Cloning, expression analysis of TRIAP1 and its related miRNAs screening in Penaeus monodon
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摘要:
凋亡抑制因子1 (tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)可以通过抑制细胞凋亡参与生物体内应激反应。为探究TRIAP1基因及调控其表达的miRNAs在斑节对虾 (Penaeus monodon) 应对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激时的表达调控情况，该研究通过RACE技术获得了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)cDNA全长序列，并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术，对PmTRIAP1在斑节对虾不同组织中的表达分布模式，以及哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1与相关miRNAs的表达关联情况进行了探究。结果显示，PmTRIAP1 cDNA全长2 522 bp，包括11 bp的5'非编码区(UTR)、2 289 bp的3'UTR和222 bp的开放阅读框(ORF)，共编码73个氨基酸。PmTRIAP1基因在各组织中均有表达，其中在血细胞中表达量最高；哈氏弧菌刺激下，PmTRIAP1表达量显著降低，而Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高，表明PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p的表达量呈负相关关系；双荧光素酶报告实验结果显示，Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p可通过结合PmTRIAP1 3'UTR降低荧光素酶活性，表明Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p均可靶向调控PmTRIAP1的表达。
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关键词:
- 斑节对虾 /
- TRIAP1 /
- Pm-miR-145-3p /
- Pm-miR-454-3p /
- 哈氏弧菌
Abstract:TRIAP1 can participate in vivo responses by inhibiting apoptosis. In order to analyze the expression regulation of TRIAP1 and miRNAs that regulate TRIAP1's expression under Vibrio harveyi challenge in Penaeus monodon, we obtained the P. monodon TRIAP1 gene (PmTRIAP1) cDNA by RACE, then detected the tissue distribution of PmTRIAP1 by quantitative real-time PCR (qRT-PCR), and investigated the expression association between PmTRIAP1 and its related miRNAs under V. harveyi challenge. The results show that the full-length PmTRIAP1 cDNA sequence was 2 522 bp, containing an 11 bp 5' non-coding region (UTR), a 2 289 bp 3'-UTR and a 222 bp open reading frame encoding 73 amino acids. The qRT-PCR analysis shows that PmTRIAP1 was ubiquitously expressed in all the tested tissues and the highest expression level was obtained in hemocyte. The expression of PmTRIAP1 decreased significantly; however, the expressions of Pm-miR-145-3p and Pm-miR-454-3p increased significantly under V. harveyi challenge, which suggests that the expression levels of PmTRIAP1 and Pm-miR-145-3p, Pm-miR-454-3p were negatively correlated. Dual luciferase reporter assay shows that Pm-miR-145-3p and Pm-miR-454-3p can bind PmTRIAP1 3'UTR to reduce luciferase activity. It is suggested that both Pm-miR-145-3p and Pm-miR-454-3p can target regulate the expression of PmTRIAP1.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- TRIAP1 /
- Pm-miR-145-3p /
- Pm-miR-454-3p /
- Vibrio harveyi
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大型底栖动物是海洋环境的重要生态群落，是海洋生态系统能量流动和物质循环的关键环节[1]。大型底栖动物具有行动缓慢、迁徙能力有限、容易受各种环境因素影响的特点，其群落结构和营养结构的变化能够准确反映出所处生境的长期变化[2]，因而常被作为海洋生态环境监测与评价的重要指示生物[3-4]。
江门市位于广东省中南部，珠江三角洲西侧，是粤港澳大湾区西岸门户，拥有大小海岛561个，数量位居广东省第二[5]。江门海域邻接珠江口，是典型的河口岛屿复合海洋生态系统，主要包括黄茅海、广海湾、镇海湾和川岛海域，生境复杂，渔业资源丰富，是多种海洋生物的主要栖息地、产卵场和索饵场[6-7]，是上、下川岛中国龙虾 (Panulirus stimpsoni) 国家级水产种质资源保护区与江门中华白海豚 (Sousa chinensis) 省级自然保护区的所在地[8-10]。随着江门工商业的蓬勃发展，海洋开发与捕捞强度持续加大，导致海域污染日渐加剧，渔业资源逐步退化[11-13]，亟需科学有效的海洋生态系统监测和评价指标，以客观地反映该生态系统的演化趋势，优化生态系统管理，促进系统修复。
大型底栖动物数量与生物多样性信息是极具发展前景的生态监测和评价指标[14-15]。目前对江门近岸海域大型底栖动物的研究鲜见报道，只有覃超梅等[5]对该海域2016年春季大型底栖动物的种类组成进行了调查。大型底栖动物信息的缺失严重阻碍了该海域生态监测和调控工作的深入开展。因此本研究于2016年在江门海域进行了4个季节的调查，对该海域大型底栖动物群落结构和多样性特征进行了分析，以期为江门近岸海域生态系统管理和生物资源的可持续利用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 调查区域与时间
于2016年1月18—23日 (冬季)、4月6—11日 (春季)、8月9—12日 (夏季) 和10月25—28日 (秋季)在江门近岸海域进行了4个航次的生态学调查。分别于湾外 (A5、A6、A9和A10) 和湾内 (A1、A2、A3、A4、A7和A8) 设置10个采样站位 (112°24'20''E—113°05'30''E、21°40'30''N—22°20'10''N，图1)。由于天气条件、技术、时间安排问题，极少数站位 (夏季的A9、A10和冬季的A6) 未能全年采样。
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图 1 江门近岸海域大型底栖动物采样站位分布Figure 1. Sampling site of macrobenthos in coastal waters of Jiangmen1.2 样品采集与处理
样品采集及分析测试等均按照《海洋监测规范》 (GB 17378—2007和GB 17378.4—2007) 进行。使用抓斗式采器，每站取样2次，合并为1个样品，每站取表层沉积物0.1 m2，之后使用双层套筛分选其中的大型底栖动物 (上层孔径为1.0 mm，下层为0.5 mm)，获得的动物样品用4%甲醛溶液固定后带回实验室进行种类鉴定、个体计数和称质量。同时，使用便携式温盐测深仪 (YSI维赛ProPlus) 现场测定各站位表、底层海水温度、盐度、pH、溶解氧等水质因子，叶绿素a通过采水后用孔径为0.45 μm的醋酸纤维滤膜过滤后冷冻，带回实验室经丙酮萃取后使用荧光计 (Turner-Design 10)测定，采集各站位水样带回实验室测定化学指标包括悬浮物、亚硝酸盐氮 (NO2-N)、磷酸盐 (PO4) 等指标。
1.3 数据处理与分析
调查站位图采用Surfer 12.0软件绘制，使用Excel 2010软件进行原始数据录入和整理，并统计栖息密度、生物量、优势度、种类更替率，计算Shannon-Wiener指数 (H′)、Pielou均匀度 (J' )、丰富度指数(D)，底栖动物H'、J′和D指数计算公式[16]为：
$$ H' = - \sum {\left( {{n_i}/N} \right)} \times {\log _2}\left( {{n_i}/N} \right) $$ (1) $$ J' = H'/\ln S $$ (2) $$ D = \left( {S - 1} \right)/{{\rm log}_2}N $$ (3) 式中N是所有物种的个体总数，ni表示第i个物种的个体数，S是物种的数目 (种数)。其中大型底栖动物的H′可用于评价海域的受污染程度，当H′<1 说明水质重度污染；H′=1~2 为中度污染；H′=2~3 为轻度污染；H′ > 3 为轻度污染至无污染[17-18]。
使用双因素方差分析以探讨该海域大型底栖动物对栖息密度、生物量、生物多样性参数的时空差异。优势种依公式Y=ƒi×Pi计算[19]，式中Y为优势度，ƒi为i种在采样点中出现频率，Pi为i种在总数量中的比例。将Y>0.02的种类确定为优势种。并计算种类更替率 (R)[20]，R值越大，更替种类数越多，表明群落稳定性越小，公式为：R=[(a+b−2c)/(a+b−c)]×100，式中a与b分别为相邻2个季节的种数，c为相邻2个季节共同的种数。
利用PRIMER 6.0软件输入丰度和生物量数据绘制ABC曲线分析群落稳定性，通过比较丰度和生物量来分析大型底栖动物群落受污染或其他因素扰动的状况。当W逐渐接近1时，表示群落生物量优势逐渐被单一物种统治，但各物种的丰富度趋于相同，群落稳定性越高；当W逐渐趋近于−1时，情况相反，群落稳定性越低。若丰度曲线位于生物量曲线之下，代表群落未受干扰；若丰度曲线位于生物量曲线之上，代表群落受到严重干扰；若丰度曲线与生物量曲线重叠或交叉，代表群落受到中等程度干扰[21]。将底栖软体动物丰度和生物量矩阵四次方根转化后，进行等级聚类分析 (CLUSTER)、非度量多维尺度分析 (NMDS)、生物-环境 (BIOENV)和相关性检验 (RELATE)以分析大型底栖动物在该海域的群落结构和环境因子与群落的相关性等规律性变化。
2. 结果
2.1 底栖动物物种组成及群落类型
2.1.1 物种组成
4次调查共采集到大型底栖动物9门56种，其中软体动物门21种，占总种类数的37.5%；环节动物门18种，占总种类数的32.1%；节肢动物门7种，占12.5%；棘皮动物门3种，纽形动物门2种，腔肠动物门2种，星虫动物门1种，脊索动物门1种和螠虫动物门1种 (表1)。
表 1 江门近岸海域底栖动物种类组成与分布Table 1. Composition and distribution of benthic species in Jiangmen coastal waters种类
Species采样站位 Sampling site A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 环节动物门 Annelida 膜质伪才女虫 Pseudopolydora kempi + + + + + + + + + 中华内卷齿蚕 Aglaophamus sinersis + + + + + + + + 背蚓虫 Notomastus latericeus + + + + + + + 双齿围沙蚕 Perinereis aibuhitensis + + + + + + 不倒翁虫 Sternaspis scutata + + + + + + 小头虫 Capitella capitata + + + + 长吻沙蚕 Glycere chirori + + + + 持真节虫 Euclymene annandalei + + + + 梳鳃虫 Terebellides stroemii + + + + 白色吻沙蚕 Glycera alba + + + + 厚鳃蚕 Dasybranchus caducus + + 独齿围沙蚕 Perinereis cultriferea + + 角海蛹 Ophelina acuminate + + 弦毛内卷齿蚕 Aglaophamus lyrochaeto + 海毛虫 Chloeia flava + 背毛背蚓虫 Notomastus cf. aberans + 多齿围沙蚕 Perinereis nuntia + 异足索沙蚕 Lumbrineris heteropoda + 软体动物门 Mollusca 肋䗉螺 Umbonium coatatum + + + + + + + 棒锥螺 Turritella bacillum + + + + + + 小亮樱蛤 Nitidotellina minuta + + + + + 辐射荚蛏 Siliqua radiata + + + + 光滑河蓝蛤 Potamocorbula laevis + + 毛蚶 Scapharca subcrenata + 橄榄胡桃蛤 Nucula paulula + 线纹玉螺 Natica lineata + 大角贝 Dentalium vernedei + 小刀蛏 Cultellus attenustus + 斜纹甲克蛤 Jactellina obliquistriata + 红带织纹螺 Nassarius succinctus + + + 假奈拟塔螺 Turricula nelliae spurious + 钻螺 Terebellum terebellum + + + 白龙骨乐飞螺 Lophiotoma leucotropis + + 粗帝汶蛤 Timoclea scabra + + 日本镜蛤 Dosinia japonica + + 小荚蛏 Siliqua minima + + 波纹巴非蛤 Paphia undulata + 鳞杓拿蛤 Anomalodiscus squamosa + 文雅蛙螺 Bursa elegans + 西格织纹螺 Nassarius siquinjorensis + 节肢动物门 Arthropoda 裸盲蟹 Typhlocarcinus mudus + + + + + 钩虾 Elasmopus + + + 宽腿巴豆蟹 Pinnixa penultipedalis + + 小巧毛刺蟹 Pilumnus minutus + 日本鼓虾 Alpheus japonicus + 毛盲蟹 Typhlocarcinus villosus + 棘皮动物门 Echinodermata 光滑倍棘蛇尾 Amphioplus laevis + + + + + + 棘刺锚参 Protankyra bidentata + + 花蜒蛇尾 Ophionereis variegata + 纽形动物门 Nemertea 无沟纽虫 Baseodiscus + + + + + + 孔纽虫 Amphiporus + 腔肠动物门 Coelentera 纵条矶海葵 Haliplanella luciae + 东方角海葵 Cerianthus orientalis + 螠虫动物门 Echiura 短吻铲荚螠 Listriolobus brevirostris + + + + + + + 星虫动物门 Sipuncula 可口革囊星虫 Phascolosoma esculenta + + + + 脊索动物门 Chordata 凤鲚 Coilia mystus + 注： +. 调查中出现的种 Note: +. The species that appeared in this survey 秋季共采集到30种，其次是春季28种，夏季和冬季均为25种 (图2)。各季大型底栖动物种类组成基本以环节动物为主，软体动物次之，节肢动物第三。江门近岸海域四季的大型底栖动物种类更替率分别为：春季-夏季66.67%，夏季-秋季69.05%，秋季-冬季60.53%，冬季-春季61.54%，平均季节更替率64.44%，表明该海域大型底栖动物种类季节性差异明显，在夏秋季间种类更替最为明显，春夏季间次之。
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图 2 江门近岸海域大型底栖动物各类群物种数季节变化Figure 2. Seasonal variation of species of macrobenthos in Jiangmen coastal waters江门近岸海域大型底栖生物在4个航次调查中共出现12种优势种，结果显示该海域四季的第一优势种不完全相同。除秋冬季均为膜质伪才女虫 (Pseudopolydora kempi) 外，春季为光滑倍棘蛇尾 (Amphioplus laevis)，夏季为棒锥螺 (Turritella bacillum) (表2)。
表 2 江门近岸海域大型底栖动物各季节优势种组成Table 2. Dominant species of macrobenthos in Jiangmen coastal waters春季 Spring 夏季 Summer 秋季 Autumn 冬季 Winter 物种
Species优势度
指数
Y物种
Species优势度
指数
Y物种
Species优势度
指数
Y物种
Species优势度
指数
Y光滑倍棘蛇尾
Amphioplus laevis0.072 棒锥螺
Turritella bacillum0.054 膜质伪才女虫Pseudopolydora kempi 0.254 膜质伪才女虫Pseudopolydora kempi 0.053 背蚓虫
Notomastus latericeus Sars0.036 中华内卷齿蚕
Aglaophamus sinersis0.050 中华内卷齿蚕
Aglaophamus sinersis0.143 光滑河蓝蛤
Potamocorbula laevis0.046 无沟纽虫
Baseodiscus sp.0.033 膜质伪才女虫
Pseudopolydora kempi0.045 短吻铲荚螠
Listriolobus brevirostris0.029 小头虫
Capitella capitata0.034 中华内卷齿蚕
Aglaophamus sinersis0.029 短吻铲荚螠
Listriolobus brevirostris0.032 无沟纽虫
Baseodiscus sp.0.029 肋䗉螺
Umbonium coatatum0.026 中华内卷齿蚕
Aglaophamus sinersis0.028 2.1.2 群落类型
CLUSTER分析与NMDS分析结果表明 (图3)，该海域大型底栖动物可以划分为2个群落。群落Ⅰ，位于西江入海口A1站；群落Ⅱ，位于江门西江入海口其他海域。MDS分析的胁迫系数stress为0.19，对反映样本间的群落关系具有一定的解释意义。ANOSIM检验分析表明，各群落间的差异显著 (R=0.64, P<0.05)。
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图 3 江门近岸海域大型底栖动物群落的聚类分析和非度量多维尺度分析Figure 3. Cluster analysis and non-metric multidimensional scaling analysis of macrobenthos in Jiangmen coastal waters2.2 密度和生物量的时空变化
江门近岸海域四季大型底栖生物栖息密度介于10~920个·m−2，平均155.14个·m−2。各季平均栖息密度由大到小为：秋季>夏季>春季>冬季，分别为218、138.75、138和118.89个·m−2；生物量介于0.2~267.7 g·m−2，均值为43.13 g·m−2，各季平均生物量由大到小为：夏季>秋季>春季>冬季，分别为59.76、50.45、44.41和17.89 g·m−2。双因素方差分析结果显示，栖息密度季节性间 (P=0.933>0.05)差异和站位间 (P=0.174>0.05) 差异不显著，生物量季节间 (P=0.584>0.05)和站位间 (P=0.651>0.05) 差异不显著。
各季节底栖动物类群栖息密度存在一定差异。水平分布总体呈现湾内低于湾外；冬季湾内栖息密度略高于湾外，其余各季节湾内均低于湾外。春季湾外、湾内以及秋季湾内主要构成类群相似，均为环节动物、软体动物和棘皮动物。其余各季湾内外环节动物、软体动物占比较高；夏季，湾内栖息密度接近湾外，主要构成类群相似，主要由环节动物、软体动物构成；单因素方差分析结果显示，栖息密度湾内外差异不显著 (P=0.136>0.05)。
各季节底栖动物各类群生物量分布也存在一定差异，由于各类群个体大小差异，生物量分布与栖息密度较为不同，春夏两季湾内生物量略低于湾外，秋冬两季湾内生物量略高于湾内。春季湾内以软体动物为主，湾外以棘皮动物和螠虫动物为主；夏季湾内外生物量组成相似，以软体动物和螠虫动物生物量较高：秋季湾内生物量略高于湾外，湾外内生物量以软体动物为主；冬季生物量湾内外接近，湾内主要为软体动物，湾外主要为腔肠动物和软体动物生物量较高。单因素方差分析结果显示，生物量湾内外差异不显著 (P=0.652>0.05)。
2.3 大型底栖动物生物多样性时空变化。
该海域大型底栖生物H′、J′和D变化分别介于1.18~1.68，0.78~0.93和1.41~2.20。H′、J′和D整体表现出相同的季节变化趋势：春季>夏季、秋季>冬季。单因素方差分析表明，D (P=0.081>0.05)、J′ (P=0.098>0.05)和H′ (P=0.058>0.05) 不同季度间差异均不显著 (图4)。
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图 4 江门近岸海域大型底栖动物多样性指数季节变动Figure 4. Seasonal variation of macrobenthos diversity index in Jiangmen coastal watersABC曲线显示，春季生物量曲线位于丰度曲线上方，但生物量曲线起始点较低，顶端与丰度曲线重叠 (W=0.144)，表明春季大型底栖动物群落受到中等程度干扰；秋季生物量曲线与丰度曲线交叉2次 (W=0.056)，表明该海域秋季大型底栖动物群落明显受到中等程度干扰且稳定性差。夏、冬季生物量曲线位于丰度曲线上方，且生物量曲线起点较高(W分别为0.420、0.286)，表明该海域夏、冬季大型底栖动物群落相对稳定 (图5)。ABC曲线评价表明，该海域群落整体稳定性一般，夏、冬季大型底栖动物群落受干扰不明显、春、秋季大型底栖动物群落受到一定程度的干扰，稳定性较弱。
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图 5 江门近岸海域大型底栖生物群落ABC曲线Figure 5. ABC plots of macrobenthic communities in Jiangmen coastal waters2.4 底栖动物与理化因子相关性分析
RELATE分析表明，该海域大型底栖动物栖息密度与环境因子的相关系数达到显著正相关水平 (R=0.337, P<0.05)。综合各环境因子，与群落的栖息密度进行BIOENV分析得出的各环境因子与大型底栖动物的相关关系中，相关系数最高的环境因子为盐度 (ρ=0.246)，其次为水深 (ρ=0.183)，这两者与温度 (ρ=0.120)和PO4 3− (ρ=0.108) 共同构成影响该海域大型底栖生物群落结构的最优环境因子组合 (总相关性0.363，表3)。
表 3 江门近岸海域底栖动物栖息密度与 环境因子的生物-环境分析Table 3. BIOENV analysis of macrobenthos density and environmental factors环境因子组合
Environmental factor相关系数 ρ
Correlation coefficient ρ盐度 Salinity 0.246 水深 Water depth 0.183 透明 Transparency 0.155 溶解氧 Dissolved oxygen 0.134 温度 Temperature 0.120 磷酸盐 Phosphate 0.108 亚硝酸盐 Nitrite 0.053 酸碱度 pH 0.051 悬浮物 Suspended matter 0.025 最大相关性
Maximum correlation水深，温度，盐度，磷酸盐
0.3633. 讨论
3.1 群落结构
本研究4次调查共采集到大型底栖动物56种。由于未见江门近岸海域相关历史调查资料，无法获得其时间差异信息。仅有覃超梅等[5]与本研究同年 (2016年) 对该海域春季大型底栖动物进行了调查，结果共获得大型底栖动物16种。本研究春季获得27种，明显多于覃超梅等的调查。覃超梅等[5]均沿海岸线布置站位，站位离岸距离较近，不能完全反映江门近岸海域整体情况。而本研究站位涵盖江门整个近岸海域，离岸距离较远，因此获得的大型底栖动物种类更为丰富。与周边海域的调查结果相对比，彭松耀等[22]2015年在珠江口海域采获67种大型底栖动物，多于本研究，这可能与各研究采样强度和采样方式不同有关。
大型底栖动物的H′被广泛应用于检测海洋底栖生物群落结构的变化情况和海域污染程度评价[23-25]。江门近岸海域大型底栖生物H′的季节变化介于1.18~1.68，年均1.43，说明水质污染程度为中度污染。珠江口 (2015年) 大型底栖动物H′的季节变化介于1.11~1.81，年均1.475[22]，说明珠江口海域水质污染程度为中度污染。可见位于珠江口附近的海域H′差异较小，整体上表现为受到中度污染。ABC曲线分析也表明，该海域群落整体的稳定性一般，春、秋季大型底栖动物群落受到一定程度的干扰，稳定性较弱。A1站位构成的群落Ⅰ平均H′较低 (H′=0.28)，物种稀少 (仅5种)，主要由于该站位位于西江入海口之一，从崖门水道和虎跳门水道流出的径流约分流西江流量的11.2%[26]。大量的陆源污染物和生活污水从此排出[13]，加上航道繁忙，受人为干扰较多，容易受到严重污染。而群落Ⅱ包含除A1外另外9站位平均H′较高 (H′=1.6)，物种数量较高，这主要与该海域包含两个省级以上保护海域[9-10] [ 大襟岛以南周边海域为中华白海豚保护区所在地和上、下川岛中国龙虾 (Panulirus stimpsoni) 国家级水产种质资源保护区]受政府保护和监管力度大，海域面积广、水体交换能力较高[5]、受污染程度较小有关。本研究水域与珠江口[22]和长江口[24]等河口水域大型底栖动物的分布类似，均是湾内水域大型底栖动物的物种数远低于湾外水域。
对比江门近岸海域大型底栖动物优势种与覃超梅等[5]获得的春季优势种寡鳃齿吻沙蚕 ((Nephtys oligobranchia)、红刺尖稚虫 (Scoloplos rubra)、小头虫和光滑河蓝蛤发现，两者在春季无相同优势种，这可能与两研究的站位设置有关。覃超梅等[5]采集底栖动物总站位数的经纬度设置，仅有2个站位与本调查站位相似 (占本次调查站位数的20%)。调查发现优势种中膜质伪才女虫 (Pseudopolydora kempi)在除A1站位外所有采样点都有分布，中华内卷齿蚕 (Aglaophamus sinersis) 在除A1和A7站位外均有分布(图1)，两者属于江门近岸海域的广泛分布的优势种。底栖动物在5月生物量达到全年最高，这可能与繁殖期有关。5月为该海域大型底栖动物的盛卵期[26-27]，从而导致该海域各大型底栖动物数量达到年度高峰。秋季，许多新生个体进入到群落，促使底栖生物的栖息密度达到最高值，这也与该海域大型底栖动物种类四季更替率在夏秋季间数值最大的变化规律相契合。
3.2 底栖动物与环境因子分析
BIOENV分析表明，解释底栖动物群落丰度分布的最优环境因子组合为水深、温度、盐度和磷酸盐 (表2)。鉴于江门大型底栖动物可划分为两个群落，群落Ⅰ，位于西江入海口A1站；群落Ⅱ，位于江门西江入海口其他海域 (图3)。群落Ⅰ平均水深2.7 m，群落Ⅱ平均水深9.1 m，表明群落Ⅰ和Ⅱ可能受水深梯度的不同的影响。在水深越浅，离岸越近受人类活动干扰越大，不利于底栖动物的生存和生长[28]；而当海域水深增加，离岸距离变远，同时较高的初级生产力到达底部，为底栖动物提供营养物质，促进底栖动物的生长繁殖，进而形成空间上的群落划分。该海域大型底栖动物的栖息密度高值出现夏秋季节，这主要与海域季节性水温变化对底栖动物群落分布的影响有关。Cooper等[29]认为水温是影响底栖生物丰度的关键因子，在底栖生物的分布和生长中起关键性作用。在营养充足的条件下，当温度降低时，大型底栖动物的生长、发育受到抑制[30]。季节上江门海域冬季水体温度明显低于其他三季，而该季大型底栖动物栖息密度也明显低于其他三季。盐度和营养盐与底栖动物群落是影响底栖生物群落空间分布的主要因素[31]，江门海域底栖动物可划分为2个群落，可能是由于群落Ⅰ位于西江入海口黄茅海海域，流经江门市区的西江冲淡水及其携带的营养盐等物质[13]，造成该区域同群落Ⅱ所在的其他区域的盐度和营养盐相比变化较大。入海口大型底栖动物的物种分布随盐度梯度变化[32]，低盐度 (5~8) 海域的物种丰富度较低，而盐度30~40海域较高；周红等[33]对莱州湾的大型底栖动物研究发现，底栖动物对水层环境变化较为敏感，例如与富营养化有关的水体盐度增加会引起大型底栖动物群落结构的改变。因此，江门近岸海域大型底栖动物群落差异原因之一可能是其对水体盐度和营养盐的敏感性。
本研究中水深、温度、盐度和磷酸盐作为影响该海域底栖生物群落的最优组合，相关性系数略低 (0.363)，其群落结构可能受其他主要因素影响，如沉积物类型和捕食压力等。有研究表明沉积物类型与底栖生物群落类型密切相关[34]。每种沉积物类型支持着特定的底栖动物群落，而捕食压力能够动态调节群落结构和分布，不同生态位的海洋生物的季节性出现会对该海区的生物造成捕食压力的增加或降低[35-36]。
鉴于河口岛礁海域生境复杂，影响底栖动物群落的因素较多，且关于该海域的相关研究极为缺乏，因此需要对该海域进行长期定点调查，才能深刻阐明该海域环境因子和底栖动物群落结构间的关系。
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图 1 PmTRIAP1的核酸和氨基酸序列
上方为核苷酸序列，下方为氨基酸序列；起始密码子(ATG)和终止密码子(TAG)用方框标出；倾斜加粗部分为加尾信号(AATAAA)
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of PmTRIAP1
The nucleotide sequence is listed above, and the amino acid sequence is listed below. The initiation code (ATG) and the termination code (TAG) are boxed. The polyadenylation signal sequence (AATAAA) is in italic and bold.
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图 2 PmTRIAP1和其他物种TRIAP1氨基酸序列多重比对
Figure 2. Multiple alignment of deduced amino acid sequences of TRIAP1 from P. monodon and other species
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图 3 基于PmTRIAP1氨基酸序列的NJ系统进化树
Figure 3. NJ phylogenetic tree based on PmTRIAP1 amino acid sequences
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图 4 PmTRIAP1在各个组织中的相对表达量
图中值为平均值±标准差(n=3)；不同字母表示差异显著(P<0.05)
Figure 4. Relative expression of PmTRIAP1 in different tissues
Values are shown as $ \overline X $±SD (n=3). Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).
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图 5 哈氏弧菌注射后PmTRIAP1在血细胞 (A) 和肝胰腺 (B) 中的相对表达量
图中值为平均值±标准差(n=3)；*. 显著性差异(P<0.05)；图6同此
Figure 5. Relative expression levels of PmTRIAP1 in hemocyte (A) and hepatopancreas (B) after V. harveyi challenge
Values are shown as $ \overline X $±SD (n=3); *. significant difference (P<0.05); the same case in Fig.6.
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图 6 哈氏弧菌注射后Pm-miR-145-3p (A) 和Pm-miR-454-3p (B) 在血细胞中的相对表达量
Figure 6. Relative expression level of Pm-miR-145-3p (A) and Pm-miR-454-3p (B) in hemocyte after V. harveyi challenge
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图 7 Pm-miR-454-3p和Pm-miR-145-3p与靶基因PmTRIAP1 3'-UTR结合位点序列信息
A. PmTRIAP1 3'-UTR和Pm-miR-454-3p；B. PmTRIAP1 3'-UTR和Pm-miR-145-3p
Figure 7. Sequence information of binding and mutant sites of each miRNA at 3'-UTR of target genes
A. 3'-UTR of PmTRIAP1 and Pm-miR-454-3p; B. 3'-UTR of PmTRIAP1 and Pm-miR-145-3p
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图 8 miRNAs与靶基因PmTRIAP1间互作关系的双荧光素报告验证实验
A. PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p之间互作关系；B. PmTRIAP1和Pm-miR-454-3p之间互作关系
Figure 8. Interaction between miRNAs and PmTRIAP1 validated by dual-luciferase reporter assays
A. interaction of PmTRIAP1 and Pm-miR-145-3p; B. interaction of PmTRIAP1 and Pm-miR-454-3p
表 1 实验所用引物
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
primer name序列 (5'−3')
sequence用途
applicationTRIAP1-F ATGAACAGTGTGAGCAAGGATT 开放阅读框验证 TRIAP1-R CTATTCCTTCGGCTTTTCTTCCG 开放阅读框验证 TRIAP1-3GSP1 GGAGGAAGAAAACGCTGGCAGTGG 3' RACE 扩增 TRIAP1-3GSP2 TGCAGCTGAGCTTGAGACCCAAAA 3' RACE 扩增 qTRIAP1-F TGAACAGTGTGAGCAAGGATT PmTRIAP1 RT-PCR qTRIAP1-R AGTGCTTCTTGGACACAGCTTTGG PmTRIAP1 RT-PCR EF-1α-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT RT-PCR 参照基因 EF-1α-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT RT-PCR 参照基因 qmiR-145-F GGATTCCTGGAAATACTG miR-145 RT-PCR qmiR-454-F TAGTGCAATATTGGCTA miR-454 RT-PCR qmiR-R CAGTGCGTGTCGTGGAGT miRNAs RT-PCR U6-S CTCGCTTCGGCAGCACA RT-PCR 内参基因 U6-A AACGCTTCACGAATTTGCGT RT-PCR 内参基因 
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表 2 Targetscan、miRanda和Mireap筛选出2个miRNAs
Table 2 Two miRNAs screened by Targetscan，miRanda and Mireap
miRNA名称 miRNA name 序列 (5'−3') sequence Pm-miR-145-3p GGATTCCTGGAAATACTGTTCT Pm-miR-454-3p TAGTGCAATATTGCTAATAGGCT
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