鱼粉是水产饲料中不可或缺的优质蛋白源，蛋白质含量高，富含必需氨基酸、脂肪酸、矿物质、维生素和促生长因子等动物生长发育所必需的成分^[1]。为了提高饲料利用率并预防疾病，水产饲料中有时会添加药物，而喹噁啉类药物由于价格低廉，曾被广泛作为药物添加剂用于饲料中。喹噁啉类药物是一类人工合成的、具有喹噁啉-1,4-二氧化物母核结构的抗菌促生长剂，主要包括喹乙醇(OLA)、卡巴氧(CBX)、喹赛多(CYA)、喹烯酮(QCT)和乙酰甲喹(MEQ)。该类药物进入动物体内后会快速代谢生成多种代谢产物，如脱氧代谢物、羟基化代谢物和羧基化代谢物，其中羧基代谢物在动物体内残留时间较长，被确定为喹噁啉类药物的残留标示物，主要包括CBX和CYA产生的喹噁啉-2-羧酸(QCA)以及OLA、QCT、MEQ产生的3-甲基喹噁啉-2-羧酸(MQCA)^[2-3]。

喹噁啉类药物具有广谱抗菌和抗球虫作用，能促进动物生长，提高饲料利用率^[4]。但研究表明，与孔雀石绿、结晶紫类似^[5-6]，该类药物同样具有不同程度的致癌、致突变性、蓄积毒性和遗传毒性等^[7-9]。因此，欧盟在2006年禁止所有喹噁啉类药物作为饲料添加剂，并要求其在动物源食品中不得检出^[10]。农业部560号公告，禁止CBX及其盐、酯和其他制剂的使用^[11]，农业部2638号公告明确禁止OLA用于食品动物^[12]。饲料鱼在养殖过程中使用喹噁啉类药物，加工成鱼粉后可能会残留有MQCA或QCA等该类药物的代谢产物，在鱼粉等饲料中使用喹噁啉类药物作为添加剂，则需要监控其原型药物。因此，建立同时检测鱼粉中喹噁啉类药物及其代谢物残留量的方法具有现实意义。

目前，有关喹噁啉类药物及其代谢物的分析方法主要是高效液相色谱法和液相色谱-串联质谱法。Wu等^[13]建立了高效液相色谱同时测定猪和鸡的肌肉和肝脏以及鱼肉中MQCA和QCA残留量的方法，样品使用MAX固相萃取柱净化，MQCA和QCA的回收率为70%~110%，检出限为0.7~2.6 mg·kg^–1。Li等^[14]采用超高效液相色谱-串联质谱测定鸡肉和猪肉中QCT、MEQ及其代谢物，样品使用C₁₈固相萃取柱净化，平均回收率为69.1%~113.3%，检出限为0.05~1.0 mg·kg^–1。黄学泓等^[15]建立超高效液相色谱串联质谱法同时测定全价饲料中QCT、OLA、MEQ、CBX和CYA 5种喹噁啉类药物的分析方法，样品使用Agilent Bond Elut Plexa固相萃取柱净化，平均回收率为65.8%~109.8%，检出限为5 μg·kg^–1。这些方法主要检测其中的少数几种药物，同时检测鱼粉中5种喹噁啉类药物及其2种主要代谢产物的方法尚未见报道。本研究建立的超高效液相色谱-串联质谱法同时检测鱼粉中OLA、CBX、QCT、CYA和MEQ 5种喹噁啉类药物及其2种主要代谢物MQCA和QCA。方法稳定、可靠，可以用于鱼粉中喹噁啉类药物的全面检测。

1.   材料与方法

1.1   仪器与药品

Acquity UPLC I-Class/Xevo TQ-S型超高效液相色谱仪串联三重四极杆质谱仪(美国Waters公司)；Anke DL-600B型离心机(上海安亭科学仪器厂)；ZHWY-200D型多轨道恒温振荡器(上海智城分析仪器公司)；MS3 basic型涡旋振荡器(德国IKA公司)；DTA-3型超声清洗仪(广州凯江仪器有限公司)；Milli Q去离子水发生器(美国Millipore公司)；Oasis HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL)、Oasis MAX固相萃取柱(60 mg，3 mL)、Oasis PRiME HLB固相萃取柱(60 mg，3 mL，美国Waters公司)；Supelclean LC-NH₂固相萃取柱(500 mg，3 mL，美国Supelco公司)。

OLA (纯度97.8%)、CBX (纯度99.0%)、MQCA(纯度99.0%)、QCA (纯度99.8%)、QCA-D₄ (纯度99.9%，德国Dr. Ehrenstorfer公司)；QCT (纯度98.0%，美国A Chemtek公司)；CYA(纯度98.0%)，华中农业大学兽医学院制备；MEQ (纯度99.1%，美国Chem Service公司)。乙腈、乙酸乙酯和甲醇均为色谱纯(美国Simga公司)；其他试剂为分析纯。

标准溶液的配制

1.2.1   标准储备液

分别称取适量标准品，5种原药先用2 mL二甲亚砜溶解，再用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中，代谢物及内标物用甲醇溶解并定容至10 mL，配制成质量浓度为500 μg·mL^–1的标准储备液，–20 ℃避光保存，有效期3个月。

1.2.2   混合标准工作液

分别准确移取适量的标准储备液，采用逐级稀释的方式，用乙腈–0.1%甲酸水 (1∶9，V∶V ) 稀释，配制成质量浓度为4 μg·L^–1、10 μg·L^–1、40 μg·L^–1、100 μg·L^–1、200 μg·L^–1、1 000 μg·L^–1混合标准工作液，内标工作液质量浓度为500 μg·L^–1，现配现用。

1.3   样品前处理方法

1.3.1   提取

准确称取2 g (±0.02 g)鱼粉样品于50 mL离心管中，加入200 μL内标工作液，静置30 min后加入10 mL乙腈-乙酸乙酯提取液，涡旋混合均匀，置于恒温振荡器中40 ℃振荡提取20 min，取出后冷却至室温，5 500 r·min^–1离心10 min，转移全部上清液后再加入5 mL提取液重复提取1次，合并上清液，40 ℃下氮吹至近干，乙腈定容至4 mL，待净化。

向样品残渣中加入10 mL 1 mol·L^–1盐酸溶液，充分涡旋使样品完全分散，超声处理15 min，5 500 r·min^–1离心10 min，转移全部上清液后再加入10 mL盐酸溶液重复提取1次，合并上清液，分别用10 mL和5 mL乙酸乙酯萃取两次，将萃取液转移至玻璃管，40 ℃下氮吹至近干，乙腈定容至3 mL，待净化。

1.3.2   净化

将上述待净化液体全部转移至Oasis PRiME HLB固相萃取柱，上样后用玻璃管收集全部流出液，于40 ℃下氮气吹干，加入1 mL乙腈-0.1%甲酸水(1∶9，V∶V)复溶，过0.22 μm滤膜后上机检测。

1.4   色谱、质谱条件

1.4.1   色谱条件

Kinetex C₁₈柱(50 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Phenomenex公司)；流动相A为乙腈，B为0.1%甲酸水溶液；流速为0.3 mL·min^–1；进样量为10 μL；柱温40 ℃；梯度洗脱程序见表1。

表  1  梯度洗脱程序

Table  1.  Gradient elution program %

t/min	流动相A mobile phase A	流动相B mobile phase B
0	10	90
1.80	95	5
3.00	95	5
3.30	10	90
5.00	10	90

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1.4.2   质谱条件

电喷雾离子源，正离子扫描；质谱扫描方式为多反应监测(MRM)；离子源温度150 ℃；脱溶剂气流量850 L·h^–1；脱溶剂气温度350 ℃；锥孔气流量150 L·h^–1；毛细管电压3.0 kV；母离子、子离子、碰撞能量和锥孔电压见表2。

表  2  喹噁啉类药物及其主要代谢物的质谱参数

Table  2.  MS parameters of quinoxalines and its major metabolites

化合物 compound	母离子/(质荷比) parent ion m/z	子离子/(质荷比) daughter ion m/z	碰撞能量/eV collision energy	锥孔电压/V cone voltage
3-甲基喹噁啉-2-羧酸 MQCA	189.0	145.2*/143.2	22/14	32
喹噁啉-2-羧酸 QCA	175.0	101.9*/129.1	28/14	2
喹噁啉-2-羧酸-D4 QCA-D4	179.0	135.2	28	2
喹烯酮 QCT	306.9	103.1*/131.1	40/26	56
喹赛多 CYA	271.9	129.1*/143.0	32/30	30
喹乙醇 OLA	264.1	212.1*/142.9	28/22	4
卡巴氧 CBX	262.9	231.0*/130.2	20/12	2
乙酰甲喹 MEQ	218.9	143.1*/185.1	24/18	46
注：*. 定量离子 　Note: *. quantitative ion

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2.   结果与分析

2.1   色谱条件的确定

在喹噁啉类药物的残留分析中使用的色谱柱多为C₁₈柱^[3,16-18]，本实验比较了Phenom enex Kinetex C₁₈柱(50 mm×2.1 mm)和Thermo Accucore C₁₈柱(50 mm×2.1 mm) 2种色谱柱。结果表明，MEQ、QCA和MQCA在Accucore C₁₈上的峰形较差，响应值低；使用Kinetex C₁₈柱时7种药物均能获得较好的分离度和峰形，故选用Kinetex C₁₈柱作为色谱柱。另外还对流动相的比例组成进行了研究。与甲醇相比，使用乙腈作为流动相时，各目标物的出峰时间比甲醇早，响应值增强，峰形尖锐，没有明显的拖尾现象。水相分别选用0.1%甲酸水溶液和5 mmol·L^–1乙酸铵溶液，结果显示，使用0.1%甲酸水溶液时7种药物的响应值比乙酸铵溶液高，原因是在正离子模式下，加入适量的有机酸可以提高离子化效率，使响应值提高，定量限加标色谱图见图1。故最终确定流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液。

图  1  定量限浓度加标多反应监测色谱图

Figure  1.  MRM chromatograms of LOQ

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2.2   提取剂的选择

喹噁啉类药物与其主要代谢物的化学性质及在样品中的残留特征均有很大差异。原药主要以游离态形式存在，直接使用有机溶剂即能将其有效提取出来；代谢物则常与蛋白质结合，必须先水解使其从样品中游离出来，再进行提取。在目前已有的液相色谱法检测喹噁啉类药物残留量的方法中，常用提取剂主要有甲醇-水^[19]、乙腈-氯仿^[18]、乙酸乙酯^[20]和乙腈^[21]等，其中氯仿毒性强，容易对人体和环境造成不良影响，笔者分别对其他几种溶剂及其不同比例混合溶剂进行比较试验。使用5%甲醇-水溶液作为提取液，溶液浑浊，QCT、CYA和CBX回收率低于20%；单独使用乙酸乙酯或乙腈均难以有效提取样品中5种喹噁啉类药物。使用乙腈-乙酸乙酯混合液作为提取液，5种药物能同时获得较好的回收率，进一步优化乙腈与乙酸乙酯的比例(图2)，结果发现乙腈-乙酸乙酯(1∶1，V∶V)能有效提取5种化合物，回收率满足实验需要。

图  2  不同提取液配比对5种原药加标回收率的影响

Figure  2.  Effect of different extractant volume ratios on recoveries of five drugs

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由于MQCA和QCA在生物体内会和蛋白质结合，在样品前处理时直接用试剂提取，无法将与组织结合的化合物提取出来，必须通过水解破坏组织，使化合物转变为游离态。常见的肉类样品中MQCA和QCA的水解方法主要有酸水解法^[17,22]、碱水解法^[23-24]和酶水解法^[25-26]。本实验比较了3种方法，结果显示，酶和碱的水解程度更彻底，但酶水解所需时间长(16~18 h)，碱水解产生的杂质多，酸水解可以有效地将目标物从样品中游离出来，并且杂质更少，水解时间更短(约15 min)。进一步研究不同浓度的盐酸及超声处理时间对MQCA和QCA回收率的影响(图3、图4)，在相同水解条件下(超声15 min)，随着盐酸浓度增加，MQCA和QCA回收率也随之提高，当浓度超过1 mol·L^–1，MQCA和QCA回收率趋于平稳；在盐酸浓度为1 mol·L^–1、水解反应总时间为15 min时，超声处理可以显著提高两者的提取率，继续延长水解及超声时间，回收率无明显提高，最终确定样品使用1 mol·L^–1盐酸溶液超声水解15 min。

图  3  盐酸浓度对MQCA和QCA加标回收率的影响

Figure  3.  Effect of hydrochloric acid concentration on recoveries of MQCA and QCA

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图  4  超声处理时间对MQCA和QCA加标回收率的影响

Figure  4.  Effect of sonication time on recoveries of MQCA and QCA

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2.3   净化方法的选择

样品提取液中常含有脂类、蛋白质以及其他大分子杂质，严重影响仪器对目标化合物分析的准确性，因此提取液需要净化处理。常用的净化方法有液液萃取和固相萃取2种方法。固相萃取使用的试剂量少且净化效果好。常用于喹噁啉类药物检测的固相萃取柱有HLB柱^[16,27]和MAX柱^[17,23,28]等，实验使用Oasis HLB柱、Oasis MAX柱、Supelco LC-NH₂柱以及LC-NH₂柱+HLB柱对提取液进行净化，结果见图5。在20 μg·L^–1的添加水平下，MAX柱及LC-NH₂柱对MQCA和QCA有很好的富集作用，但使用MAX柱时CBX和MEQ回收率低于30%；使用LC-NH₂柱时CYA和OLA回收率低于15%；HLB柱对7种药物均有一定保留，但OLA和MEQ回收率低于50%，不能满足实验需要。Oasis PRiME HLB固相萃取柱属于通过性固相萃取柱，当上样液为高浓度有机溶剂时，盐类、磷脂和蛋白质等杂质被保留，而目标物则直接通过，且上样前无需对填料进行活化与平衡处理，进一步缩短了实验时间。实验尝试使用Oasis PRiME HLB小柱对样品提取液进行净化处理，结果显示，7种目标物回收率基本满足实验需要。

图  5  不同类型固相萃取柱对7种目标物加标回收率的影响

Figure  5.  Effect of different types of SPE cartridge on recoveries of seven compounds

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2.4   线性范围、相关性、检测限和定量限

2种代谢产物以内标法定量，以其和内标物的峰面积之比为纵坐标，和内标物的浓度之比为横坐标绘制标准曲线；另外5种药物以基质匹配外标法定量，以自身峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。结果显示，在相应的线性范围内，7种化合物均呈现良好的线性关系，(R≥0.994，表3)。采用空白鱼粉样品进行添加回收试验，以3倍信噪比(S/N≥3)为检测限，以10倍信噪比(S/N≥10)为定量限，结果显示，MQCA和QCA的检测限为2 μg·kg^–1，定量限为5 μg·kg^–1；MEQ的检测限为10 μg·kg^–1，定量限为20 μg·kg^–1；其余4种药物检测限为1 μg·kg^–1，定量限为2 μg·kg^–1，与黄学泓等^[15]建立的超高效液相色谱串联质谱同时测定全价饲料中5种喹噁啉类药物的方法相比，本研究建立的方法能同时测定原药和代谢物，方法灵敏度总体有所提高。

表  3  基质标准曲线的线性范围、线性方程和相关系数

Table  3.  Linear range and equations and correlation coefficients of matrix standard curve

化合物 compound	线性范围/μg·L–1 linear range	线性方程 linear equation	相关系数 R correlation coefficient	检测限/μg·kg–1 LOD	定量限/μg·kg–1 LOQ
3-甲基喹噁啉-2-羧酸 MQCA	10~200	y=4 569.47x–1 591.88	0.999	2	5
喹噁啉-2-羧酸 QCA	10~200	y=883.32x–967.768	0.997	2	5
喹烯酮 QCT	4~200	y=3 690.52x+5 658.01	0.994	1	2
喹赛多 CYA	4~200	y=3 565.28x+791.096	0.996	1	2
喹乙醇 OLA	4~200	y=260.13x–358.032	0.998	1	2
卡巴氧 CBX	4~200	y=256.568x+577.777	0.997	1	2
乙酰甲喹 MEQ	40~1 000	y=488.546x–606.712	0.998	10	20

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2.5   回收率测定

每种化合物制作低、中、高3个浓度水平的样品，每个浓度水平做5个平行(表4)。7种化合物平均回收率为64.4%~102.2%，相对标准偏长(RSD)为3.2%~10.2%。

表  4  样品加标回收率及相对标准偏差

Table  4.  Recovery and RSD of fortified samples n=5

化合物 compound	添加水平/μg·kg–1 added level	平均回收率/% average recovery	相对标准偏差/% RSD
3-甲基喹噁啉-2-羧酸 MQCA	5.0，10，100	94.8，102.2，91.6	3.2，3.5，4.1
喹噁啉-2-羧酸 QCA	5.0，10，100	72.4，80.8，77.5	4.3，3.8，5.1
喹烯酮 QCT	2.0，10，100	70.2，85.3，85.4	7.8，8.1，7.2
喹赛多 CYA	2.0，10，100	70.7，71.7，73.8	6.4，7.8，5.1
喹乙醇 OLA	2.0，10，100	87.1，89.7，94.9	9.4，8.6，6.8
卡巴氧 CBX	2.0，10，100	70.6，75.8，85.3	8.4，8.9，6.2
乙酰甲喹 MEQ	20，50，100	64.4，66.8，67.6	10.2，9.9，7.6

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MEQ回收率偏低，可能与样品前处理方法或药物本身的理化性质有关，邹荣婕等^[29]研究MEQ在鲤鱼肌肉组织中的残留消除规律，使用二氯甲烷-乙酸乙酯(3∶1，V∶V)作为提取液，MEQ回收率约75%。宫向红等^[30]建立了高效液相色谱法测定水产品中MEQ残留量，使用二氯甲烷-乙酸乙酯(4∶1，V∶V)作为提取液，MEQ回收率约73%。张嘉慧等^[31]研究发现，使用有机溶剂直接提取MEQ存在杂质干扰、回收率偏低的问题。本研究同时测定5种原药及其2种主要代谢物，难以确保每个化合物均有较高的回收率。因此，如何解决多种喹噁啉类药物同时检测及MEQ回收率偏低的问题，还需要进一步研究。

3.   结论

本研究采用超高效液相色谱-串联质谱法测定鱼粉中5种喹噁啉类药物及其2种主要代谢物。样品经乙腈-乙酸乙酯混合液、盐酸提取，Oasis PRiME HLB小柱净化处理，UPLC-MS/MS测定。在低、中、高3个浓度加标水平内，方法回收率为64.4%~102.2%，RSD为3.2%~10.2%， QCT、CYA、OLA和CBX检出限为1 μg·kg^–1，定量限为2 μg·kg^–1；MQCA和QCA检出限为2 μg·kg^–1，定量限为5 μg·kg^–1；MEQ检出限为10 μg·kg^–1，定量限为20 μg·kg^–1；本方法能同时测定鱼粉中的喹噁啉类药物及其主要代谢产物，提高了检测效率，适用于鱼粉中喹噁啉类药物的全面检测。