TGF-β/Smad signaling pathway responding to photoperiod for participation in regulation of zebrafish ovarian development
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摘要:
为研究不同光周期条件下转化生长因子-β超家族/Samd (TGF-β/Smad)信号通路在斑马鱼 (Danio rerio)卵巢中的作用，利用荧光定量PCR技术检测连续黑暗 (0 L∶24 D, DD)、自然光照 (14 L∶10 D, LD)和连续光照 (24 L∶0 D, LL)条件下斑马鱼卵巢中TGF-β/Smad信号通路中相关基因的相对表达量，并利用免疫组化技术检测不同光周期条件下p-Smad2在斑马鱼卵巢中的定位情况。结果显示，在不同光周期条件下，TGF-β/Smad信号通路中信号分子在斑马鱼卵巢中的表达模式不尽相同，其中配体 (tgfb3)、受体 (tgfbr2a，tgfbr2b，tgfbr1b)和下游蛋白激酶 (smad2和smad3a)的表达趋势一致，即在不同光周期处理3 d后，上述6个基因的相对表达量DD组最高，LL组最低，但处理7 d后则呈相反趋势。在斑马鱼卵黄发生前期至充分生长未成熟期的卵母细胞中均检测到p-Smad2蛋白信号，但光周期处理后未影响p-Samd2在斑马鱼卵巢中的定位。结果表明，光周期变化可能通过改变 tgfb3/受体/蛋白激酶基因的表达模式影响斑马鱼的卵巢发育。
Abstract:To study the role of TGF-β/Smad signaling pathway in zebrafish (Danio rerio) ovary under different photoperiod conditions, we detected the relative expression of relevant genes in TGF-β/Smad signaling pathway of zebrafish ovary under continuous dark (0 L∶24 D, DD), natural photoperiod (14 L∶10 D, LD) and continuous light (24 L∶0 D, LL) using quantitative real-time PCR. The location of p-Smad2 in zebrafish ovary was detected by immunohistochemical technology. The results show that the expression patterns of genes involved in TGF-β/Smad signaling pathway were different in zebrafish ovary under different photoperiod conditions, and the expression profiles of ligand (tgfb3), receptor (tgfbr2a, tgfbr2b and tgfbr1b) and downstream protein kinase (smad2 and smad3a) were consistent. The relative expression levels of the above six genes were the highest in DD group and the lowest in LL group after 3-day treatment of different photoperiods, and an opposite trend was observed after 7 d. The p-Smad2 protein signal was detected in the development of zebrafish oocytes from previtellogenic stage (PV) to full-grown immature stage (FG). Photoperiod treatment did not affect the localization of p-Samd2 in zebrafish ovary. The results suggest that change of photoperiod might affect the ovarian development of zebrafish by changing the expression pattern of genes of tgfb3/receptor/protein kinase.
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Keywords:
- Danio rerio /
- photoperiod /
- transforming growth factor-β /
- Smad protein /
- ovarian development
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肿瘤蛋白p53调控的凋亡抑制因子1 (tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)是一类受p53靶向调控的功能型蛋白因子，在细胞凋亡等程序性细胞死亡过程中起重要作用[1]。研究表明，TRIAP1主要通过与热休克蛋白70 (HSP70)相互作用阻止凋亡酶激活因子(APAF1)和细胞色素C结合，并抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9 (Caspase9)的激活，从而参与调控细胞凋亡过程[1]。例如，低水平的基因毒性物质刺激下，生物机体内的p53可特异性结合TRIAP1基因第二外显子上的p53结合位点诱导TRIAP1产生，进而抑制细胞凋亡并启动受损基因修复机制[1]；Fook-Alves等[2]对经特异性沉默TRIAP1基因后的多发性骨髓瘤细胞系进行研究时发现，Caspase9和APAF1基因的表达量呈显著下降趋势，晚期细胞凋亡率显著升高；Potting等[3]在Hela细胞中也获得了类似的研究结果，降低TRIAP1的表达会阻碍心磷脂(CL)累积、增加细胞色素C释放，进而引发细胞凋亡的发生。近年来，TRIAP1在高等动物凋亡相关的生理活动中的研究屡屡见诸报端，但在低等水产养殖动物中却鲜有报道。
MicroRNA (miRNA)是一类长约18~25个核苷酸的内源性非编码小RNA分子，它可以依赖于自身与靶基因2种不同机制的互补性(完全匹配或者种子序列匹配)以类似RNA干扰的途径调控目的基因翻译或降解靶mRNA和新合成的多肽链[4-6]。成熟的miRNA与靶基因的mRNA非翻译区(UTR)结合的特异性主要由miRNA 5'末端被称为种子序列的2~8个碱基决定[7-8]。现已证实，无论是像甲壳动物、棘皮动物、软体动物等的低等无脊椎水产养殖动物，还是像鱼类一样的高等脊椎水产养殖动物，miRNA作为转录后调控的关键因子，参与调控机体内多种重要的生命活动过程，如生长发育、生殖和免疫等[9-10]。近年来，诸如miR-15、miR-16和miR-29等大批与细胞凋亡发生密切相关的miRNA被陆续鉴定出来[11-12]，并已初步证实上述miRNA主要通过靶向调控细胞凋亡相关基因的表达介导细胞凋亡的发生。例如，Zhang等[13]在日本比目鱼(Paralichthys olivaceus)的研究中得出miR-731可以抑制p53的表达从而抑制细胞凋亡；Yi等[14]在日本囊对虾(Penaeus japonicus)的研究中发现过表达miR-1000可抑制p53的表达从而抑制细胞凋亡发生，而沉默miR-1000则显著提高p53的表达从而促进细胞凋亡的发生。
斑节对虾(P. monodon)等无脊椎动物因缺乏脊椎动物特有的获得性免疫系统，主要依赖先天性免疫系统抵御外界不良刺激。细胞凋亡属于对虾先天性免疫系统的血细胞防御系统中的重要一环，在斑节对虾抵御外界不良刺激过程中起重要作用[15-16]。基于TRIAP1参与调控细胞凋亡的发生，本研究克隆了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)，通过实时定量PCR (qRT-PCR)技术研究了其在不同组织中的表达分布规律以及哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激下其在血细胞和肝胰腺中mRNA水平的变化情况；并对Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p和PmTRIAP1的关联关系进行了探究。旨在通过对PmTRIAP1及调控其表达的miRNAs表达调控的研究，为阐明PmTRIAP1在斑节对虾中抵御病菌入侵的分子机制奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
斑节对虾来自中国水产科学研究院南海水产研究所珠海斗门实验基地，体质量为(15±3) g，在(25±1) ℃、盐度3的海水中暂养3 d。每天更换养殖池内2/3的海水并按时投喂常规商品化对虾饲料，实验前24 h停止喂食。
哈氏弧菌由中国水产科学研究院南海水产研究所渔业生物病害防治研究室馈赠。双荧光素酶报告实验质粒(pMIR-REPORT)由和元生物技术有限公司(上海)构建。
人胚肾293T (HEK-293T)细胞株来源于中科院细胞库，细胞培养条件为DMEM+10% FBS、37 ℃、5% 二氧化碳 (CO2)。
1.2 实验方法
1.2.1 总RNA提取和cDNA合成
随机选取3尾健康斑节对虾迅速解剖，取心脏、淋巴、血细胞、肌肉、鳃、卵巢、脑、肠、胸神经、胃、肝胰脏11种组织速冻于液氮中。其中血细胞获取方法是：使用1 mL注射器抽取血液，转移至2 mL全新EP管中，立即4 ℃、4 000 g离心5 min，倒掉上清，取其沉淀。按照Trizol (Invitrogen，美国)说明书提取上述样品的总RNA，溶于DEPC水中。用NanoDrop-2000/2000c分光光度计检测浓度，通过1.2%琼脂糖凝胶电泳检测质量。使用PrimeScript TM逆转录试剂盒(TaKaRa)将RNA逆转录为cDNA。保存于−80 ℃。将cDNA样品工作液稀释至约40 ng·μL−1，并在−20 ℃下储存以备后用。
1.2.2 PmTRIAP1全长扩增
从实验室的斑节对虾转录组数据库中获得PmTRIAP1的部分cDNA序列。设计并合成特异性引物TRIAP1-3GSP1/3GSP2 (表1)，使用SMARTer RACE 5'/3'试剂盒 (TaKaRa)通过降落PCR和巢式PCR技术扩增目的基因3'末端。使用引物TRIAP1-F/R (表1)进行常规PCR验证PmTRIAP1基因cDNA的开放阅读框 (ORF) 的正确性。
表 1 实验所用引物Table 1 Sequences of primers used in this study引物名称
primer name序列 (5'−3')
sequence用途
applicationTRIAP1-F ATGAACAGTGTGAGCAAGGATT 开放阅读框验证 TRIAP1-R CTATTCCTTCGGCTTTTCTTCCG 开放阅读框验证 TRIAP1-3GSP1 GGAGGAAGAAAACGCTGGCAGTGG 3' RACE 扩增 TRIAP1-3GSP2 TGCAGCTGAGCTTGAGACCCAAAA 3' RACE 扩增 qTRIAP1-F TGAACAGTGTGAGCAAGGATT PmTRIAP1 RT-PCR qTRIAP1-R AGTGCTTCTTGGACACAGCTTTGG PmTRIAP1 RT-PCR EF-1α-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT RT-PCR 参照基因 EF-1α-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT RT-PCR 参照基因 qmiR-145-F GGATTCCTGGAAATACTG miR-145 RT-PCR qmiR-454-F TAGTGCAATATTGGCTA miR-454 RT-PCR qmiR-R CAGTGCGTGTCGTGGAGT miRNAs RT-PCR U6-S CTCGCTTCGGCAGCACA RT-PCR 内参基因 U6-A AACGCTTCACGAATTTGCGT RT-PCR 内参基因 1.2.3 PmTRIAP1的生物信息学分析
使用NCBI (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)的BLAST程序分析PmTRIAP1的全长cDNA序列。用ExPaSy计算工具 (http://web.expasy.org/protparam/)计算多肽链的分子量、氨基酸含量和等电点。用Clustal X 2.1进行多重序列比对(http://www.clustal.org/)。使用MEGA 7.0的邻接 (neighbor-joining, NJ)方法构建进化树。所有TRIAP1比对序列信息均从GenBank数据库获得。
1.2.4 PmTRIAP1组织表达分析
使用qRT-PCR检测1.2.1所述的斑节对虾11个组织中PmTRIAP1的表达。PCR反应总体系为12.5 μL，其中SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa) 6.25 μL、cDNA模板1 μL、上游引物qTRAIP1-F和下游引物qTRIAP1-R各0.5 μL、双蒸水补足至12.5 μL。反应条件为94 ℃预变性30 s；94 ℃变性15 s，59 ℃退火延伸30 s，40个循环；溶解温度从65 ℃升至95 ℃；40 ℃冷却5 min。使用Roche Light-Cycler 480 Ⅱ实时定量PCR仪进行PCR，用2−ΔΔCt法计算基因相对表达量。结果用SPSS 22.0软件分析，表示为“平均值±标准差(
$\overline X \pm {\rm SD}$ )”，并进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析，P<0.05为差异显著。PmTRIAP1基因特异性引物(qTRIAP1-F, qTRIAP1-R)、内参基因EF-1a引物(GenBank：DQ021452.1)见表1。1.2.5 预测与PmTRIAP1-3'UTR结合的miRNAs
结合实验室前期建立的斑节对虾小RNA文库(尚未发表)，用软件Mireap (http://www.miRNA.org/miRNA/)、MiRanda (http://www.miRNA/miRNA.org)和Targetscan (http://genes.mit.edu/targetscan)从中筛选出与PmTRIAP1-3'UTR结合的miRNAs。3个软件预测出来的共有miRNAs为最终结果。Mireap比较发夹前体结构和限制性位点的保守性、计算前体的折叠自由能来预测miRNAs；MiRanda评估2个序列(靶基因和miRNA)的互补性，通过计算自由能和进化保守度来过滤信息从而预测miRNAs；TargetScan根据靶基因与种子序列的最佳互补性评出最终得分预测miRNAs。Mireap和Targetscan中的参数是默认的，MiRanda中的参数修改为S≥140和E≤−14.0。
1.2.6 斑节对虾哈氏弧菌刺激实验
使用哈氏弧菌对斑节对虾进行刺激，并检测PmTRIAP1和预测的miRNAs的表达变化情况。在2216E培养基中培养哈氏弧菌，持续摇动(180 r·min−1) 12 h。用磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)制备得到1.0×108 CFU·mL−1的菌悬液。
本实验设置1个对照组和1个实验组，每组随机选取25尾健康的斑节对虾，分别饲养。稳定3 d后腹腔注射。对照组注射100 μL PBS溶液，实验组注射100 μL 1×108 CFU·mL−1的哈氏弧菌悬液。注射后分别于第0、第6、第24、第48、第72小时取样，5组重复。取其肝胰腺和血细胞储存于−80 ℃备用。
按照1.2.1的方法提取2种组织的总RNA并合成cDNA，PmTRIAP1荧光定量的表达分析、反应体系、反应程序、内参基因和数据处理方法同1.2.4。
miRNAs荧光定量实验反应总体系为25 μL，其中ddH2O 9 μL、SYBR Advantage Premix (2×) (TaKaRa) 12.5 μL、ROX Dye (50×) 0.5 μL、cDNA模板2 μL、上游引物qmiR-145或454和下游引物qmiR各0.5 μL。加好试剂后，将荧光定量PCR孔板放入Roche Light-Cycler 480 Ⅱ中，进行以下程序：94 ℃变性 10 s；94 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40个循环；溶解曲线：94 ℃ 60 s，55 ℃ 30 s；95 ℃ 30 s。
所用引物qmiR-145、qmiR-454、qmiR、内参基因引物U6-S、U6-A见表1。数据处理方法同1.2.4。
1.2.7 双荧光素酶报告基因检测miRNAs
Pm-miR-454-3p和Pm-miR-145-3p类似物(agomir-454: 5'-TAGTGCAATATTGCTAATAGGCT-3'和agomir-145: 5'-GGATTCCTGGAAATACTGTTCT-3')及阴性对照agomir NC (agomir NC: 5'-TGATTTTTCAGCGCCTTGAAAG-3')委托上海和元生物技术有限公司合成。将Pm-miR-145-3p对应的靶基因PmTRIAP1 3' UTR (1 816~1 837 bp，5'-CAACAAAATCAACAGGAATCTG-3')和3' UTR突变序列 (5'-CAACAAAATCAACGATGCGATG-3') 以及Pm-miR-454-3p对应的靶基因PmTRIAP1 3'UTR (1 224~1 248 bp，5'-CAAGGGTATACCATTTATTGCACTT-3') 和3' UTR突变序列 (5'-CAAGGGTATACCATTTAGCTAGACT-3') 分别连接到pmir-report荧光质粒，从而构建含有PmTRIAP1 3'-UTR的嗜凤梨果蝇野生型质粒(miR-454-PmTRIAP1 3'UTR-WT和miR-145-PmTRIAP1 3'UTR-WT)和突变型质粒(miR-454-PmTRIAP1 3'UTR-MUT和miR-145-PmTRIAP1 3'UTR-MUT)。
质粒转染细胞。将293T细胞以70%的汇合度接种到96孔板中，24 h后转染萤光素酶报告基因质粒和RNA，每个样品设置6个复孔。96孔板转染质粒时每孔比例为萤火虫萤光素酶载体(Firefly)∶海肾萤光素酶载体 (Renilla)∶转染试剂=0.2 μg∶0.01 μg∶0.25 μL。配置miRNA和转染试剂稀释液，最终miRNA浓度为100 nmol·L−1，转染试剂每孔0.25 μL，常温孵育5 min，然后将稀释好的DNA和miRNA分别与转染试剂混匀，常温孵育20 min。每孔弃掉50 μL培养基，将25 μL DNA转染混合液和25 μL miRNA转染混合液分别添加到每孔细胞样品中。转染6 h后更换新鲜完全培养基。
双报告基因检测。质粒共转染48 h后，弃去培养基，用100 μL 1×100 PBS洗涤96孔板，吸干剩余的PBS。5×PLB (passive lysis buffer)用去离子水稀释成1×PLB，使用前置于常温。每孔加50 μL稀释好的1×PLB，摇床常温条件下摇15 min，进行裂解。白色不透光的96孔酶标板中每孔加入上述的10 μL上清液。在每个孔中加入100 μL预混合的LARⅡ(用Luciferase Assay Buffer溶解冻干粉Luciferase Assay substrate存于−20 ℃)，2 s后测数据。每孔加入100 μL预混合的Stop Glo & Reagent，静止2 s后测数据。
统计学分析。通过GraphPad Prism (Version 5，GraphPad Software)作图，并进行双侧t检验。
2. 结果
2.1 PmTRIAP1基因的分子特征和系统发育分析
通过SMART RACE技术，克隆获得斑节对虾PmTRIAP1基因cDNA全长(GenBank accession No. MK314973，图1)。PmTRIAP1 cDNA全长2 522 bp，含有11 bp的5'UTR、2 289 bp的3'UTR和222 bp的ORF，编码71个氨基酸，理论分子量为8.6 kD，理论等电点(PI)为4.9。
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图 1 PmTRIAP1的核酸和氨基酸序列上方为核苷酸序列，下方为氨基酸序列；起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)用方框标出；倾斜加粗部分为加尾信号(AATAAA)Fig. 1 Nucleotide and deduced amino acid sequences of PmTRIAP1The nucleotide sequence is listed above, and the amino acid sequence is listed below. The initiation code (ATG) and the termination code (TAG) are boxed. The polyadenylation signal sequence (AATAAA) is in italic and bold.多重序列比对结果显示，PmTRIAP1氨基酸序列与其他物种中的TRIAP1氨基酸序列相比有着较高的保守性。其中，PmTRIAP1与柑橘木虱(Diaphorina citri) TRIAP1的相似度最高(61%)，其他相似性较高的物种有墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus) 56%和家鸡(Gallus gallus) 51% (图2)。
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图 2 PmTRIAP1和其他物种TRIAP1氨基酸序列多重比对Fig. 2 Multiple alignment of deduced amino acid sequences of TRIAP1 from P. monodon and other speciesNCBI下载13个不同物种的TRIAP1序列与PmTRIAP1构建进化树，结果显示斑节对虾单独聚为一支 (图3)。
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图 3 基于PmTRIAP1氨基酸序列的NJ系统进化树Fig. 3 NJ phylogenetic tree based on PmTRIAP1 amino acid sequences2.2 PmTRIAP1的组织表达分析
qRT-PCR测定PmTRIAP1在11种组织中的表达情况(图4)。结果显示PmTRIAP1在11种组织中均有表达。血细胞中表达量最高，肝胰腺和肠中表达量较高，胸神经中表达量最低。
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图 4 PmTRIAP1在各个组织中的相对表达量图中值为平均值±标准差(n=3)；不同字母表示差异显著(P<0.05)Fig. 4 Relative expression of PmTRIAP1 in different tissuesValues are shown as $ \overline X $±SD (n=3). Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).2.3 哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1的表达分析
在血细胞中，哈氏弧菌刺激后，PmTRIAP1表达量在前6 h无显著变化，第24小时显著降低，第48小时降至最低水平，第72小时有所回升但仍显著低于对照组水平(图5-A)。在肝胰腺中，哈氏弧菌刺激后PmTRIAP1的表达水平一直低于磷酸缓冲盐组，第6小时表达无显著变化，第24小时表达显著降低，第48小时降到最低，第72小时明显回升，与第0小时相比无显著差异 (图5-B)。
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图 5 哈氏弧菌注射后PmTRIAP1在血细胞 (A) 和肝胰腺 (B) 中的相对表达量图中值为平均值±标准差(n=3)；*. 显著性差异(P<0.05)；图6同此Fig. 5 Relative expression levels of PmTRIAP1 in hemocyte (A) and hepatopancreas (B) after V. harveyi challengeValues are shown as $ \overline X $±SD (n=3); *. significant difference (P<0.05); the same case in Fig.6.2.4 初步筛选出靶向调节PmTRIAP1的miRNAs
Targetscan、miRanda和Mireap分别筛选靶向调控PmTRIAP1的miRNAs。经3个软件联合预测、筛选，获得2个潜在调控PmTRIAP1的miRNAs (表2)。
表 2 Targetscan、miRanda和Mireap筛选出2个miRNAsTable 2 Two miRNAs screened by Targetscan，miRanda and MireapmiRNA名称 miRNA name 序列 (5'−3') sequence Pm-miR-145-3p GGATTCCTGGAAATACTGTTCT Pm-miR-454-3p TAGTGCAATATTGCTAATAGGCT 通过1.2.6的哈氏弧菌刺激实验检测了血细胞中感染哈氏弧菌后2种miRNAs的表达模式。qRT-PCR结果显示Pm-miR-454-3p和Pm-miR-145-3p的表达水平在第6、第24、第48、第72小时均显著上调 (图6)。
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图 6 哈氏弧菌注射后Pm-miR-145-3p (A) 和Pm-miR-454-3p (B) 在血细胞中的相对表达量Fig. 6 Relative expression level of Pm-miR-145-3p (A) and Pm-miR-454-3p (B) in hemocyte after V. harveyi challenge2.5 双荧光素酶报告基因检测
为进一步验证Pm-miR-454-3p和Pm-miR-145-3p对PmTRIAP1的靶向调控作用，分别根据预测的Pm-miR-454-3p (图7-A)和Pm-miR-145-3p (图7-B)的调控位点开展双荧光素报告实验。
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图 7 Pm-miR-454-3p和Pm-miR-145-3p与靶基因PmTRIAP1 3'-UTR结合位点序列信息A. PmTRIAP1 3'-UTR和Pm-miR-454-3p；B. PmTRIAP1 3'-UTR和Pm-miR-145-3pFig. 7 Sequence information of binding and mutant sites of each miRNA at 3'-UTR of target genesA. 3'-UTR of PmTRIAP1 and Pm-miR-454-3p; B. 3'-UTR of PmTRIAP1 and Pm-miR-145-3p双荧光素酶报告实验结果表明，构建的野生型报告质粒miR-145-PmTRIAP1 3'UTR-WT的荧光素酶活性受到Pm-miR-145-3p类似物(agomir-145)的抑制作用，活性大约为对照组miR-145-PmTRIAP1 3'UTR-MUT+agomir NC的76% (P=0.004 7)，实验组miR-145-PmTRIAP1 3'UTR-WT+agomir NC和miR-145-PmTRIAP1 3'UTR-MUT+agomir-145均未检测到明显活性变化(图8-A)。构建的野生型报告质粒miR-454-PmTRIAP1 3'UTR-WT的荧光素酶活性受到Pm-miR-454-3p类似物(agomir-454)的抑制作用，活性大约为对照组miR-454-PmTRIAP1 3'UTR-MUT+agomir NC的43% (P=0.042 6)，实验组miR-454-PmTRIAP1 3'UTR-WT+agomir NC和miR-454-PmTRIAP1 3'UTR-MUT+agomir-454均未检测到明显的活性变化(图8-B)。
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图 8 miRNAs与靶基因PmTRIAP1间互作关系的双荧光素报告验证实验A. PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p之间互作关系；B. PmTRIAP1和Pm-miR-454-3p之间互作关系Fig. 8 Interaction between miRNAs and PmTRIAP1 validated by dual-luciferase reporter assaysA. interaction of PmTRIAP1 and Pm-miR-145-3p; B. interaction of PmTRIAP1 and Pm-miR-454-3p3. 讨论
斑节对虾是华南和东南亚最具商业价值的水产养殖物种之一。目前，弧菌等病害频发给对虾养殖产业造成了巨大的经济损失，与抵御弧菌入侵相关的分子调控机制也尚未清晰。本研究拟通过对斑节对虾TRIAP1基因与弧菌刺激之间的关联性研究，为解析斑节对虾抵御弧菌入侵的分子机制提供一定理论基础。
本研究成功克隆获得斑节对虾PmTRIAP1 cDNA全长序列，并对PmTRIAP1在斑节对虾各组织中的表达分布规律进行了探究。由于PmTRIAP1在与斑节对虾生殖调控密切相关的卵巢组织、与免疫相关的血淋巴组织、与生长相关的肌肉组织等各待测组织中均有广泛表达，预示该基因在斑节对虾体内可能参与调控多种不同的生理过程。PmTRIAP1的表达量在血细胞中最高，肝胰腺中次之。已有研究表明血细胞在免疫中扮演重要角色，肝胰腺是对虾非特异性免疫组织，也是重要的解毒器官，在应激反应中发挥重要[17-18]，进而初步说明PmTRIAP1可能参与了斑节对虾的免疫调控过程[19]。有鉴于此，本实验选取了肝胰腺和血细胞作为研究对象，对哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1以及可能调控PmTRIAP1的miRNAs的表达变化情况进行了探究。
哈氏弧菌是水产养殖中十分常见的条件致病菌，在海洋环境中广泛存在，能够引发水生动物大规模的疾病爆发[20]。研究表明哈氏弧菌感染能引发细胞凋亡，例如，Li等[21]发现哈氏弧菌可导致日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)复发性疾病爆发并诱导宿主细胞凋亡。TRIAP1作为一种细胞凋亡抑制因子，TRIAP1基因的表达水平对于细胞凋亡的调控至关重要。例如，Potting等[3]发现TRIAP1蛋白阻止细胞凋亡的发生；Fook-Alves等[2]发现在鼻咽喉癌细胞中TRIAP1基因的沉默导致了细胞凋亡增加。本研究发现，在哈氏弧菌刺激下，肝胰腺中PmTRIAP1的表达量在前6 h内无明显变化，第24小时表达水平显著降低，而在第72小时PmTRIAP1表达量与对照组却没有明显差异(图5-B)；在血细胞中，PmTRIAP1表达规律与在肝胰腺中的基本相似，不同的是，在第72小时PmTRIAP1的表达量仍然显著低于对照组(图5-A)。本研究结果进一步证明了PmTRIAP1基因的表达水平与哈氏弧菌感染之间存在显著的关联性，并推断哈氏弧菌感染后，斑节对虾能通过降低自身PmTRIAP1的表达来促进细胞凋亡的发生，进而实现对哈氏弧菌的抵御功能。
生物体内，miRNA通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同，指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。例如，Zhang等[22]研究发现在灿烂弧菌(V. splendidus)感染仿刺参时，miR-137呈现下调趋势，而其靶基因AjBHMT呈现上调趋势；Huang和Zhang[23]研究发现，在对虾白斑综合症病毒 (white spot syndrome virus, WSSV)侵染对虾时，机体内miR-7显著上调，而WSSV病毒的早期基因wsv-477显著下调；Li等[24]发现在鼻咽喉癌细胞中，miR-320b的下调可介导TRIAP1过表达。本实验利用生物信息学软件分析筛选出了可能靶向调控PmTRIAP1的2个miRNAs，并研究了哈氏弧菌刺激后2个miRNAs的表达变化情况。结果表明，在哈氏弧菌刺激24 h后，Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量均显著升高(图6)，而PmTRIAP1表达量显著降低，表明PmTRIAP1可能是Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p的靶基因(图5)。为了进一步证明Pm-miR-145-3p与Pm-miR-454-3p可以靶向调控PmTRIAP1的表达，对其进行了双荧光素酶报告检测实验。结果显示，Pm-miR-145-3p显著降低了含有PmTRIAP1 3'UTR的荧光素酶活性，表明Pm-miR-145-3p可以靶向调控PmTRIAP1。
综上，本研究克隆了PmTRIAP1基因cDNA全长，探究了在哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1 mRNA和相关miRNAs的表达变化情况。在哈氏弧菌刺激下，PmTRIAP1 mRNA表达量显著降低，Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高，说明了PmTRIAP1基因、Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p都参与了斑节对虾抵御哈氏弧菌的应激反应。研究发现，PmTRIAP1和2个miRNAs的表达变化规律呈负相关，结合双荧光素酶报告实验，进一步推测出Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p靶向调控PmTRIAP1，进而对哈氏弧菌刺激做出应答。本实验为深入探究斑节对虾在抵御细菌感染时，先天免疫调节机制的激活提供了参考。
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图 1 不同光周期处理对斑马鱼卵巢中tgfb1a (a)、tgfb1b (b)、tgfb2 (c)和tgfb3 (d) mRNA表达的影响
图中值为平均值±标准误 (n=5)；不同的小写字母表示同一时间点不同光周期间差异显著 (P<0.05)，不同的大写字母表示同一光周期不同时间点间差异显著 (P<0.05)；后图同此
Figure 1. Effects of different photoperiods on ovarian tgfb1a (a), tgfb1b (b), tgfb2 (c) and tgfb3 (d) mRNA levels in zebrafish
The values are the $\overline {{X}}\pm {\rm SE}$ (n=5). Different lowercase and uppercase letters indicate significant difference in different photoperiods at the same time and in the same photoperiod at different time, respectively (P<0.05). The same case in the following figures.
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图 2 不同光周期处理对斑马鱼卵巢中tgfbr2a (a)、tgfbr2b (b)、tgfbr1a (c)和tgfbr1b (d) mRNA表达的影响
Figure 2. Effects of different photoperiods on ovarian tgfbr2a (a), tgfbr2b (b), tgfbr1a (c) and tgfbr1b (d) mRNA expression levels in zebrafish
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图 3 不同光周期处理对斑马鱼卵巢中smad2 (a)、smad3a (b) 和smad3b (c) mRNA表达的影响
Figure 3. Effects of different photoperiods on ovary smad2 (a), smad3a (b) and smad3b (c) mRNA levels in zebrafish
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图 4 不同光周期处理对p-Smad2在斑马鱼卵巢中定位的影响
PV. 卵黄发生前期 (<0.25 mm)；EV. 卵黄发生早期 (<0.35 mm )；MV. 卵黄发生中期 (<0.45 mm)；FG. 充分生长未成熟期 (<0.65 mm)；黑色箭头代表阳性信号区域；bar=200 μm
Figure 4. Effects of different photoperiods on localization of p-Smad2 in zebrafish ovary
PV. previtellogenic (<0.25 mm); EV. early vitellogenic (<0.35 mm); MV. midvitellogenic (<0.45 mm); FG. full-grown immature stage (<0.65 mm); the black arrow represents the positive signal region; bar=200 μm
表 1 实时荧光定量PCR所用引物序列
Table 1 Primer sequences used for quantitative real-time PCR
基因
gene引物序列 (5'−3')
primer sequenceGenBank登录号
GenBank accession No.ef1a[16] F: GGCTGACTGTGCTGTGCTGATTG NM_131263 R: CAGACTTGTGGCAGGTGTAA tgfb1a F: TGTACCCGCAATCCTTGACC NM_182873.1 R: CCGACTGAGAAATCGAGCCA tgfb1b F: ATAGCAGGTTTGTCCCGCAA XM_687246.8 R: ATAGGAGCAAGAGCCAGTGC tgfb2 F: CAACAGCAAAGTGGTTCGCA NM_194385.1 R: AATGTGGAGACTGACCGCTG tgfb3 F: GGACCGAGCAGAGAATCGAG NM_194386.2 R: CGTCGAAGGAAACCCACTCA tgfbr2a F: ATGTCTGCTCTTCTCCGCAC XM_009293931.3 R: AGCATCGGCTTTAGTGGGTC tgfbr2b F: TCACGTCCAGATGTAACGCC NM_182855.3 R: CAGTTTGTCCAGGTCGTCGT tgfbr1a F: GTGTCAATCGGTCGTGCAAC NM_001037683.2 R: CACACAGATGGGGACAGCAA tgfbr1b F: GAGTCGGCACCAAACGGTAT NM_001115059.1 R: CTGCCATCTGTTGGGGATGT smad2 F: AAGTCTGCGTCAATCCCTACCACT NM_001290015.1 R: TAGTCGTCCAAAGGTGGCAACTCA smad3a F: CAAACCTGTCACCGAACCCT NM_131571.2 R: GCAGTCCGAGACAAAAACGC smad3b F: TGGACACAGGTTCTCCAACG NM_175083.2 R: TGGAAAGTCTCACCGACACG 
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