Determination of quinoxalines and their major metabolites residues in fishmeal by ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry
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摘要:
文章建立了超高效液相色谱-串联质谱法同时检测鱼粉中5种喹噁啉类药物及其2种主要代谢物残留量的方法。样品经乙腈-乙酸乙酯(1∶1, V∶V )和1 mol·L–1盐酸分步提取，盐酸提取液进一步用乙酸乙酯反萃取，有机相经浓缩后，均用乙腈复溶，用PRiME HLB通过性固相萃取柱净化处理。样品以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，经Phenomenex Kinetex C18柱梯度洗脱分离，质谱采取正离子多反应监测模式进行检测。代谢物采用内标法定量，原药采用基质匹配外标法定量。结果表明，7种化合物在对应的浓度范围内线性关系良好(R≥0.994)，2种代谢产物检测限为2 μg·kg–1，定量限为5 μg·kg–1；5种喹噁啉类药物检测限为1~10 μg·kg–1；定量限为2~20 μg·kg–1。在高、中、低3种添加浓度下7种化合物的平均回收率为64.4%~102.2%，相对标准偏差为3.2%~10.2%。方法灵敏度高、精密度好，能同时测定鱼粉中的喹噁啉类药物及其主要代谢物。
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关键词:
- 超高效液相色谱-串联质谱法 /
- 喹噁啉类药物 /
- 代谢物 /
- 鱼粉 /
- 残留检测
Abstract:A sensitive and reliable ultra-high performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) method was eatablished for the determination of olaquindox (OLA), carbadox (CBX), cyadox (CYA), quinocetone (QCT), mequindox (MEQ) and their main metabolites (QCA and MQCA) in fishmeal. The samples were extracted by acetonitrile-ethyl acetate mixture (1∶1, V∶V) and hydrochloric acid solution (1 mol·L–1), then the analyte which dissolved in the aqueous phase was re-extracted by ethyl acetate. The extraction was concentrated and reconstituted with acetonitrile. After purification with the Oasis PRiME HLB SPE cartridge, the sample was subjected to the following analytical procedure. The mobile phase containing acetonitrile and 0.1% formic acid solution with a linear gradient elution was utilized to separate all compounds on a Phenomenex Kinetex C18 column. The quantitative analysis of metabolites was carried out with an internal standard method and the others with an external standard method in the multiple reaction monitoring mode using positive electrospray ionization. The calibration curves for all compounds were linear (R≥0.994) within their corresponding concentration range. The recoveries were 64.4%−102.2% at different spiking levels with RSDs of 3.2%−10.2%. The limits of detection and quantification of MQCA and QCA were 2 μg·kg–1and 5 μg·kg–1; MEQ was 10 μg·kg–1 and 20 μg·kg–1; the others were 1 μg·kg–1 and 2 μg·kg–1, respectively. This method with high sensitivity and good precision can be applied to the simultaneous determination of quinoxaline drugs and their major metabolite in fishmeal samples.
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Keywords:
- UPLC-MS/MS /
- quinoxalines /
- metabolites /
- fishmeal /
- residues determination
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柔鱼 (Ommastrephes bartramii) 属大洋性头足类，广泛分布于三大洋温带和亚热带海域[1]，是海洋生态系统的重要组成部分，目前其商业性开发利用主要集中在北太平洋海域[2]。日本从1974年开始商业捕捞[3]，中国于1994年开始进行商业性开发[4]。作为重要的大洋性经济柔鱼类，柔鱼资源的可持续开发利用越来越受到国内外研究者的重视。目前国内外学者对柔鱼的种群结构[5-7]、年龄生长[8-11]、摄食[12]等生物学特性进行了研究，发现其个体生长在不同种群、性别及季节存在明显差异。柔鱼生长迅速，生命周期通常为1年[13]，其生长速度受生物和非生物影响。
胴长与体质量关系 (Length-mass relationship, LMR) 能够通过胴长来估计体质量，反之亦然，可以反映物种的生长模式 (等速还是异速生长)，也可以反映物种的种内、种间关系[14]。了解胴长与体质量关系对头足类的种群划分和资源评估至关重要[15]。已有许多研究表明，头足类的生长会受到生物和非生物 (季节、地理和环境条件等因子) 的影响，因而其关系式中的参数存在一定的异质性。如Vasconcelos等[16]对阿尔加维海岸的乌贼 (Sepia officinalis) 生物学特性进行了研究，发现其胴长和体质量关系存在性别和地理位置上的差异。
在针对参数异质性研究中，线性混合模型 (Linear mixed model, LMM) 是一种应用极其广泛的统计学模型[17]。其线性预测同时包含固定效应和随机效应，并具有能研究多样型数据的优点[18]，已广泛应用于多个领域。Ma等[19]使用线性混合模型对中国北部沿岸小黄鱼 (Larimichthy spolyactis) 的体长、体质量关系进行了研究，发现其体长、体质量在不同年份和海域存在显著性差异。瞿俊跃等[20]在对东海的蓝点马鲛 (Scomberomorus niphonius) 研究中使用了线性混合模型，模型中考虑了不同性别和月份的随机效应。以往研究发现不同群体的柔鱼生长特征亦有所不同，但性别和月间所产生的影响程度仍不清楚。因此，本文根据近些年我国鱿钓船在北太平洋生产调查期间所获得的渔获样本，对不同柔鱼群体的生长特征进行研究，并运用线性混合模型分析其性别与时间的差异，以期为北太平洋柔鱼的种群生长差异及资源评估与管理提供数据支撑和参考依据。
1. 材料与方法
1.1 数据来源
选取2016—2018年的柔鱼样本进行分析，样本主要采集于北太平洋海域 (172°08'E—176°25'W、38°42'N—39°43'N，150°42'E—167°00'E、38°00' N—43°13'N，图1)，采集时间为5—11月 (表1)，采样时间涵盖了不同群体柔鱼的主要生活史过程[21]。采集的柔鱼样本经冷冻保存运回实验室进行生物学分析。
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图 1 北太平洋柔鱼不同群体采样站点Figure 1. Sampling station of different populations O. bartramii in North Pacific表 1 不同月份柔鱼样本基本信息Table 1. Basic information of O. bartramii samples in different months群体
Population年份
Year月份
Month样本数量
Number of sample胴长范围
Range of mantle length/mm东部群体 Eastern population 2016—2017 5 394 163~500 6 456 212~516 西部群体 Western population 2016—2018 7 124 187~290 8 283 195~357 9 331 199~386 10 165 190~377 11 105 215~421 1.2 研究方法
1.2.1 群体划分
根据Yatsu等[5]的划分方法，170°E以东范围内为东部群体 (秋生群)，170°E以西范围为西部群体 (冬春生群)。同时结合鱿钓船捕捞的时间和个体大小，以170°E为界，共获得东部群体样本850尾，西部群体样本1 008尾。
1.2.2 基础生物学测量
对解冻后的样本进行生物学测定，包括胴长 (Mantle length, ML)、体质量 (Body mass, BM)、性别、性腺成熟度等。使用皮尺测定样本的胴长，精确至1 mm；使用电子天平测定体质量，精确至0.1 g。根据Lipinski和 Underhil[22]将其性腺成熟度划分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期，其中Ⅰ和Ⅱ为未成熟，Ⅲ期以上为成熟个体。
1.2.3 数据处理与分析
1) 采用t检验，分析不同群体间柔鱼的差异；2) 采用频率分析法分析样本胴长及体质量的组成，组间距分别为30 mm和300 g，绘制频率分布图，确定优势胴长组和体质量组，计算优势组的比例；3) 采用方差分析 (ANOVA)[23] 和多重比较 (LSD法)[24] 对不同月份柔鱼的差异进行检验，并对不同性别柔鱼胴长的差异进行检验，以分析不同因子对柔鱼生长的影响；4) 利用线性混合效应模型[25]，建立胴长-体质量关系：
$$ m=a{L}^{b} $$ (1) 式中m为体质量 (g)，L为胴长 (mm)，a是条件因子，b是异速生长参数 (代表柔鱼胴长方向，体高方向和体宽方向3个维度的生长速度[26])。
1.3 异质性分析
本文使用胴长和体质量关系模型及9个线性混合模型来描述东西部群体柔鱼的胴长和体质量关系 (表2)，其中9个LMM模型将月份和性别的影响作为参数a和b的随机效应，以探讨时间及生物学对柔鱼生长的影响。
表 2 不同群体柔鱼胴长-体质量关系模型的拟合效果指标Table 2. Fitting effect index (AIC) of mantle length-body mass relationship models for different O. bartramii populations种群
Population模型缩写
Model abbreviation模型
Model对数转化
Log-transformed赤池信息量准则
AIC均方根误差
RMSE东部群体
Eastern populationLMR m = a×Lb ln(m)=ln(a)+b×ln(L) −466.402 0.183 265 RSS m=a×L(b+RSS) ln(m)=ln(a)+(b+RSS)×ln(L) −472.338 0.181 617 RSI m=a×exp(RSI)×Lb ln(m)=[ln(a)+RSI]+b×ln(L) −472.27 0.181 641 RSI&S m=a×exp(RSI)×L(b+RSS) ln(m)=[ln(a)+RSI]+(b+RSS)×ln(L) −469.057 0.181 428 RMS m=a×L(b+RMS) ln(m)=ln(a)+(b+RMS)×ln(L) −489.107 0.179 784 RMI m=a×exp(RMI)×Lb ln(m)=[ln(a)+RMI]+b×ln(L) −492.772 0.179367 RMI&S m=a×exp(RMI)×L(b+RSI) ln(m)=[ln(a)+RMI]+(b+RMS)×ln(L) −595.137 0.166 468 RS&MS m=a×L(b+RSS+RMS) ln(m)=ln(a)+(b+RSS + RMS)×ln(L) −494.452 0.178 558 RS&MI m=a×exp(RSI)×exp(RMI)×Lb ln(m)=[ln(a)+RSI + RMI]+b×ln(L) −497.694 0.178 211 RS&MI&S m=a×exp(RSI)×exp(RMS)×L(b+RSI+RSI) ln(m)=[ln(a) + RSI + RMS]+(b+RSI + RMI)×ln(L) −596.138 0.165 394 西部群体
Western populationLWR m = a×Lb ln(m)=ln(a)+b×ln(L) −1 795.63 0.099 003 RSS m=a×L(b+RSS) ln(m)=ln(a)+(b+RSS)×ln(L) −1 797.15 0.098 614 RSI m=a×exp(RSI)×Lb ln(m)=[ln(a)+RSI]+b×ln(L) −1 797.31 0.098 603 RSI&S m=a×exp(RSI)×L(b+RSS) ln(m)=[ln(a)+RSI]+(b+RSS)×ln(L) −1 796.72 0.098 512 RMS m=a×L(b+RMS) ln(m)=ln(a)+(b+RMS)×ln(L) −1 807.04 0.097 626 RMI m=a×exp(RMI)×Lb ln(m)=[ln(a)+RMI]+b×ln(L) −1 807.41 0.097 615 RMI&S m=a×exp(RMI)×L(b+RSI) ln(m)=[ln(a)+RMI]+(b+RMS)×ln(L) −1 807.59 0.097 215 RS&MS m=a×L(b+RSS+RMS) ln(m)=ln(a)+(b+RSS + RMS)×ln(L) −1 808.14 0.097 347 RS&MI m=a×exp(RSI)×exp(RMI)×Lb ln(m)=[ln(a)+RSI + RMI]+b×ln(L) −1 808.56 0.097 333 RS&MI&S m=a×exp(RSI)×exp(RMS)×L(b+RSI+RSI) ln(m)=[ln(a) + RSI + RMS]+(b+RSI + RMI)×ln(L) −1 808.09 0.096 976 注：第一列为柔鱼的不同群体，第二列为第三、四列模型的缩写 RSS、RSI、RSI&S、RMS、RMI、RMI&S、RS&MS、RS&MI 和 RS&MI&S 分别为斜率 b 的性别随机效应、截距 ln(a) 的性别随机效应、截距 ln(a) 与斜率 b的性别随机效应、斜率 b 的月份随机效应、截距 ln(a) 的月份随机效应、截距 ln(a) 与斜率 b 的月份随机效应、斜率 b的性别与月份随机效应、截距 ln(a) 的性别与月份随机效应,以及截距 ln(a) 与斜率 b 的性别与月份随机效应Note: The first column shows different O. bartramii populations. The second column shows the abbreviations of models detailed in the third and fourth columns. RSS, RSI, RSI&S, RMS, RMI, RMI&S, RS&MS, RS&MI和RS&MI&S indicate random effects on slope (b) in sexual difference, random effects on intercept [ln (a)] in sexual difference, random effects on intercept [ln (a)] and slope (b) in sexual difference, random effects on slope (b) in months, random effects on intercept [ln (a)] in months, random effects on intercept [ln (a)] and slope (b) in months, random effects on slope (b) in sexual difference and months, random effects on intercept [ln (a)] fin sexual difference and months, and random effects on intercept [ln (a)] and slope (b) in sexual difference and months, respectively. 线性混合模型是一类非常重要的统计模型，既含有固定效应也含有随机效应。一般来说，如果抽取某一个因子的若干个特定水平，目的是对这些水平的效应进行估计或比较，这个因子通常会当成固定效应；如果因子的若干水平是来自总体的随机抽样，目的是要通过该样本推断总体，那么该因子通常被当作随机效应，其模型可表示为[18]：
$$ y=X\tau +Zu+e $$ (2) 式中y为所有观测值构成的向量，τ为所有固定效应构成的向量，X为固定效应的关联矩阵，u是所有随机效应构成的向量，Z为随机效应的关联矩阵，e为随机残差向量。
本研究以性别和月份作为随机效应进行模型拟合，基于随机效应的不同组合，共建立9个线性混合模型 (表2)，其随机效应分别来自性别 (RSS、RSI和RSI&S)、月份 (RMS、RMI和RMI&S)、性别和月份 (RS&MS、RSS&MI和RS&MI&S)。
使用F检验评估各因子对柔鱼胴长-体质量关系的显著性[18]。利用赤池信息量准则 (Akaike Information criterion, AIC) 来比较10个模型的拟合程度[27]，同时利用均方根误差 (Root mean square error, RMSE) 来判断最适模型；其值越接近0，表示模型的预测值与样本的真实值差异越小，即模型的拟合效果越好。所有模型的构建过程均采用R软件的 “lme4”程序包来完成[28]。
2. 结果
2.1 胴长与体质量组成
对东、西部群体比较发现，2个群体间胴长、体质量存在极显著性差异 (P<0.01)，因此分别对两个群体的生物学特征进行分析。发现东部群体柔鱼雌雄比较高 (7.02∶1)；西部群体雌雄比较低 (1.03∶1)。
经t检验，东、西部群体雌性与雄性柔鱼胴长、体质量均存在极显著性差异 (P<0.01)。结果显示，东部群体雌性个体胴长、体质量为163~516 mm、222~4 167 g，优势胴长、体质量为240~270 mm和330~420 mm、300~600 g和900~2 100 g，占总数的80.10%、83.70%，平均胴长、体质量为351.04 mm、1 366.10 g；雄性个体胴长、体质量范围为212~280 mm、292~665 g，优势胴长、体质量为210~270 mm、600~900 g，占总数的98.11%、97.17%，平均胴长、体质量为246.00 mm、395.20 g (图2)。
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图 2 东部群体柔鱼不同性别胴长体质量频率分布图Figure 2. Frequency distribution of mantle length and body mass of O. bartramii of different sex for eastern population西部群体雌性个体胴长、体质量范围为185~421 mm、170~2 328 g，优势胴长、体质量为210~330 mm、300~900 g，占总数的85.35%、67.185%，平均胴长、体质量为268.55 mm、610.51 g；雄性个体胴长、体质量范围为190~395 mm、169~1640 g，优势胴长、体质量为210~330 mm、300~900 g，占总数的91.93%、79.84%，平均胴长、体质量为258.77 mm、538.14 g (图3)。比较两个群体的渔获物组成发现，东部群体雌雄数量相差较大，而西部群体则相近。东部群体柔鱼个体明显大于西部群体。
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图 3 西部群体柔鱼不同性别胴长体质量频率分布图Figure 3. Frequency distribution of mantle length and body mass of O. bartramii of different sex for western population方差分析表明，东部群体和西部群体月份间胴长、体质量均存在极显著性差异 (P<0.01)。结果显示，5月东部群体柔鱼雌性个体较大，而雄性个体则相反。西部群体柔鱼雌雄个体表现出相同的趋势，在7—10月间随着月份的增加，雌雄个体逐渐增大，10月的个体最大；11月则略微下降。总的来看，各月份雌性个体均大于雄性个体 (图4)。
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图 4 柔鱼不同月份胴长体质量分布图a. 东部群体胴长分布图；b. 东部群体体质量分布图；c. 西部群体胴长分布图；d. 西部群体体质量分布图Figure 4. Distribution of mantle length and body mass of O. bartramii in different monthsa. Distribution of mantle length for eastern population; b. Distribution of body mass for eastern population; c. Distribution of mantle length for western population t; d. Distribution of body mass for western population2.2 胴长和体质量参数分析
由于不同月份东、西部群体柔鱼胴长和体质量，以及雌、雄个体的胴长和体质量均存在极显著性差异，因此，本研究对不同性别柔鱼胴长和体质量关系 (图5)，以及不同月份柔鱼胴长和体质量关系分别进行讨论 (表3)。
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图 5 不同群体柔鱼体质量-胴长关系a. 东部群体雌性体质量-胴长关系；b. 东部群体雄性体质量-胴长关系；c. 西部群体雌性体质量-胴长关系；d. 西部群体雄性性体质量-胴长关系Figure 5. Mantle length-body mass relationship for different O. bartramii populationsa. Relationship between BM and ML of female for eastern population; b. Relationship between BM and ML of male for eastern population; c. Relationship between BM and ML of female for western population; d. Relationship between BM and ML of male for western population表 3 不同月份东西部群体柔鱼胴长与体质量关系Table 3. Mantle length-body mass relationship for different O. bartramii populations in different months群体
Population月份
Month胴长与体质量关系
Mantle length-mass relationship样本数量
Number of samples判定系数R2
Coefficient of determinationP 东部群体
Eastern population5 m =1.9×10−3L2.295 7 394 0.670 6 0.001 6 m =1×10−5L3.160 1 456 0.973 8 0.001 西部群体
Western population7 m = 9×10−6L3.205 3 124 0.889 5 0.001 8 m = 2×10−5L3.090 9 283 0.934 5 0.001 9 m = 2×10−5L3.059 7 331 0.952 0 0.001 10 m = 1×10−5L3.178 3 165 0.972 8 0.001 11 m = 5×10−5L2.902 8 105 0.947 7 0.001 胴长体质量关系模型的结果显示，东、西部群体柔鱼胴长体质量关系具有明显的性别和时间差异。从不同性别来看，东部群体雌性的a值比雄性小，b值则与之相反；西部群体亦然 (表4)。从不同月份来看，东部群体5月的a值比6月大，b值则与之相反。西部群体a值在11月最大，8月和9月次之，7月最小；b值月份分布由高到低依次为7月>10月>8月>9月>11月 (表3)。东部群体中a和b值的性别差异范围分别为0.069 68和0.367 26；而a和b值的月份差异分别为0.306 10和0.822 80，说明东部群体的时间差异大于性别差异。西部群体中a和b值的性别差异范围分别为0.027 45和0.156 62；而a和b值的月份差异分别为0.056 84和0.320 31，说明西部群体的时间差异大于性别差异。
表 4 不同性别东西部群体柔鱼胴长与体质量关系Table 4. Mantle length-body mass relationship of O. bartramii of different sex for different populations群体
Population性别
Sex胴长与体质量关系
Mantle length-mass relationship样本数量
Number of samples判定系数R2
Coefficient of determinationP 东部群体
Eastern population雌性 m=3×10−5L2.981 8 744 0.892 9 0.001 雄性 m=2×10−4L2.621 0 106 0.794 3 0.001 西部群体
Western population雌性 m=1×10−5L3.159 9 512 0.968 1 0.001 雄性 m =2×10−5L3.103 5 496 0.941 5 0.001 2.3 模型选择
本研究通过建立1个广义线性模型 (Generalized linear model, GLM) 和9个线性混合模型 (Linear mixed model, LMM) 来描述胴长和体质量关系 (表2)，其中9个LMM模型分别讨论了不同月份影响下a与b的随机效应和不同性别影响下a与b的随机效应。结果表明，东部群体中，同时具有性别和月份对两个参数的随机效应的线性混合模型对柔鱼胴长-体质量关系的拟合效果最好，AIC为−596.138，RMSE为0.165 394；西部群体亦是如此，其中，AIC为−1 808.09，RMSE为0.096 976 (表2)。综合发现，性别和月份随机效应模型均优于一般的LMR模型，证明东、西部群体柔鱼均存在月份和性别上的差异。
3. 讨论
本研究采集的柔鱼样本中，东部群体5—6月雌性个体胴长范围为163~516 mm，雄性为212~280 mm。西部群体7—11月雌、雄性个体胴长范围分别为185~421 mm和190~395 mm。总体来看，东部群体柔鱼个体明显大于西部群体，这与黄洪亮等[29]对1996—2001年柔鱼渔获物胴长的研究结果一致。Ichii等[30]认为，东、西部群体柔鱼大小的差异可能是由过渡区叶绿素锋区和海表面温度的季节性变化引起，东部群体孵化时位于生产力较高的海域，西部群体则位于低产区。Katugin[31]对柔鱼样本进行种群基因差异性分析，发现东西部群体柔鱼在等位基因频率分布和遗传变异水平上存在显著性差异。因此，东、西部群体柔鱼大小的差异还可能与内在基因表达有关。
根据LMM (RS&MI&S) 的结果，北太平洋东部群体柔鱼条件因子a (0.000 021~0.000 46) 和西部群体条件因子a (0.000 013~0.000 017) 的估计值显著大于1996—2001年黄洪亮等[29]研究得到的东部群体a值 (0.000 006) 和西部群体a值 (0.000 004)。Hile[32]指出鱿鱼的种间和种内生长模式具有明显的差异性，其b介于2.5~4.0，本研究中东部群体柔鱼的b估计值 (2.731 4~3.050 51) 和西部群体的b估计值 (3.093 3~3.13536) 恰好在此范围内，且东部群体的值小于西部群体。东部群体柔鱼的b固定值 (2.763 4) 小于3，说明东部群体柔鱼呈负异速增长趋势，随着胴长的增加，柔鱼的肥满度降低，身体往细长方向发展；而西部群体柔鱼的b固定值 (3.117 19) 大于3，说明西部群体柔鱼呈正异速增长趋势，随着胴长的增加，柔鱼的肥满度升高，胴宽也增大。导致这一差异的原因可能是由于饵料与环境因素的不同。有研究表明，由于黑潮与亲潮的交汇区含有丰富的饵料，可能会造成太平洋西部海域柔鱼的摄食强度高于东部海域[33-34]。另外，海水温度变化对头足类的生长也有一定影响[35]，东、西部群体的季节性差异会导致其生活水域温度的差异，因此，水温的不同可能会造成其生长模式的不同，从而导致不同群体b值的差异。
根据LMM (RS&MI&S) 的结果，本研究中，东、西部群体各月份的胴长与体质量均有极显著的差异性。东部群体柔鱼5月b (2.259 7) 小于3，呈现负异速增长；而6月b (3.1601) 大于3，呈现正异速增长。由于东部群体雄性样本较少，因此b的变化主要取决于雌性的生长变化。东部群体中，雌性个体5月到达亚北极边界海域，6—7月洄游至高生产力的亚北极锋区的南部海域[11]，从而使得6月雌性柔鱼的摄食强度更高。这一结果可解释本研究中东部群体b的变化规律。西部群体中7—10月b均大于3，而11月b (2.9028) 最低，小于3，反映出11月的柔鱼较其他月份更偏向细长。研究表明，西部群体柔鱼8—10月主要分布在40°N—46°N亲潮前锋区及其周围海域的索饵场，其饵料丰富；10—11月后柔鱼开始向南进行产卵洄游，在产卵的过程中会导致柔鱼的肥满度降低[21]。这一现象也可解释西部群体柔鱼b的变化。
东、西部群体柔鱼雌雄的胴长与体质量均有极显著差异，存在显著的雌雄二态性。本研究中东部群体柔鱼雌雄比高达7.02∶1，而西部群体仅为1.03∶1，群体间性比差异显著 (P<0.01)，这与东、西部群体洄游路线不同有关[30,36]。西部群体的雌、雄个体均生活在同一海域，有着相似的洄游路线；而东部群体中雌、雄个体的洄游路径有很大差异，雌性个体洄游方式和西部群体类似，先向北洄游，待个体成熟后再往南洄游至产卵场；雄性个体在整个生长过程中一直栖息于北太平洋副热带海域，直到7月开始向南产卵洄游。本研究发现，东、西部群体柔鱼中的雌性异速生长参数b均大于雄性，表明雌性的肥满度高于雄性，这一结果与乌贼 (Sepia officinalis)[16]、茎柔鱼 (Dosidicus gigas)[37] 相似。Domingues等[38-39]认为不同性别间乌贼的生长差异与生殖器官的发育和质量有关。乌贼在接近成熟时，雌性个体在生殖上投入的精力比在体细胞生长上投入的精力多，从而导致雌性的生殖器官变得相对较重 (相当于体质量)，因此雌性的形状丰满度比雄性高。由此可推测，不同性别柔鱼生长差异可能与生殖器官的发育有关。
本文中任意一个线性混合模型的拟合程度均优于一般的LMR模型，其中，包含参数a和b的性别和月份随机效应LMM (SS&MI&S) 拟合效果最好，更能体现出生物学上的异质性。简单的LWR模型，常构建单因子回归模型，对多因子复合影响的模型能力较差[20]。而混合效应模型能把性别和时间的随机效应在单个模型中体现出来，从而更有效、更合理地估计时间和生长的差异，进一步证实了此模型在异质性研究中的优势。北太平洋柔鱼存在着不同的群体，在对其进行资源评估时需分开讨论。个体生长特征的异质性可能直接导致其种群动力学的变化，从而影响资源评估的准确性[40]。因此，本文根据不同年份、不同群体的柔鱼数据构建胴长体质量关系模型，并考虑到月份与性别的差异，从而更好地评估其生长特征，进而推断其资源量。由于本文仅考虑了性别和月份的随机效应，存在一定不足；未来的研究应充分考虑季节、水域和环境因子等对不同群体柔鱼生长的影响，更全面地研究不同群体柔鱼个体生长特征的变化。
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图 2 不同提取液配比对5种原药加标回收率的影响
Figure 2. Effect of different extractant volume ratios on recoveries of five drugs
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图 3 盐酸浓度对MQCA和QCA加标回收率的影响
Figure 3. Effect of hydrochloric acid concentration on recoveries of MQCA and QCA
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图 4 超声处理时间对MQCA和QCA加标回收率的影响
Figure 4. Effect of sonication time on recoveries of MQCA and QCA
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图 5 不同类型固相萃取柱对7种目标物加标回收率的影响
Figure 5. Effect of different types of SPE cartridge on recoveries of seven compounds
表 1 梯度洗脱程序
Table 1 Gradient elution program
% t/min 流动相A
mobile phase A流动相B
mobile phase B0 10 90 1.80 95 5 3.00 95 5 3.30 10 90 5.00 10 90 
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表 2 喹噁啉类药物及其主要代谢物的质谱参数
Table 2 MS parameters of quinoxalines and its major metabolites
化合物
compound母离子/(质荷比)
parent ion m/z子离子/(质荷比)
daughter ion m/z碰撞能量/eV
collision energy锥孔电压/V
cone voltage3-甲基喹噁啉-2-羧酸 MQCA 189.0 145.2*/143.2 22/14 32 喹噁啉-2-羧酸 QCA 175.0 101.9*/129.1 28/14 2 喹噁啉-2-羧酸-D4 QCA-D4 179.0 135.2 28 2 喹烯酮 QCT 306.9 103.1*/131.1 40/26 56 喹赛多 CYA 271.9 129.1*/143.0 32/30 30 喹乙醇 OLA 264.1 212.1*/142.9 28/22 4 卡巴氧 CBX 262.9 231.0*/130.2 20/12 2 乙酰甲喹 MEQ 218.9 143.1*/185.1 24/18 46 注：*. 定量离子
Note: *. quantitative ion
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表 3 基质标准曲线的线性范围、线性方程和相关系数
Table 3 Linear range and equations and correlation coefficients of matrix standard curve
化合物
compound线性范围/μg·L–1
linear range线性方程
linear equation相关系数 R
correlation coefficient检测限/μg·kg–1
LOD定量限/μg·kg–1
LOQ3-甲基喹噁啉-2-羧酸 MQCA 10~200 y=4 569.47x–1 591.88 0.999 2 5 喹噁啉-2-羧酸 QCA 10~200 y=883.32x–967.768 0.997 2 5 喹烯酮 QCT 4~200 y=3 690.52x+5 658.01 0.994 1 2 喹赛多 CYA 4~200 y=3 565.28x+791.096 0.996 1 2 喹乙醇 OLA 4~200 y=260.13x–358.032 0.998 1 2 卡巴氧 CBX 4~200 y=256.568x+577.777 0.997 1 2 乙酰甲喹 MEQ 40~1 000 y=488.546x–606.712 0.998 10 20
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表 4 样品加标回收率及相对标准偏差
Table 4 Recovery and RSD of fortified samples
n=5 化合物 compound 添加水平/μg·kg–1 added level 平均回收率/% average recovery 相对标准偏差/% RSD 3-甲基喹噁啉-2-羧酸 MQCA 5.0，10，100 94.8，102.2，91.6 3.2，3.5，4.1 喹噁啉-2-羧酸 QCA 5.0，10，100 72.4，80.8，77.5 4.3，3.8，5.1 喹烯酮 QCT 2.0，10，100 70.2，85.3，85.4 7.8，8.1，7.2 喹赛多 CYA 2.0，10，100 70.7，71.7，73.8 6.4，7.8，5.1 喹乙醇 OLA 2.0，10，100 87.1，89.7，94.9 9.4，8.6，6.8 卡巴氧 CBX 2.0，10，100 70.6，75.8，85.3 8.4，8.9，6.2 乙酰甲喹 MEQ 20，50，100 64.4，66.8，67.6 10.2，9.9，7.6
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