Characterization and function analysis of Elovl4-like elongase gene in golden pompano (Trachinotus ovatus)
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摘要:
长链脂肪酸延长酶(elongases of very long chain fatty acids, Elovls)是长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFA)生物合成途径中的关键限速酶，能够延长PUFA的碳链。为探究Elovl4在卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) PUFA生物合成中的功能，该研究克隆了卵形鲳鲹Elovl4基因的cDNA序列，命名为ToElovl4-like，其开放阅读框(ORF)为792 bp，编码263个氨基酸。生物信息学分析结果表明，编码的氨基酸包含Elovl家族的显著结构特征如组氨酸盒子、多个跨膜区和ER滞留信号等。序列比对结果显示，卵形鲳鲹Elovl4-like基因高度保守，且该基因编码的蛋白序列与其他鱼类的相似度为73%~86%，其中与大西洋鳕(Gadus morhua)的相似度最高(86%)。系统进化分析表明，Elovl4主要聚为Elovl4a、Elovl4b和Elovl4-like 3类。其中ToElovl4-like与其他鱼类的Elovl4-like亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明ToElovl4-like基因在各组织中均有表达，其中在性腺和脾中mRNA表达量最高，在脑中mRNA表达量最低。酵母异源表达分析表明，ToElovl4-like可以分别将亚油酸 (18:2n-6)、二十碳五烯酸 (20:5n-3)延长为二十碳二烯酸 (20:2n-6)和二十二碳五烯酸 (22:5n-3)。研究结果为了解鱼类长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的生物合成提供了理论基础。
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关键词:
- 卵形鲳鲹 /
- Elovl4-like /
- 异源表达 /
- 功能鉴定
Abstract:The elongases of very long chain fatty acids (Elovls), which are key rate-limiting enzymes in the long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) biosynthesis pathway, can extend the carbon chain of PUFAs. To investigate the function of Elovl4 in PUFA biosynthesis of Trachinotus ovatus, we cloned its cDNA sequence (ToElovl4-like), whose open reading frame (ORF) was 792 bp, encoding 263 amino acids. Bioinformatics analysis reveals that the encoded amino acids contained significant structural features of Elovl family such as histidine cassettes, multiple transmembrane regions and ER retention signals. The results of sequence alignment show that Elovl4-like gene was highly conserved, and the similarity between the protein sequence encoded by this gene and other fish was 73%−86%, among which Gadus morhua had the highest similarity of 86%. Phylogenetic analysis shows that Elovl4 mainly clustered into three categories (Elovl4a, Elovl4b and Elovl4-like). Among them, ToElovl4-like was closely related with Elovl4-like of other fish. Real-time PCR shows that ToElovl4-like gene was expressed in all tissues, with the highest mRNA expression in gonads and spleens and the lowest in brain. The heterologous expression of yeast shows that ToElovl4-like could extend 18:2n-6 and 20:5n-3 to 20:2n-6 and 22:5n-3, respectively. The study provides a theoretical basis for understanding the biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA).
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长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunstaturated fatty acid, LC-PUFA)一般是指链长≥C20、双键≥3的多不饱和脂肪酸，是具有重要生理功能的PUFA，主要有花生四烯酸(arachidonic acid，ARA，20:4n-6)、二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA，20:5n-3)和二十二碳六烯酸(docosahexenoic acid，DHA，22:6n-3)[1-2]。LC-PUFA是所有细胞膜的重要组成成分，是前列腺素等信号分子的前体，能参与调控许多酶的活性，对新生儿脑和视力的发育具有重要作用[1,3-4]。LC-PUFA一般是由其前体通过去饱和与碳链延长作用等一系列酶促反应合成。与其他脊椎动物一样，由于鱼体内缺乏△12和△15去饱和酶(fatty acyl desaturase，FAD)[5]，不能从头合成PUFA，所以只能从食物中直接获取来满足正常的生长需要，或将吸收的α-亚油酸(linoleic acid, LA，18:2n-6)和α-亚麻酸(Linolenic acid, ALA，18:3n-3)通过长链脂肪酸延长酶(elongases of very long chain fatty acids, Elovl)和去饱和酶合成其他LC-PUFA[2,6]。
Elovl是PUFA合成途径中的关键酶之一，通过其延长活性将短链脂肪酸转化为长链脂肪酸[1]。哺乳动物Elovl家族包含7个成员(Elovl1-7)。其中Elovl2、Elovl4、Elovl5是PUFA合成中的关键酶类[7]。越来越多的研究表明，Elovl4在LC-PUFA的合成中发挥重要作用。在一些物种中，Elovl4已得到鉴定，如斑马鱼(Danio rerio)[8]、大西洋鲑(Salmo salar)[9]、黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)[10]、泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)[7]及其他一些硬骨鱼类[6]。研究发现，Elovl4在多种组织中表达，一般在眼、脑和性腺组织中的表达量较高，且可以延长C18和C20甚至可以延长到C36[1,8,11]。这些研究表明Elovl4具有合成DHA的功能，且在硬骨鱼类LC-PUFA的生物合成中发挥着重要作用。解析硬骨鱼类LC-PUFA生物合成的分子机制，对研发出提高海水鱼将亚油酸和亚麻酸转化为LC-PUFA能力的方法具有重要意义。
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)属鲈形目、鲳鲹属，是亚太地区重要的海水养殖鱼类之一，其肉质鲜美，营养价值高，属于大众食用海水鱼[12-13]。目前关于卵形鲳鲹Elovl在LC-PUFA合成过程中的功能研究少有报道。因此，本研究克隆了卵形鲳鲹的ToElovl4-like基因，分析其在系统进化中的地位，鉴定其在PUFA合成过程中的功能。了解LC-PUFA的生物合成机制，有助于解决在水产饲料中用植物油替代鱼油存在的不良效果问题，同时也为卵形鲳鲹人工配合饲料的研制提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
实验用鱼来源于中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研发中心陵水基地。雌雄各取3尾，每尾体质量约(300±25) g，冰浴麻醉后分别取肝、肠、白肌、脑、脾、鳍条、鳃、肾脏、胃、血液和雌雄性腺共12个组织，液氮速冻，–80 ℃保存，用于提取RNA。
Hipure Total RNA Mini Kit、Hipure Plasmid Mini Kit、PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Eraser、胶回收试剂盒购自广州美基生物科技有限公司；T4 DNA 连接酶、Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶BamH I 和Xho I、DNA maker 、pMD19-T Vector，SYBR® Premix Ex Taq™ II等购自TaKaRa；酿酒酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae) INVSc1、pYES2质粒购自Invitrogen；酵母化学感受态细胞制备试剂盒购自TIANDZ；氨基酸、棉籽糖、半乳糖购自广州普博；脂肪酸底物购自Sigma和Cayman Chemicals公司；测序公司为广州睿博生物有限公司。
1.2 总RNA提取及逆转录
参照Hipure Total RNA Mini Kit说明书提取各组织总RNA，琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，Nanodrop 2000检测RNA浓度。按照PrimeScript® RT reagent Kit with gDNA Erase说明书进行逆转录，获得cDNA。
1.3 Elovl4-like基因克隆
基于本实验室卵形鲳鲹全基因组测序获得的Elovl4-like基因序列。利用Primer Premier 5.0 设计引物Elovl4-like F1/R1 (表1)验证ORF序列[14]。PCR反应体系为25 μL，引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL。反应程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35 个循环；72 ℃ 10 min。通过胶回收、pMD19-T连接、转化进DH5α，筛选出阳性克隆送公司测序。
表 1 Elovl4-like ORF扩增、组织表达和功能验证所需引物Table 1. Sequences of primers used for Elovl4-like cDNA cloning, functional characterization and real-time quantitative PCR引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence用途
applicationElovl4-like F1 ATGGCTTCTGCATGG ORF扩增 Elovl4-like R2 TTATTTCTGCTTCTTC Elovl4-like F2 CGGGGTACCATGGCTTCTGCATGGCAAAGT Elovl4-like R2 CCGCTCGAGTTTCTGCTTCTTCTTGCTGA Elovl4-like qF GTCAGCCTGTCAACTACT qRT-PCR Elovl4-like qR CCACCAGAGGATGAACAT EF-1αF CCCCTTGGTCGTTTTGCC 内参 EF-1αR GCCTTGGTTGTCTTTCCGCT 1.4 生物信息学分析
卵形鲳鲹Elovl4-like的分子量、等电点利用ExPASy (https://web.expasy.org/compute_pi/)进行预测；利用SMART 4.0 (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)对Elovl4-like进行蛋白结构域分析；对Elovl4-like进行糖基化位点预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)、磷酸化位点预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)、信号肽预测 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)、跨膜结构预测(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)；运用Blast检索同源序列(表2)，利用 Clustal X软件进行氨基酸序列多重比对；利用MEGA 6.0软件，选择最大似然法(maximum likelihood, ML)构建系统进化树。
表 2 用于序列比对和构建系统进化树所用物种的基因及序列登录号Table 2. Genes and sequence accession numbers used for alignment and construction of phylogenetic tree物种
species基因
gene登录号
accession No.原鸡 Gallus gallus Elovl4 ENSGALG00000015876 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4a ENSTRUG00000004612 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4b ENSTRUG00000014717 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4-like XP_003974148.1 人 Homo sapiens Elovl4 ENSG00000118402 斑马鱼 Danio rerio Elovl4a ENSDARG00000006773 斑马鱼 Danio rerio Elovl4-like1 ENSDARG00000068551 斑马鱼 Danio rerio Elovl4-like2 ENSDARG00000057365 大西洋鳕 Gadus morhua Elovl4a ENSGMOT00000002680.1 大西洋鳕 Gadus morhua Elovl4-like ENSGMOT00000020430.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4a ENSGACT00000008132.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4b ENSGACT00000017607.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like1 ENSGACT00000016161.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like2 ENSGACG00000012189 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like3 ENSGACG00000012118 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4a ENSTNIG00000002416 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4b ENSTNIG00000010936 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4-like ENSTNIG00000010693 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4a MG674424 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4b MG674425 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4-like MK215859 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4a ENSXMAP00000006115.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4b ENSXMAP00000007217.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4-like1 ENSXMAP00000011156.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4-like2 ENSXMAP00000013098.1 眼斑雀鳝 Lepisosteus oculatus Elovl4-like ENSLOCP00000021081.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4a ENSAMXP00000017270.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4b ENSAMXP00000006663.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4-like ENSAMXP00000005396.1 秀美花鳉 Poecilia formosa Elovl4a ENSPFOP00000018605.2 青鳉 Oryzias latipes Elovl4b ENSORLG00000017019 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4a ENSONIP00000009094.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4b ENSONIP00000000842.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4-like1 ENSONIP00000011380.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4-like2 ENSONIP00000002524.1 1.5 实时荧光定量PCR
利用Beacon designer 7 设计Elovl4-like荧光定量引物Elovl4-like qF/qR (表1)。内参基因的选择和设计参照于文博等[15]。将各组织cDNA模板质量浓度稀释至(50±5) ng·μL–1，利用SYBR Pre-mix ExTaqTM试剂盒(TaKaRa)说明书进行qPCR反应，每个样品和内参设3个重复。实验仪器为Roche LightCycler® 480 II (Roche，瑞士)。实验数据使用△CT法(2–△△CT)进行分析，使用SPSS 23.0 软件进行统计学分析。
1.6 基因功能测定
参照孙潇潇[16]的方法，利用酵母异源表达检测Elovl4-like的功能。在特异性引物Elovl4-like F2/R2的5'端分别引入BamH I和Xho Ⅰ酶切位点(表1中划线部分)及保护碱基。PCR扩增、胶回收目的片段，用pMD19-T连接，构建重组质粒PElovl4-like，转化到DH5α，涂板挑取单克隆，送公司测序。将构建的重组质粒PElovl4-like用BamH I和Xho Ⅰ限制性内切酶进行双酶切。回收纯化Elovl4-like基因的ORF，利用T4 DNA连接酶连接到经相同限制性内切酶消化的pYES2表达载体上，构建的表达载体命名为PYElovl4-like。参照酵母化学感受态细胞制备试剂盒说明书，制备酿酒酵母感受态细胞，将重组质粒PYElovl4-like和空载pYES2分别转化到酿酒酵母INVSc1菌株中，于尿嘧啶缺陷型培养基中培养，筛选出阳性克隆送公司测序。将重组酵母在尿嘧啶缺陷型培养基中培养，根据先前的研究[17]，由半乳糖诱导，在培养基中加入Elovl4-like潜在的脂肪酸底物，包括亚油酸(18:2n-6)、α-亚麻酸(18:3n-3)、γ-亚麻酸(18:3n-6)、十八碳四烯酸(18:4n-3)、花生四烯酸(20:4n-6)、二十碳五烯酸(20:5n-3)、二十二碳五烯酸(22:5n-3)，终浓度分别为0.5 mmol·L–1(C18)、0.75 mmol·L–1(C20)和1.0 mmol·L–1(C22)[18]。在相同条件下转化培养空白pYES2，作为对照组。30 ℃培养48 h后收集菌株，冷冻干燥48 h后置于–80 ℃直至进行脂肪酸分析。参考Oboh等[18]和Li等[19]通过气相色谱法测定各样品所含脂肪酸的种类，根据气相结果，进一步利用气质联用仪(GC-EI-MS)，进而测定各产物脂肪酸的结构。
转化率=产物峰面积/(产物峰面积+底物峰面积)×100%[19-20]。
2. 结果
2.1 序列分析
ToElovl4-like基因cDNA全长2 180 bp，5'非编码区(UTR) 100 bp，3'UTR 1 288 bp。ORF为792 bp，编码263个氨基酸(基因登录号MK215859)。ToElovl4-like蛋白理论分子量为31.01 kD，理论等电点为9.33，有21个磷酸化位点(12个丝氨酸位点，7个酪氨酸位点，2个苏氨酸位点)。无信号肽序列，含1个N-糖基化位点。预测有7个跨膜螺旋(分别位于第28~第50、第63~第85、第111~第133、第140~第159、第169~第191、第203~第225和第235~第257个氨基酸)。其编码区氨基酸包含高度保守的氧化还原中心组氨酸簇(HXXHH)、4个保守基序(KXXEXXDT、QXXFLHXYHH、NXXXHXXNYXYY、TXXQXXQ)、内质网滞留信号(ER)等(图1)。
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图 1 Elovl4-like cDNA序列及推测的氨基酸序列黑色方框表示起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)；阴影部分表示共有保守区域；加黑字体表示组氨酸簇 (HXXHH)；下划线表示预测的7个跨膜区；波浪下划线表示内质网滞留信号Figure 1. Full cDNA and deduced amino acid sequence of Elovl4-likeThe initiation code (ATG) and the termination code (TAA) are boxed; the putative trans-membrane regions are in gray; the putative histidine-rich domain (HXXHH) is bold; the predicted seven (I–VII) putative membrane-spanning domains are underlined; the ER retrieval signal is wavy underlined.2.2 同源性及进化关系分析
多重序列比对表明ToElovl4-like氨基酸序列与其他鱼类具有高度同源性，与大西洋鳕(Gadus morhua) Elovl4-like相似度最高(86%)，与河鲀(Tetraodon nigroviridis)、红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)、墨西哥脂鲤(Astyanax mexicanus)、眼斑雀鳝(Lepisosteus oculatus) Elovl4-like和斑马鱼Elovl4-like1和Elovl4-like2的相似度分别为82%、85%、84%、78%、82%和73% (图2)。
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图 2 卵形鲳鲹Elovl4-like与其他物种的氨基酸序列比对Figure 2. Multiple alignment of deduced amino acid sequence of Elovl4-like from T. ovatus and other species系统发育树显示，Elovl4主要聚为3类，分别为Elovl4a、Elovl4b和Elovl4-like。ToElovl4-like与其他物种的Elovl4-like蛋白聚为一支，其中与斑剑尾鱼(Xiphophorus maculatus)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)、三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)亲缘关系最近，然后与Elovl4、Elovl4b、Elovl4a聚为一大支，这与传统分类学结果一致(图3)。
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图 3 卵形鲳鲹与其他物种Elovl4的最大似然法系统进化树Figure 3. ML phylogenrtic tree based on amino acids of Elovl4 of T. ovatus and other species2.3 Elovl4-like mRNA在不同组织中的表达分析
Elovl4-like mRNA在检测的12种组织中均有表达，其中在雄性性腺、脾、雌性性腺组织中表达量最高，显著高于其他组织(P<0.05)；其次是肠、肝、胃、鳃、白肌、肾脏和鳍条，在脑和血液中表达量最低(图4)。
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图 4 卵形鲳鲹Elovl4-like mRNA在不同组织中的表达分布IN. 肠；LI. 肝；WM. 白肌；BR. 脑；SP. 脾；FI. 鳍；GI. 鳃；KI. 肾脏；ST. 胃；BL. 血；MG. 雄性性腺；FG. 雌性性腺；不同小写字母表示不同组织间差异显著 (P<0.05)Figure 4. Expression level of T. ovatus Elovl4-like gene in different tissuesIN. intestine; LI. liver; WM. white muscle; BR. brain; SP. spleen; FI. fin; GI. gill; KI. kidney; ST. stomach; BL. blood; MG. male gonad; FG. female gonad; Different letters indicate significant difference at 0.05 level among different tissues.2.4 Elovl4-like 基因功能鉴定
利用酿酒酵母异源表达法对卵形鲳鲹Elovl4-like基因进行了功能测定。酿酒酵母内源脂肪酸主要有16:0、16:1n-7、18:0、18:1n-9，不含Elovl酶促反应的底物和产物。通过对酵母菌株的脂肪酸分析，转有空载体pYES2的酿酒酵母脂肪酸组成成分中只有酵母自身的4种内源脂肪酸和添加的外源底物[10]，说明酿酒酵母本身不具有Elovl延长酶活性，适合对Elovl4-like基因进行功能鉴定。图5显示含有Elovl4-like基因的酿酒酵母的重组子可以将18:2n-6、20:5n-3分别转化为20:2n-6、22:5n-3。将添加有Elovl4-like底物脂肪酸酵母样品的脂肪酸甲酯进一步添加到GC-EI-MS中，以分析产物的特定脂肪酸结构(图5)。结果表明，Elovl4-like基因具有延长C18和C20脂肪酸的活性。18:3n-6延长为20:3n-6、20:5n-3延长为22:5n-3的转化率分别为0.83%、0.82% (表3，图5)。
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图 5 Elovl4-like基因的功能鉴定培养基添加的底物为18:2n-6 (A/B)、20:5n-3 (C/D)；A/C为含空载体pYES2质粒的酿酒酵母的脂肪酸组成；B/D为含PYElovl4-like质粒的酿酒酵母的脂肪酸组成；1~4分别表示酿酒酵母内源脂肪酸16:0、16:1n-7、18:0、18:1n-9; 延伸产物用三角符号标记；纵轴和横轴分别代表FID反应和保留时间；E、F分别是产物 20:2n-6和22:5n-3的质谱图Figure 5. Functional identification of Elovl4-like geneThe substrate added to the medium was 18:2n-6 (A/B), 20:5n-3 (C/D); A/C is the fatty acid composition of S. cerevisiae containing the empty vector pYES2 plasmid; B/D is the fatty acid composition of S. cerevisiae containing PYElovl4-like plasmid; 1−4. endogenous fatty acids 16:0, 16:1n-7, 18:0 and 18:1n-9 of S. cerevisiae, respectively; the extension product is marked with a triangle symbol; the vertical and horizontal axis represent the FID response and retention time, respectively; E and F are mass spectra of products 20:2n-6 and 22:5n-3.表 3 卵形鲳鲹Elovl4-like基因在酿酒酵母中的功能鉴定Table 3. Functional characterization of Elovl4-like gene in T. ovatus底物脂肪酸
FA substrate产物
product转化率/%
conversion活性
activity亚油酸 18:2n-6 20:2n-6 0.83 C18 → C20 γ-亚麻酸 18:3n-6 20:3n-6 0 C18 → C20 二十碳五烯酸 20:5n-3 22:5n-3 0.82 C20 → C22 α-亚麻酸 18:3n-3 20:3n-3 0 C18 → C20 十八碳四烯酸 18:4n-3 20:4n-3 0 C18 → C20 花生四烯酸 20:4n-6 22:4n-6 0 C20 → C22 二十二碳四烯酸 22:4n-6 24:4n-6 0 C22 → C24 二十二碳五烯酸 22:5n-3 24:5n-3 0 C22 → C24 二十二碳六烯酸 22:6n-3 24:6n-3 0 C22 → C24 3. 讨论
Elovl是不饱和脂肪酸合成过程中关键的限速酶，主要参与通过催化酰基辅酶A类物质中的2个碳原子进入脂肪链中的过程，其基因的表达量和酶的活性直接影响PUFA 的合成能力[21]。
本研究首次获得了卵形鲳鲹ToElovl4-like的基因序列，全长2 180 bp，其中ORF 792 bp，编码263个氨基酸，预测的卵形鲳鲹ToElovl4-like氨基酸序列有7个跨膜区，这与点带石斑鱼(Epinephelus coioides)[22]中推定的Elovl4的5个跨膜螺旋和箕作黄姑鱼(Nibea mitsukurii)[1]中推定的Elovl4的6个跨膜螺旋不同，但是与黑鲷(A. schlegelii)[10]中Elovl4a与Elovl4b的7个跨膜螺旋一致。编码的氨基酸序列具有Elovl家族的显著结构特征[10,23]，如内质网滞留信号、多个保守区和高度保守的氧化还原中心组氨酸簇。在不同的鱼类中这些活性位点高度保守，可能参与酶活性的调控，但是其活性和底物存在一定差异。在哺乳动物中发现的延长酶种类最多，含有7个成员(Elovl1-7)，对不同脂肪酸表现出不同的底物特异性[24]。Elovl1/3/4/6主要催化饱和和单不饱和脂肪酸的延长反应，而Elovl2/4/5主要延长多不饱和脂肪酸[25]。但对于同一种酶而言，鱼的种类不同，其底物特异性又有一定的差异。一般认为淡水鱼类的PUFA合成能力高于海水鱼类[26]。海水环境相对于淡水环境含有较多的PUFAs，海水鱼比较容易从外界环境获得PUFA，因此海水鱼中PUFA合成过程中的关键酶(Fads和Elovl)活性降低，从而导致海水鱼与淡水鱼的PUFA合成能力不同[27]。序列比对发现，ToElovl4-like与其他物种的Elovl4-like同源性较高，具有高度保守的结构域；在系统进化树中，与其他物种的Elovl4-like聚于一支，然后分别与Elovl4、Elovl4b、Elovl4a聚为一大支，符合分子生物学进化理论，说明延长酶的进化较为保守。
ToElovl4-like在所有组织中均表达，且表达量有一定差异，说明在不同的组织中其参与脂肪代谢的程度不同。在雄性和雌性性腺中表达量高，说明其参与了性腺中重要磷脂的合成，对性腺的发育可能起到重要作用。与雄性性腺表达量相比，ToElovl4-like在雌性性腺中的表达量略低，这可能是因为在性腺发育过程中，雄性性腺对PUFA的需求量更高[9]。在脾和胃等组织中表达较高，说明其可能参与了重要组织的生长发育。在肝和肠中的表达量较高，说明其参与了脂肪酸的代谢过程[24]。本研究中，ToElovl4-like在脑组织中的表达量不高，这与文献中描述的Elovl4基因在超长链脂肪酸(very long-chain fatty acids, VLC-Fas)需要量高的脑组织中表达量相对较高[28]不同，这说明该基因不参与或较少参与超长链脂肪酸的合成。
气相色谱分析表明ToElovl4-like基因可以延长18:2n-6和20:5n-3，表明其对C18和C20底物具有延长活性，对LC-PUFA合成发挥了一定作用。但其功能活性较弱，转化率仅为0.83%和0.82%。而在斑马鱼[8]、点带石斑鱼[22]、泥鳅[7]、黑鲷[10]中20:5n-3延长为22:5n-3的转化效率分别为9.2%、29.9%、6.87%、26.4%。在泥鳅[7]中，将18:2n-6转化为20:2n-6的效率为1.26%。ToElovl4-like延长效率较其他鱼类中的同源基因低，可能与饵料中含有丰富的LC-PUFA有关，从而导致相关功能基因表达水平较低。一般来说，大部分鱼类Elovl对n-3系列的LC-PUFA底物活性大于等于n-6[29]，但是在本研究中没有明显区别，同时C18和C20转化效率相近。
综上，本研究克隆了卵形鲳鲹脂肪酸延长酶基因ToElovl4-like，其在检测的组织中均有表达，其中在雄性性腺、脾和雌性性腺中表达量最高，鉴定了其功能活性。通过了解水生生物脂肪酸延长酶的功能，有利于确定不同水生生物对脂肪酸的需求。本研究的结果对于揭示卵形鲳鲹LC-PUFA生物合成的分子机制、完善鱼类LC-PUFA合成途径具有重要的理论意义；同时有助于探究鱼类合成PUFA能力的影响因素，提高其对植物油的利用能力。
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图 1 Elovl4-like cDNA序列及推测的氨基酸序列
黑色方框表示起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)；阴影部分表示共有保守区域；加黑字体表示组氨酸簇 (HXXHH)；下划线表示预测的7个跨膜区；波浪下划线表示内质网滞留信号
Figure 1. Full cDNA and deduced amino acid sequence of Elovl4-like
The initiation code (ATG) and the termination code (TAA) are boxed; the putative trans-membrane regions are in gray; the putative histidine-rich domain (HXXHH) is bold; the predicted seven (I–VII) putative membrane-spanning domains are underlined; the ER retrieval signal is wavy underlined.
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图 2 卵形鲳鲹Elovl4-like与其他物种的氨基酸序列比对
Figure 2. Multiple alignment of deduced amino acid sequence of Elovl4-like from T. ovatus and other species
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图 3 卵形鲳鲹与其他物种Elovl4的最大似然法系统进化树
Figure 3. ML phylogenrtic tree based on amino acids of Elovl4 of T. ovatus and other species
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图 4 卵形鲳鲹Elovl4-like mRNA在不同组织中的表达分布
IN. 肠；LI. 肝；WM. 白肌；BR. 脑；SP. 脾；FI. 鳍；GI. 鳃；KI. 肾脏；ST. 胃；BL. 血；MG. 雄性性腺；FG. 雌性性腺；不同小写字母表示不同组织间差异显著 (P<0.05)
Figure 4. Expression level of T. ovatus Elovl4-like gene in different tissues
IN. intestine; LI. liver; WM. white muscle; BR. brain; SP. spleen; FI. fin; GI. gill; KI. kidney; ST. stomach; BL. blood; MG. male gonad; FG. female gonad; Different letters indicate significant difference at 0.05 level among different tissues.
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图 5 Elovl4-like基因的功能鉴定
培养基添加的底物为18:2n-6 (A/B)、20:5n-3 (C/D)；A/C为含空载体pYES2质粒的酿酒酵母的脂肪酸组成；B/D为含PYElovl4-like质粒的酿酒酵母的脂肪酸组成；1~4分别表示酿酒酵母内源脂肪酸16:0、16:1n-7、18:0、18:1n-9; 延伸产物用三角符号标记；纵轴和横轴分别代表FID反应和保留时间；E、F分别是产物 20:2n-6和22:5n-3的质谱图
Figure 5. Functional identification of Elovl4-like gene
The substrate added to the medium was 18:2n-6 (A/B), 20:5n-3 (C/D); A/C is the fatty acid composition of S. cerevisiae containing the empty vector pYES2 plasmid; B/D is the fatty acid composition of S. cerevisiae containing PYElovl4-like plasmid; 1−4. endogenous fatty acids 16:0, 16:1n-7, 18:0 and 18:1n-9 of S. cerevisiae, respectively; the extension product is marked with a triangle symbol; the vertical and horizontal axis represent the FID response and retention time, respectively; E and F are mass spectra of products 20:2n-6 and 22:5n-3.
表 1 Elovl4-like ORF扩增、组织表达和功能验证所需引物
Table 1 Sequences of primers used for Elovl4-like cDNA cloning, functional characterization and real-time quantitative PCR
引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence用途
applicationElovl4-like F1 ATGGCTTCTGCATGG ORF扩增 Elovl4-like R2 TTATTTCTGCTTCTTC Elovl4-like F2 CGGGGTACCATGGCTTCTGCATGGCAAAGT Elovl4-like R2 CCGCTCGAGTTTCTGCTTCTTCTTGCTGA Elovl4-like qF GTCAGCCTGTCAACTACT qRT-PCR Elovl4-like qR CCACCAGAGGATGAACAT EF-1αF CCCCTTGGTCGTTTTGCC 内参 EF-1αR GCCTTGGTTGTCTTTCCGCT 
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表 2 用于序列比对和构建系统进化树所用物种的基因及序列登录号
Table 2 Genes and sequence accession numbers used for alignment and construction of phylogenetic tree
物种
species基因
gene登录号
accession No.原鸡 Gallus gallus Elovl4 ENSGALG00000015876 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4a ENSTRUG00000004612 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4b ENSTRUG00000014717 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4-like XP_003974148.1 人 Homo sapiens Elovl4 ENSG00000118402 斑马鱼 Danio rerio Elovl4a ENSDARG00000006773 斑马鱼 Danio rerio Elovl4-like1 ENSDARG00000068551 斑马鱼 Danio rerio Elovl4-like2 ENSDARG00000057365 大西洋鳕 Gadus morhua Elovl4a ENSGMOT00000002680.1 大西洋鳕 Gadus morhua Elovl4-like ENSGMOT00000020430.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4a ENSGACT00000008132.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4b ENSGACT00000017607.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like1 ENSGACT00000016161.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like2 ENSGACG00000012189 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like3 ENSGACG00000012118 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4a ENSTNIG00000002416 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4b ENSTNIG00000010936 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4-like ENSTNIG00000010693 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4a MG674424 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4b MG674425 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4-like MK215859 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4a ENSXMAP00000006115.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4b ENSXMAP00000007217.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4-like1 ENSXMAP00000011156.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4-like2 ENSXMAP00000013098.1 眼斑雀鳝 Lepisosteus oculatus Elovl4-like ENSLOCP00000021081.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4a ENSAMXP00000017270.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4b ENSAMXP00000006663.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4-like ENSAMXP00000005396.1 秀美花鳉 Poecilia formosa Elovl4a ENSPFOP00000018605.2 青鳉 Oryzias latipes Elovl4b ENSORLG00000017019 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4a ENSONIP00000009094.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4b ENSONIP00000000842.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4-like1 ENSONIP00000011380.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4-like2 ENSONIP00000002524.1
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表 3 卵形鲳鲹Elovl4-like基因在酿酒酵母中的功能鉴定
Table 3 Functional characterization of Elovl4-like gene in T. ovatus
底物脂肪酸
FA substrate产物
product转化率/%
conversion活性
activity亚油酸 18:2n-6 20:2n-6 0.83 C18 → C20 γ-亚麻酸 18:3n-6 20:3n-6 0 C18 → C20 二十碳五烯酸 20:5n-3 22:5n-3 0.82 C20 → C22 α-亚麻酸 18:3n-3 20:3n-3 0 C18 → C20 十八碳四烯酸 18:4n-3 20:4n-3 0 C18 → C20 花生四烯酸 20:4n-6 22:4n-6 0 C20 → C22 二十二碳四烯酸 22:4n-6 24:4n-6 0 C22 → C24 二十二碳五烯酸 22:5n-3 24:5n-3 0 C22 → C24 二十二碳六烯酸 22:6n-3 24:6n-3 0 C22 → C24
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