士Mettler公司)；809Titrando自动电位滴定仪 (瑞士Metrohm公司)；DKN612C干燥箱 (日本Yamato公司)；DHG-9145A电热恒温鼓风干燥箱 (中国上海一恒科技有限公司)；EYELA MMV-1000 W振荡器 (广州托普仪器有限公司)；Sunrise-basic Tacan吸光酶标仪 (瑞士TECAN公司)；MILI-Q超纯水机 (美国Milipore公司)；PB-10 pH计 (上海Sartorius公司)；T50均质机 (德国IKA公司)；HH-4数显恒温水浴锅 (常州澳华仪器有限公司)；3K30台式高速冷冻离心机 (德国Sigma公司)；Agilent1100液相色谱仪 (美国Agilent公司)；FM 400A制冰机 (美国Grant公司)；SQ510C立式压力蒸汽灭菌器 (日本Yamato公司)；SPX-320生化培养箱 (宁波东南仪器厂)；SW-CJ-1FD超净工作台 (苏净安泰公司)；DW-86L626立式超低温保存箱 (青岛海尔特种电器有限公司)。

1.3   实验方法

1.3.1   样品处理

将鲜活大口黑鲈60尾随机分为4组。其中对照组不做预冷处理，鱼体暂养温度为25 ℃；其余3组为预冷处理组，预冷温度分别为15 ℃、10 ℃和5 ℃，预冷处理时间约30 min，预冷期间持续向暂养槽充氧。将预冷处理后的鱼体取出，击晕、放血、取鱼片，鱼片经清洗、沥水后真空包装。包装后的鱼片采用层冰层鱼的方式放入泡沫箱中，每天早晚更换新冰。

1.3.2   感官评分

参考赵良等^[7]的方法。将鱼片样品取出，于室温下放置约20 min后进行感官评定。评价小组由10人组成，对鱼片的色泽、气味、组织形态和肌肉弹性进行评分 (表1)。实验根据加权评分法计算最终评分，其中色泽和组织弹性各占20%、气味和组织形态各占30%。

表  1  大口黑鲈感官评分标准

Table  1.  Sensory evaluation standard of M. salmoides

指标 index	好 (8~10分) excellent	较好 (6~8分) good	一般 (4~6分) not good	较差 (2~4分) bad	差 (0~2分) very bad
色泽 colour	色泽正常，肌肉切面富有光泽	色泽正常，肌肉切面有光泽	色泽稍暗淡，肌肉切面稍有光泽	色泽较暗淡，肌肉切面无光泽	色泽暗淡，肌肉切面无光泽
气味 smell	固有气味浓郁	固有气味较浓郁	固有气味清淡，略带异味	固有气味消失，有腥臭味或氨臭味	有强烈腥臭味或氨味
组织形态 tissue	肌肉致密，组织完整	肌肉致密，组织完整	肌肉不紧密，但组织不松散	肌肉不紧密，局部组织松散	肌肉不紧密，组织松散
组织弹性 springiness	弹性大，指压后凹陷消失快	弹性大，指压后凹陷消失较快	弹性较大，指压后凹陷消失较慢	略有弹性，指压后凹陷消失很缓慢	无弹性，指压后凹陷基本不消

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1.3.3   pH测定

参考武华等^[8]的方法，略作修改。称取剪碎的鱼肉2.50 g，加入9倍体积的蒸馏水，用均质机高速均质30 s (13 000 r·min^–1)，静置30 min后用离心机3 500 r·min^–1离心10 min，取上清液测pH。每个样品平行测定3次，取平均值。

1.3.4   TVB-N的测定

参照GB 5009.228—2016 食品安全国家标准　食品中挥发性盐基氮的测定。

1.3.5   K值的测定

参照SC/T 3048—2014鱼类鲜度指标K值的测定　高效液相色谱法。

1.3.6   TBA值的测定

参考Siu和Draper^[9]的方法，略有修改。

标准样品制备。取6根空白25 mL比色管，分别加入0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL和0.5 mL丙二醛标准溶液(10 μg·mL^–1)，加蒸馏水至5 mL，然后每管加入5 mL TBA溶液。沸水浴40 min，冷却后加入5 mL氯仿摇匀，静止分层后于532 nm处比色，绘制标准曲线。

样品测定。称取5.00 g鱼肉，加入25 mL 7.5%的三氯乙酸(TCA)混合液 (其中含有0.1%的乙二胺四乙酸二钠)，10 000 r·min^–1均质2 min后，持续振摇30 min，用双层滤纸过滤2次。取上清液5 mL，加入TBA溶液(0.02 mol·L^–1) 5 mL，沸水浴保温40 min后用冰水冷却，然后加入5 mL三氯甲烷摇匀，静置分层后取上清液在532 nm处比色，测定标准品和样品的光密度 (optical density, OD)，并记录结果，绘制标准曲线，代入样品的OD，从标曲中得到样品的丙二醛含量。TBA值用丙二醛质量分数表示，单位为mg·kg^–1。

1.3.7   TVC的测定

参照GB 4789.2—2016食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定进行稀释平板计数。

1.4   数据处理

采用Excel 2003处理数据；对数据进行方差分析和Duncan多重差异性分析。

2.   结果

2.1   感官变化

对照组和3个预冷组的大口黑鲈在冰藏期间感官评分均显著下降，且随着贮藏时间的延长，感官变化组间差异日趋明显 (图1-a)。这可能是由于贮藏期间鱼体在自身内源酶和外源微生物的协同作用下，蛋白质、氨基酸及脂质等营养物质的降解速度加快，导致鱼肉出现组织松软、色泽暗淡、光泽散失、腥臭变味等典型的腐败变质现象。在最初的3 d内，对照组与3个预冷组样品的感官评分无显著差异(P>0.05)；随着贮藏时间的延长，15 ℃预冷组的感官评分较对照组、10 ℃和5 ℃预冷组下降缓慢，感官评分差异显著 (P<0.05)。冰藏第11天时，对照组、10 ℃和5 ℃预冷组的大口黑鲈感官得分约6分，第13天时鱼片色泽变暗，肌肉光泽下降，有轻微的异味产生，肌肉松弛，指压后凹陷缓慢消失，品质明显劣变。而15 ℃预冷组的鱼肉约在第13 天时感官评分才降为6分，较对照组延长约2 d。

图  1  预冷温度对冰藏大口黑鲈鱼片的影响

Figure  1.  Effect of precooling temperature on M. salmoides fillets during ice storage

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2.2   pH的变化

对照组和3个预冷组的大口黑鲈在冰藏期间pH均呈先下降后上升的变化趋势 (图1-b)，这与蓝蔚青等^[10]研究流化冰处理的花鲈 (Lateolabrax japonicus) 在流通期间的pH变化趋势相同。这是因为僵直期内鱼类pH持续下降，解僵时pH开始上升。4组大口黑鲈在冰藏前期 (0~3 d) pH均出现小幅度的降低，第3天时pH均达到最低值，在随后的贮藏过程中呈逐渐上升趋势。3个预冷组大口黑鲈的pH上升幅度显著小于对照组 (P<0.05)。其中15 ℃预冷处理组的pH上升幅度最小。李来好等^[11]指出，鱼片pH若能保持在初始值上下，表明新鲜度较好；pH变化在0.1~0.2个单位之间，说明鱼肉的品质良好；若pH变化大于0.2个单位，则表明鱼肉已发生腐败。第15天时，对照组、15 ℃、10 ℃、5 ℃预冷组的pH分别为6.93、6.79、6.84、6.91，分别较初始值增大了0.33、0.17、0.22、0.31，对照组、10 ℃和5 ℃预冷组的pH较初始pH增大0.2个单位以上，表明这3组的鱼肉已腐败，而15 ℃预冷组的pH较初始pH仅增加0.17。根据pH变化确定对照组、15 ℃、10 ℃及5 ℃预冷组鱼片的保质期限分别为13 d、16 d、14 d和13 d。

2.3   TVB-N的变化

TVB-N是判断水产品腐败变质程度的一个重要指标，TVB-N越大，腐败程度越高。GB 2733—2015鲜冻动物性水产品卫生标准规定，鲜、冻淡水鱼虾中TVB-N不得超过200.00 mg·kg^–1。在冰藏期间，对照组和3个预冷组大口黑鲈TVB-N的变化均呈先缓慢增长后加快上升的趋势 (图1-c)。大口黑鲈冰藏期间TVB-N的变化趋势与冰藏河鲈 (Perca fluviatilis) ^[12]以及冰藏草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) ^[13]相似。与对照组、5 ℃和10 ℃预冷组相比，15 ℃预冷组大口黑鲈TVB-N的含量增加较为缓慢，贮藏第15天时分别提高了164.43%、159.00%、151.76%和115.04%。根据GB 2733—2015的规定，TVB-N≤200 mg·kg^–1为淡水鱼的腐败临界值。本研究结果表明，第15 天时对照组、5 ℃和10 ℃预冷组样品已腐败、不可食，且有微弱的腥臭氨味散发。而15 ℃预冷处理鱼肉的TVB-N为198.7 mg·kg^–1，在淡水鱼卫生标准限定范围内，鱼肉固有气味明显。在冷应激条件下，细胞的架构、细胞膜的通透性等受到破坏，引起肌肉细胞的部分裂解和内容物的外流，导致一些碱性氨基酸基团暴露，促使肌肉内源酶对蛋白质产生水解作用，水解及氧化产生大量低级有害物质，如二甲胺、甲醛、次黄嘌呤类物质等，最终加速鱼肉中pH和TVB-N的升高^[14]。黄卉等^[15]研究发现15 ℃预冷鲈鱼肉TVB-N升高缓慢。

2.4   K值的变化

K值是次黄嘌呤核苷和次黄嘌呤含量的和占总的ATP各级降解物含量的比值，是评定鱼肉新鲜度的重要化学指标。罗殷等^[16]研究表明K值越小鱼肉新鲜度越好，K值越大鱼肉新鲜度越差。Saito和Matsuyoshi^[17]认为水产品K值小于20%表示非常新鲜，20%~40%表示中等鲜度，而高于60%则已达到初期腐败阶段，为不可食用鱼。本研究结果显示，所有实验组大口黑鲈K值的变化均与贮藏时间呈良好的正相线性关系 (图1-d)，这与刘明爽等^[18]研究冷藏和微冻状态下鲈鱼的K值变化趋势相似；但经15 ℃预冷处理的鱼片初始K值明显低于对照组及其他2个预冷处理组；在冰藏期间，对照组的K值增长速率最快，第12天时已高达 65.43%，进入腐败阶段；5 ℃预冷组的K值增长速率略慢，第12天时为64.08%，超过货架期终点；10 ℃预冷组的K值增长速率显著低于对照组和5 ℃预冷组 (P<0.05)，第12天时增至56.29%，至第15天时K值为64.33%，产生轻微的腐败气味，为腐败不可食用鱼；15 ℃预冷组的K值增长最为平缓，第12天时增至48.24%，仍在K值的食用上限范围之内，此后至第18天时K值为60.95%，出现腐败气味，超过可食用的K值上限。根据鲜度分类标准，冰藏条件下对照组、5 ℃、10 ℃和15 ℃预冷组大口黑鲈肉的货架期分别约为10 d、10 d、13 d和17 d。15 ℃预冷处理可明显降低宰后大口黑鲈初始K值，可能是由于低温降低鱼体宰前代谢水平，而预冷温度过低，引起的低温胁迫破坏细胞膜结构，改变细胞膜的稳定性和通透性，迫使膜释放出大量吸附在膜上的5'-核苷酸酶，与原本游离在胞浆中的5'-核苷酸酶叠加，共同诱导IMP进行代谢反应，加速IMP的降解，从而导致生成HxR和Hx的速率加快，及K值的快速升高^[19]。

2.5   TBA值的变化

鲈鱼腹肌脂肪含量为10.06%，不饱和脂肪酸总量与脂肪酸总量的比值为48.1%^[20]。因其不饱和脂肪酸含量丰富，极易氧化变质。TBA值可用来表征水产品中脂肪的氧化酸败程度，为水产品新鲜度的重要指标之一。TBA值越大说明脂肪的氧化程度越高，酸败就越严重。通常情况下，TBA值达1~2 mg·kg^–1时，鱼肉就会产生难以接受的气味^[21]。随着冰藏时间的延长，大口黑鲈鱼片TBA值上升趋势显著 (P<0.05，图1-e)，但对照组TBA值 (MDA)上升趋势明显快于预冷组 (P<0.05)。贮藏至第15天时，对照组大口黑鲈鱼肉的TBA值为1.04 mg·kg^–1，显著高于其他组 (P<0.05)，鱼肉出现了明显的腐败。而15 ℃、10 ℃和5 ℃预冷组贮藏至第15天时TBA值分别为0.82 mg·kg^–1、0.89 mg·kg^–1和0.99 mg·kg^–1，均小于1 mg·kg^–1，第18天时3个预冷组的TBA值超过1 mg·kg^–1。过低温度应激可导致鱼类脂肪酸组成的变化，其中最显著的是不饱和脂肪酸含量快速上升^[22]。水温过低会使部分酶的活性降低且抗氧化物质含量减少，从而降低了鱼体清除自由基的能力，最终导致脂质过氧化物增多，如丙二醛^[23]。10 ℃和5 ℃预冷组由于水温降低，导致大口黑鲈的不饱和脂肪酸含量增加，因自由基的积累而对鱼体造成伤害，产生较多丙二醛，致使TBA值的升高。

2.6   TVC的变化

根据中国无公害水产品安全要求 (GB 18406.4—2001)和《国际微生物规格委员会 (ICMSF) 食品微生物限量规定》^[24]，水产品中微生物总数应控制在10⁶ CFU·g^–1以内，即6 lg (CFU·g^–1) 为水产品货架期的终点，当微生物总数多于10⁶ CFU·g^–1表明水产品己腐败，不适于食用。随贮藏时间的延长，4组大口黑鲈的TVC均呈上升趋势且差异显著 (P<0.05，图1-f)，但3个预冷处理组的TVC增长趋势较对照组缓慢。其中对照组最快，5 ℃预冷组次之，其次是10 ℃预冷组，15 ℃预冷组增长最缓慢。第15天时对照组、5 ℃和10 ℃预冷组的TVC分别为6.24 lg (CFU·g^–1)、6.12 lg (CFU·g^–1) 和6.02 lg (CFU·g^–1)，均超出国家标准规定的鲜度范围，且这3个组的鱼肉均散发出腥臭味，表明已进入腐败阶段。而15 ℃预冷处理组在第15天时TVC为5.83 lg (CFU·g^–1)，低于10⁶ lg (CFU·g^–1)，未超过可接受上限，仍处于可食用水平。至第18天，15 ℃预冷组的TVC超过10⁶ lg (CFU·g^–1)，为6.17 lg (CFU·g^–1)。依据GB 18406.4—2001和ICMSF规定，对照组、10 ℃和5 ℃预冷组大口黑鲈的保存期限约为13 d，而15 ℃预冷组鱼片的保存期限为16 d。

3.   讨论

冰藏可有效抑制内源酶的作用和微生物的增长，延缓蛋白质、氨基酸及脂质等营养物质的降解和IMP等产物的降解速率，因此冰藏前期TVB-N、K值、TBA值和TVC均维持在较低水平，推迟鱼肉腐败变质的进程^[25]。但随着贮藏时间的延长，鱼肉解僵后产生自溶现象，为微生物的生长提供了充足的营养物质，微生物快速繁殖，加速蛋白质、氨基酸及脂质等营养物质的降解，产生氨、吲哚、硫化氢等腐臭味物质，使鱼片肉质产生逐渐松软、色泽变暗、产生腥臭味等变质特征，最终导致pH、TVB-N、K值、TBA值和TVC的迅速增加。本实验中，感官、pH、TVB-N、K值、TBA值和TVC评定的货架期虽然有差异，但不同条件影响的先后顺序基本一致。虽然感官评价带有主观性，但对水产品品质评价更为直观，pH的变化受到较多因素的影响，TBA值在贮藏过程变化较小，K值与微生物指标和TVB-N之间互相作用与影响，微生物的生长和TVB-N的生成相对于ATP降解过程较慢。综上所述，冰藏条件下对照组、5 ℃、10 ℃和15 ℃预冷组大口黑鲈肉的货架期分别为10 d、10 d、12 d和13 d。

宰后同样的贮藏条件，鱼片贮藏期限有所不同，说明宰前的预冷处理对鱼肉宰后贮藏品质影响差异显著，其原因可能在于预冷环节对鱼体宰前代谢水平有一定的影响。范秀萍等^[26]在石斑鱼 (Epinephelus septemfasciatus) 保活运输的研究中发现低温条件下保活鱼体能维持较低的代谢水平，但温度过低会使鱼体产生应激效应，从而影响鱼体的成活状态。有研究表明河鲈的最佳生长水温为15~28 ℃，摄食水温为13~30 ℃，当水温低于13 ℃时会影响鱼的生长，当水温降低至10 ℃时，海鲈开始停止摄食^[27]。本研究预冷温度为5 ℃、10 ℃和15 ℃，在鱼体的适宜生长范围内，温度越低鱼体代谢水平越慢，但若鱼体周围水温骤降，会对其造成应激效应，反而不利于鱼体成活。宁军号等^[28]在研究低温对褐篮子鱼 (Siganus fuscessens) 的胁迫反应时发现，水温骤降时实验鱼表现出强烈的应激反应，在短时间 (3 h内) 出现死亡。刘丽丽等^[29]报道鱼类在一定程度上能通过代谢途径调节适应低温，但温度过低可导致鱼类免疫力下降，甚至死亡。本研究预冷过程将活鱼由室温移至15 ℃、10 ℃和5 ℃水槽中，温度骤降幅度不同对鱼体的影响也存在差异，其中15 ℃时鱼体游动速度明显下降，但无其他明显应激反应，而10 ℃和5 ℃条件下的实验鱼应激明显，部分鱼体休克、甚至死亡。鱼体对不同预冷温度的反应不同，会影响鱼肉代谢产物的累积情况，从而影响鱼肉的后期贮藏效果。对大口黑鲈而言，15 ℃条件下预冷，鱼体可以通过自身调节降低自身代谢水平，快速进入稳态阶段，更有利于鱼肉的后期贮藏。

4.   结论

综合各项指标，冰藏条件下对照组、5 ℃、10 ℃和15 ℃预冷组大口黑鲈肉的货架期分别为10 d、10 d、12 d和13 d。说明15 ℃预冷处理可以较好地保持大口黑鲈冰藏期间的品质，延缓鱼肉色泽衰败、不良气味的产生和感官品质的劣变，降低细菌的生长繁殖速度，延缓pH、TVB-N、K值、TBA值及菌落总数的上升，货架期较对照组延长约3 d。研究表明宰前预冷处理能延长大口黑鲈的货架期，使鱼肉保持较好的鲜度，但并非温度越低预冷作用的效果越好。