Characterization and function analysis of Elovl4-like elongase gene in golden pompano (Trachinotus ovatus)
-
摘要:
长链脂肪酸延长酶(elongases of very long chain fatty acids, Elovls)是长链多不饱和脂肪酸(long chain polyunsaturated fatty acid, LC-PUFA)生物合成途径中的关键限速酶，能够延长PUFA的碳链。为探究Elovl4在卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus) PUFA生物合成中的功能，该研究克隆了卵形鲳鲹Elovl4基因的cDNA序列，命名为ToElovl4-like，其开放阅读框(ORF)为792 bp，编码263个氨基酸。生物信息学分析结果表明，编码的氨基酸包含Elovl家族的显著结构特征如组氨酸盒子、多个跨膜区和ER滞留信号等。序列比对结果显示，卵形鲳鲹Elovl4-like基因高度保守，且该基因编码的蛋白序列与其他鱼类的相似度为73%~86%，其中与大西洋鳕(Gadus morhua)的相似度最高(86%)。系统进化分析表明，Elovl4主要聚为Elovl4a、Elovl4b和Elovl4-like 3类。其中ToElovl4-like与其他鱼类的Elovl4-like亲缘关系最近。实时荧光定量PCR表明ToElovl4-like基因在各组织中均有表达，其中在性腺和脾中mRNA表达量最高，在脑中mRNA表达量最低。酵母异源表达分析表明，ToElovl4-like可以分别将亚油酸 (18:2n-6)、二十碳五烯酸 (20:5n-3)延长为二十碳二烯酸 (20:2n-6)和二十二碳五烯酸 (22:5n-3)。研究结果为了解鱼类长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)的生物合成提供了理论基础。
-
关键词:
- 卵形鲳鲹 /
- Elovl4-like /
- 异源表达 /
- 功能鉴定
Abstract:The elongases of very long chain fatty acids (Elovls), which are key rate-limiting enzymes in the long-chain polyunsaturated fatty acid (LC-PUFA) biosynthesis pathway, can extend the carbon chain of PUFAs. To investigate the function of Elovl4 in PUFA biosynthesis of Trachinotus ovatus, we cloned its cDNA sequence (ToElovl4-like), whose open reading frame (ORF) was 792 bp, encoding 263 amino acids. Bioinformatics analysis reveals that the encoded amino acids contained significant structural features of Elovl family such as histidine cassettes, multiple transmembrane regions and ER retention signals. The results of sequence alignment show that Elovl4-like gene was highly conserved, and the similarity between the protein sequence encoded by this gene and other fish was 73%−86%, among which Gadus morhua had the highest similarity of 86%. Phylogenetic analysis shows that Elovl4 mainly clustered into three categories (Elovl4a, Elovl4b and Elovl4-like). Among them, ToElovl4-like was closely related with Elovl4-like of other fish. Real-time PCR shows that ToElovl4-like gene was expressed in all tissues, with the highest mRNA expression in gonads and spleens and the lowest in brain. The heterologous expression of yeast shows that ToElovl4-like could extend 18:2n-6 and 20:5n-3 to 20:2n-6 and 22:5n-3, respectively. The study provides a theoretical basis for understanding the biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA).
-
高白鲑(Coregonus peled)隶属于鲑科、白鲑属，为典型高好氧冷水性鱼类，具有较高的经济价值。中国学者于1998年开始从俄罗斯引种到赛里木湖[1]。高白鲑具有适应性强、肉味鲜美、营养丰富、生长速度快等特点，近年来倍受国内外水产市场的青睐。然而，由于高白鲑出水即死的生理特性，使其加工运输及贮藏保鲜成为保证鱼肉品质的关键因素。因此，可通过控制和改良原料特性、加工工艺、包装及保藏方法和使用高效安全优质的食品添加剂来提高食品品质，以满足广大消费者的需求。大豆分离蛋白(soybean protein isolation, SPI)是大豆中的优质蛋白，是植物蛋白中为数不多的可替代动物蛋白的品种之一，可通过结合肌肉中的脂肪和水分有效减少肉制品的汁液流失，防止脂肪析出，还能改善肉制品的质构和风味，并且保持肌肉组织的完整性[2]。谷朊粉(gluten powder, GP)又称活性面筋粉，是以小麦为原料，经过深加工提取的一种天然谷物蛋白，可作为一种天然的保健食品配料或添加剂，广泛用于各类食品。在肉制品中，谷朊粉能够在结合脂肪和水分的同时增加蛋白质含量，增加保水性、黏弹性、硬度及色泽稳定性等，降低了保油性和加工损耗[3]。乳清蛋白(whey protein, WP)作为蛋白质的替代原料，可以提高营养价值，改善产品质量，广泛应用于食品与医药工业。在肉制品中应用乳清蛋白，不仅可以改善其凝胶特性，而且能够提高持水性，改善肉制品风味、口感和组织结构[4]。但是目前非肌肉蛋白添加物在水产品中主要应用于鱼糜、鱼丸制品中，以提高鱼糜制品的凝胶特性及质构特性[5-7]，而在鱼肉贮藏保鲜过程中的应用研究鲜有报道。
微冻保鲜是将水产品的温度降低至其冰点以下1~2 ℃，并在该温度下进行保藏的一种轻度冷冻的保鲜方法[8]。通过测定，高白鲑冰点温度为 –1.3 ℃，因此本实验选择 –3 ℃为高白鲑微冻贮藏温度。本研究主要探讨SPI、GP和WP对高白鲑在微冻贮藏条件下理化品质、质构特性以及组织结构的影响，以期为非肌肉蛋白在高白鲑贮藏保鲜中应用提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
12尾高白鲑捕捞自新疆博州赛里木湖，每尾质量约800 g，长约36 cm。运至实验室在低温环境中将其击晕、致死并放血后去鳞、去内脏、去头，用预冷水清洗干净，去皮、剔除鱼骨备用。
大豆分离蛋白(蛋白质质量分数≥90%)、谷朊粉(蛋白质质量分数≥85%) (郑州博研生物科技有限公司)、乳清蛋白粉(蛋白质质量分数≥80%) (河南金城生物科技有限公司)均为食品级；戊二醛固定液(Biotopped公司)；TA. XT Plus型质构仪(英国Stable Micro Systems公司)；JSM-6490LV扫描电子显微镜(日本JEOL公司)。
1.2 样品处理
将背部肌肉分割成2 cm× 2 cm× 2 cm大小的鱼肉块，随机分为4组，第一组作为空白对照，第二组添加3% SPI (按肉总质量计，后同)，第三组添加3% GP，第四组添加3% WP，混匀后将其于4 ℃下放置2 h，随后将各组肉块装在封口袋中于 –3 ℃冰箱中贮藏，理化指标、感官评定和质构特性每隔7 d取出测定，测定至第49天，组织微观结构于贮藏第21和第49天进行测定。
1.3 感官评价
本实验感官评价小组由具有感官评定经验的10位研究生组成，对高白鲑肌肉的表观状态进行评判，评定标准见表1。对鱼肉的色泽、气味、肌肉弹性及组织状态4个方面进行感官评分，每个指标最高分为5分，最低分为1分。10人评价结果的平均值作为最终感官分值，得分20分表示一级新鲜，10分以上表示二级新鲜，6分及以下表示鱼肉已达到不可接受的程度。
表 1 高白鲑感官评价标准Table 1. Standard of sensory evaluation on C.peled评价指标
evaluation index5 (好)
well4 (较好)
better3 (一般)
general2 (较差)
worse1 (极差)
worst色泽 color 色泽正常，肌肉切面富
有光泽色泽正常，肌肉切面
有光泽色泽稍暗淡，肌肉切面稍有光泽 色泽稍暗淡，肌肉切面无光泽 色泽暗淡，肌肉切面无光泽 气味 odor 固有香味浓郁 固有香味较浓郁 香味清淡，略带异味 固有香味消失，有腥味或氨臭味 有强烈腥臭味或
氨味肌肉弹性 elasticity 坚实富有弹性，手指按压后凹陷立即消失 坚实有弹性，手指按压后凹陷较快消失 较有弹性，手指按压后凹陷消失较慢 稍有弹性，手指按压后凹陷消失很慢 无弹性，手指按压后凹陷不消失 组织状态
form of organization肌肉组织致密完整，纹理很清晰 肌肉组织紧密，纹理较清晰 肌肉组织不紧密但不松散 肌肉组织不紧密，局部松散 肌肉组织很不紧密，松散 1.4 理化指标的测定
1.4.1 pH的测定
称取鱼肉样品5.0 g并捣碎，加入50 mL蒸馏水，搅匀后静置30 min后过滤，取滤液10 mL，用pH计测定。
1.4.2 电导率的变化
称取鱼肉样品5.0 g，用组织捣碎机进行搅拌，绞碎的肌肉置于烧杯中，加入蒸馏水至50 mL，搅匀后静置30 min后过滤，取其滤液用DDS-307型电导率仪测定其电导率[9]。
1.4.3 持水力的测定
持水力的测定用离心法[10]，即将10.0 g的样品在4 ℃下以3 000×g离心20 min，离心管质量为W0，离心前样品和离心管的质量为W1，离心后样品和离心管的质量为W2，持水力(water-holding capacity, WHC)按以下公式计算：
$$\quad\quad\quad\quad\quad\quad{\rm{WHC}}= \frac{{{{W}}_2 - {{W}}_0}}{{{{W}}_1 - {{W}}_0}} \times 100 \%$$ 1.5 全质构分析测试
采用质构分析仪对鱼肉样品进行压缩测试，选用P/36R平底圆柱形探头在TPA模式下进行测量，测定参数包括硬度(hardness)、黏附性(adhesiveness)、弹性(springiness)、内聚性(cohesiveness)、咀嚼性(chewiness)和回复性(resilience)。将鱼肉块置于样品台上，鱼刺的方向平行于载物台。参数设定为测试前速度1.0 mm·s–1，测试速度2.0 mm·s–1，测试后速度2.0 mm·s–1，目标压缩距离5.00 mm，触发力10.0 g，数据采集速率200 pps。
1.6 扫描电镜观察
扫描电镜(scanning electronic microscopy，SEM)样品操作根据Xiong等[11]的方法并稍作修改。将样品横切(垂直肌原纤维方向)成约3 mm×3 mm×2 mm的小块，将取得的样品用2.5%戊二醛溶液浸泡24 h固定。然后用0.1 mol·L–1磷酸缓冲液(pH 7.4)重复洗涤3次，每次洗涤15 min。接着分别用体积分数为30%、50%、70%、90%乙醇各脱水1次，再用100%乙醇脱水2次，每次均为15 min。然后用醋酸异戊酯置换15 min，将置换后的样品进行冷冻干燥处理后，用离子溅射仪在表面镀上一层10 nm厚的铂金膜，调节SEM相关参数后进行结构观察、拍照。
1.7 数据处理
实验均为6次独立的重复实验，除扫描电镜结果外，其他数据采用SPSS 17.0软件进行差异显著性分析，并用Origin 8.5软件进行制图。
2. 结果
2.1 感官评价
依据表1的感官评价标准对微冻贮藏的高白鲑进行感官评价(图1)。随着贮藏时间的延长，高白鲑的感官评分逐渐降低，且对照组的下降速率较处理组的快。对照组高白鲑在贮藏至第35天时感官评分值降至10分，在贮藏至第49天时下降至5.5分，与初始值相比下降了72.2%，表明鱼肉已经发生腐败，鱼肉开始出现强烈臭味或氨味，肌肉组织松散，切面无光泽，失去食用价值。而GP和WP处理组在贮藏至第42天时感官评分值仍大于10分，说明鱼肉色泽正常，切面有光泽，稍有香味，肌肉较有弹性，手指按压后凹陷消失较慢，肌肉组织相对完整但有局部松散。在贮藏至第49天时感官评分值分别下降至8.7分和9分，仍在可接受的范围内。SPI处理组的高白鲑感官评分值在贮藏至第42天时降至9.8分，贮藏至第49天时降至7.8分，较初始值下降60%，仍在可接受范围内。
![]()
图 1 3种非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑感官分值变化的影响Figure 1. Effect of three kinds of non-muscle protein additives on sensory score change of partially frozen C.peled2.2 高白鲑理化指标的变化
不同非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑理化品质影响的结果见表2。新鲜高白鲑的初始pH为6.78，添加SPI、GP和WP后其pH分别降低至6.76、6.69和6.72。随着贮藏时间的延长，对照组和处理组的pH均呈先下降后上升的变化趋势，对照组样品pH在贮藏第21天达到最低点(6.51)，SPI、GP和WP处理组在贮藏第28 天分别达到最低点(6.56、6.35和6.30)，差异显著(P<0.05)，对照组高白鲑在贮藏至第35天时pH便达到6.80，超过了新鲜鱼肉的pH，贮藏至第49天达到最大值6.95，与初始pH有显著性差异(P<0.05)，而SPI、GP和WP处理组pH分别上升至6.71、6.59和6.60，均显著低于初始值(P<0.05)，与对照组也有显著差异(P<0.05)，且GP的作用效果最显著(P<0.05)。
表 2 3种非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑理化指标的影响Table 2. Effect of three kinds of non-muscle protein additives on physicochemical properties of partially frozen C.peled理化指标
physicochemical property贮藏时间/d
storage time对照组
control group大豆分离蛋白
soy protein isolation谷朊粉
gluten powder乳清蛋白
whey proteinpH 0 6.78±0.006Ac 6.76±0.010Ba 6.69±0.010Da 6.72±0.006Ca 7 6.65±0.006Bd 6.71±0.006Ab 6.53±0.000Dc 6.56±0.006Cc 14 6.57±0.006Be 6.65±0.006Ad 6.37±0.006Dd 6.53±0.000Cd 21 6.51±0.010Bf 6.59±0.010Af 6.36±0.010Dde 6.42±0.010Cf 28 6.56±0.006Ae 6.56±0.006Ag 6.37±0.010Be 6.30±0.010Cg 37 6.80±0.037Ad 6.63±0.006Be 6.53±0.006Cc 6.48±0.010De 42 6.65±0.037Ab 6.68±0.006Bc 6.54±0.006Cc 6.53±0.006Dd 49 6.95±0.006Aa 6.71±0.006Bb 6.59±0.006Cb 6.60±0.006Cb 电导率/μS·cm–1 electrocon-ductivity 0 676.00±1.000Ag 652.00±5.292Cf 616.67±5.132Df 660.67±4.041Bh 7 1 301.37±4.509Af 1 209.00±4.000Be 971.00±4.000De 1 123.37±7.371Cg 14 1 375.67±10.970Ae 1 237.37±7.637Bd 977.00±2.000De 1 137.00±8.185Cf 21 1 374.37±14.224Ade 1 242.00±4.583Bd 995.37±10.263Dd 1 373.67±5.508Ce 28 1 394.67±9.292Ad 1 300.00±1.000Bc 1 046.67±8.737Dc 1 183.37±6.658Cd 37 1 431.67±4.509Ac 1 304.37±4.509Bc 1 070.00±3.000Db 1 234.37±1.528Cc 42 1 449.67±7.506Ab 1 374.67±7.572Bb 1 077.37±7.234Db 1 252.67±8.505Cb 49 1 469.67±6.110Aa 1 365.67±2.082Ba 1 126.00±3.000Da 1 318.67±5.037Ca 持水力/%
water holding capacity0 85.48±1.121Aa 85.84±0.84Aa 86.37±1.394Aa 85.98±0.649Aa 7 79.49±2.373Bb 82.25±2.006ABb 83.98±2.079Aab 81.93±2.128ABb 14 73.90±1.703Bc 78.96±2.456Ac 81.17±0.907Ab 80.87±1.425Ab 21 72.24±1.197Bc 76.91±1.537Acd 78.09±2.437Ac 79.34±1.955Ab 28 68.81±1.982Bd 74.69±1.522Ad 74.63±1.485Ad 76.42±0.920Ac 37 64.00±1.490Be 70.58±1.541Ae 71.52±1.587Ae 70.37±2.026Ad 42 59.19±1.767Cf 62.90±2.562BCf 66.92±2.048Af 65.61±1.527ABe 49 55.06±2.149Bg 61.60±1.531Af 64.00±1.540Af 61.93±1.111Af 注：表中值为平均值±标准差，大写字母表示同行各组之间的差异显著性，小写字母表示同列各组之间的差异显著性；字母不同者表示差异显著，相同表示差异不显著，显著性水平P<0.05 Note: The values are shown as $ \scriptstyle \overline X \pm {\rm SD} $; the values with different uppercase letters within the same line and those with different lowercase letters within the same column are significantly different at the level of 0.05, respectively, while the values with the same letters are not significantly different. 在微冻贮藏过程中，随着时间的增加，对照组和处理组样品的电导率均不断上升，且在贮藏前7 d，对照组与SPI、GP和WP处理组的电导率均急剧上升，而GP添加组的电导率最小，其次为WP、SPI添加组，与对照组相比均有显著性差异(P<0.05，表2)。此外，在整个贮藏期，SPI、GP和WP处理组与对照组之间其电导率均有显著性差异(P<0.05)，且SPI、GP和WP处理组的电导率上升速率为GP<WP<SPI。
在微冻贮藏期间，对照组高白鲑肌肉的持水力随着时间的延长呈明显的下降趋势，GP添加组的持水力除初始值外均与对照组有显著性差异(P<0.05)，而与SPI和WP添加组的持水力无明显的差异(P>0.05)。贮藏至第49天，对照组与SPI、GP和WP添加组的持水力较初始持水力分别下降了35.59%、28.24%、25.71%和27.97%，GP添加组的下降程度最小。
2.3 高白鲑质构特性的变化
食品的质构是消费者判断许多食品品质的主要标准之一，质构特性是高白鲑重要的品质特性之一，也是评价其新鲜度的一个重要依据。硬度为表现鱼肉软硬程度的一项重要指标，它既可理解为是鱼肉抵抗弹性变形、塑性变形或破坏的能力，也可表述为抵抗残余变形和反破坏的能力；黏附性是指探头脱离样品所需能量大小，反映在咀嚼鱼肉时，其表面与舌、齿等物体黏在一起的力；弹性反映了外力作用时变性及去除力后的恢复程度；内聚性反映的是咀嚼鱼肉时，鱼肉抵抗受损并紧密连接使其保持完整的性质，它同样反映细胞间结合力的大小，但与黏附性反映的鱼肉的性质恰好相反；咀嚼性为模拟鱼肉样品咀嚼成吞咽时所需的能量，即所说的咬劲；回复性反映的是鱼肉在受压状态下快速恢复变形的能力。图2显示3种不同非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑质构特性的影响结果。高白鲑质构各指标在贮藏期间内都发生了显著的变化，其中对照组的硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性都是在宰杀当天检测出现最大值，分别为(22.273±1.8) N、0.827±0.028、0.067±0.011、(9.929±0.876) N和0.372±0.015，而黏附性显示最小值为(–38.032±1.842) g·s–1，与随后贮藏期间相应指标差异显著(P<0.05)。说明宰杀时鱼肉为最新鲜，符合实际情况，随着贮藏时间的延长，相应肉质指标降低，显示高白鲑肌肉品质逐渐变差，质量降低。SPI和WP添加组的硬度、内聚性、咀嚼性和回复性在第0 天(即放置2 h后的样品)也检测出最大值，弹性在贮藏前期有上升趋势，后期随着时间的延长逐渐降低，黏附性的初始值都显示最小值分别为(–38.365±1.312) g·s–1、(–38.832±0.811) g·s–1和(–38.532±1.354) g·s–1，与随后贮藏期间有显著性差异(P<0.05)。
![]()
图 2 3种非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑肌肉质构特性的影响Figure 2. Effect of three kinds of non-muscle protein additives on textural properties of partially frozen C.peled在整个微冻贮藏期间，SPI、GP和WP添加组的硬度除初始值外均显著高于对照组(P<0.05)，且GP添加组的硬度较SPI和WP添加组的高，在贮藏至第35天后，3个处理组之间无显著差异(P>0.05，图2-a)。SPI添加组高白鲑的黏附性在贮藏前14 d与对照组无明显差异，而在第14天之后与对照组之间有显著差异(P<0.05)，与GP和WP添加组的黏附性在整个贮藏期都有明显差异(图2-b)。此外，GP和WP添加组的黏附性在整个微冻期间也与对照组有显著差异(P<0.05)。在贮藏期内，SPI、GP和WP添加组的弹性均显著高于对照组，且GP添加组相对更高(P<0.05)，在贮藏第14天，SPI和WP添加组的弹性升高至最大值，分别为0.850±0.007和0.885±0.014，而GP添加组的弹性在贮藏前21 d呈现上升趋势，从初始0.857±0.029上升至最大值0.890±0.011，而后趋于下降(图2-c)。在贮藏期间，SPI、GP和WP添加组的内聚性和回复性在贮藏前7 d无明显差异，之后GP添加组的内聚性和回复性明显高于对照组，且GP添加组的咀嚼性在贮藏期内显著高于对照组(P<0.05)，而SPI和WP添加组的咀嚼性与对照组无明显差别(图2-d~f)。
2.4 高白鲑肌肉微观结构的变化
不同非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑肌肉微观结构的影响见图3，对照组的新鲜高白鲑肌肉的肌纤维排列平行紧密、轮廓清晰，肌束间界限分明，肌内膜表面光滑，原生质分布均匀(图3-A1)，SPI、GP和WP的添加使高白鲑肌肉肌纤维之间以及肌纤维与结缔组织排列更加紧密，内部结缔组织排列整齐(图3-A2，A3，A4)。贮藏第21天对照组高白鲑肌肉肌束间空隙增大、肌纤维内部发生断裂(图3-B1)，而SPI、GP和WP添加组的高白鲑肌肉组织结构保持得较完整，肌束间间隙有所增加，但肌纤维之间只有较小的分离(图3-B2，B3，B4)，与对照组相比差异显著；此外，肌纤维完整程度GP添加组>SPI添加组>WP添加组。贮藏至第49天时，对照组肌纤维断裂程度极其明显，肌细胞已经失去其原有的完整结构，肌纤维发生收缩和卷曲、结缔组织被破坏(图3-C1)，GP添加组的高白鲑肌肉肌纤维的轮廓变得模糊，肌纤维也发生了一定程度的收缩(图3-C3)，SPI添加组的高白鲑肌肉肌纤维内部空隙逐渐变大(图3-C2)，WP添加组的高白鲑肌肉肌纤维完整性受到破坏，肌纤维收缩较强，排列混乱(图3-C4)。
![]()
图 3 3种非肌肉蛋白添加物对微冻贮藏高白鲑肌肉微观机构的影响A组. 第0天不同处理样品的电镜图；B组. 贮藏第21天不同处理样品的电镜图；C组. 贮藏第49天不同处理样品的电镜图Figure 3. Effect of three kinds of non-muscle protein additives on microstructure of partially frozen C.Peled muscleGroup A. microstructures of different treatments on the first day; Group B. microstructures of different treatments on the 21st day; Group C. microstructure of different treatments on the 49th day3. 讨论
鱼肉的pH可以作为鱼体致死后发生的生化变化的一项重要指标。微冻贮藏期间对照组和处理组的pH均呈现典型的“V”型变化趋势，与高昕等[12]和张丽娜等[13]的研究中pH的变化趋势一致。这可能是由于鱼体死后贮藏前期，肌肉中的糖类物质经酵解产生少量乳量等酸性物质，致使pH下降。而后随着贮藏时间的增加，鱼体内内源酶及微生物的作用，致使蛋白质分解产生氨基酸、胺及吲哚等碱类物质，导致pH又逐渐上升[14]。此外，随着时间的延长，鱼肉中的蛋白质、脂肪等在分解过程中会产生许多小分子物质，产生大量离子，致使鱼肉浸出液中产生大量具有导电能力的物质，导致电导率不断增加[15]，也使肌肉持水力也明显下降。高白鲑在微冻贮藏期间质构特性的变化趋势与Bao等[16]对圆头鲂(Megalobrama amblycephala)在冷藏和微冻条进下质构变化的比较研究以及张龙腾等[17]对鲢(Hypophthalmichehys molitrix)鱼片在微冻贮藏中质构特性的变化研究有类似的结果，其中硬度、弹性和内聚性随着微冻时间的延长而逐渐降低。在微冻贮藏前期，肌肉组织中逐渐形成细小的冰晶，致使鱼肉组织细胞破裂，细胞间结合力下降，肌肉硬度、弹性、内聚性等质构品质下降。而后随着时间的延长，细小的冰晶逐渐长大形成较大的冰晶，进而使肌纤维产生断裂，空隙增大，蛋白质结构发生变化，造成营养和风味以及持水性下降[18-19]。而SPI、GP和WP的添加在一定程度上减缓了鱼肉pH、电导率和持水力的变化，这可能是由于非肌肉蛋白添加物抑制了内源性蛋白酶活性和部分微生物生长繁殖，从而降低蛋白质等的降解变性，也减少了鱼肉浸出液中具有导电能力的小分子的产生[20]。同时，由于SPI、GP和WP所具有的良好的保水、保脂、防止肉汁分离的作用，与肌肉中的水分结合，形成胶体，在鱼肉表面形成一层薄膜，抑制了蛋白质氧化、脂肪氧化，细胞内冰晶形成缓慢，从而提高鱼肉质构特性，改善口感，并保持完整性较好的组织结构[21-24]，延长了鱼肉货架期。
本研究表明，对照组高白鲑在微冻贮藏条件下其新鲜度可保持大约35 d，而SPI、GP和WP 3种非肌肉蛋白的添加较好地延缓了高白鲑微冻贮藏期间品质的劣变速率，并延长了其货架期，使其贮藏49 d后新鲜度仍在可食范围内。SPI、GP和WP显著抑制了高白鲑微冻贮藏期间电导率的上升以及持水性、硬度、弹性、内聚性、咀嚼性和回复性的降低，且GP抑制效果更显著。此外，3种非肌肉蛋白添加物处理组肌肉结构破坏程度也相对较小，孔隙变化小，且GP添加组肌肉结构完整程度较好。
-
![]()
图 1 Elovl4-like cDNA序列及推测的氨基酸序列
黑色方框表示起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)；阴影部分表示共有保守区域；加黑字体表示组氨酸簇 (HXXHH)；下划线表示预测的7个跨膜区；波浪下划线表示内质网滞留信号
Figure 1. Full cDNA and deduced amino acid sequence of Elovl4-like
The initiation code (ATG) and the termination code (TAA) are boxed; the putative trans-membrane regions are in gray; the putative histidine-rich domain (HXXHH) is bold; the predicted seven (I–VII) putative membrane-spanning domains are underlined; the ER retrieval signal is wavy underlined.
![]()
图 2 卵形鲳鲹Elovl4-like与其他物种的氨基酸序列比对
Figure 2. Multiple alignment of deduced amino acid sequence of Elovl4-like from T. ovatus and other species
![]()
图 3 卵形鲳鲹与其他物种Elovl4的最大似然法系统进化树
Figure 3. ML phylogenrtic tree based on amino acids of Elovl4 of T. ovatus and other species
![]()
图 4 卵形鲳鲹Elovl4-like mRNA在不同组织中的表达分布
IN. 肠；LI. 肝；WM. 白肌；BR. 脑；SP. 脾；FI. 鳍；GI. 鳃；KI. 肾脏；ST. 胃；BL. 血；MG. 雄性性腺；FG. 雌性性腺；不同小写字母表示不同组织间差异显著 (P<0.05)
Figure 4. Expression level of T. ovatus Elovl4-like gene in different tissues
IN. intestine; LI. liver; WM. white muscle; BR. brain; SP. spleen; FI. fin; GI. gill; KI. kidney; ST. stomach; BL. blood; MG. male gonad; FG. female gonad; Different letters indicate significant difference at 0.05 level among different tissues.
![]()
图 5 Elovl4-like基因的功能鉴定
培养基添加的底物为18:2n-6 (A/B)、20:5n-3 (C/D)；A/C为含空载体pYES2质粒的酿酒酵母的脂肪酸组成；B/D为含PYElovl4-like质粒的酿酒酵母的脂肪酸组成；1~4分别表示酿酒酵母内源脂肪酸16:0、16:1n-7、18:0、18:1n-9; 延伸产物用三角符号标记；纵轴和横轴分别代表FID反应和保留时间；E、F分别是产物 20:2n-6和22:5n-3的质谱图
Figure 5. Functional identification of Elovl4-like gene
The substrate added to the medium was 18:2n-6 (A/B), 20:5n-3 (C/D); A/C is the fatty acid composition of S. cerevisiae containing the empty vector pYES2 plasmid; B/D is the fatty acid composition of S. cerevisiae containing PYElovl4-like plasmid; 1−4. endogenous fatty acids 16:0, 16:1n-7, 18:0 and 18:1n-9 of S. cerevisiae, respectively; the extension product is marked with a triangle symbol; the vertical and horizontal axis represent the FID response and retention time, respectively; E and F are mass spectra of products 20:2n-6 and 22:5n-3.
表 1 Elovl4-like ORF扩增、组织表达和功能验证所需引物
Table 1 Sequences of primers used for Elovl4-like cDNA cloning, functional characterization and real-time quantitative PCR
引物名称
primer name引物序列 (5'−3')
primer sequence用途
applicationElovl4-like F1 ATGGCTTCTGCATGG ORF扩增 Elovl4-like R2 TTATTTCTGCTTCTTC Elovl4-like F2 CGGGGTACCATGGCTTCTGCATGGCAAAGT Elovl4-like R2 CCGCTCGAGTTTCTGCTTCTTCTTGCTGA Elovl4-like qF GTCAGCCTGTCAACTACT qRT-PCR Elovl4-like qR CCACCAGAGGATGAACAT EF-1αF CCCCTTGGTCGTTTTGCC 内参 EF-1αR GCCTTGGTTGTCTTTCCGCT 
下载: 导出CSV
表 2 用于序列比对和构建系统进化树所用物种的基因及序列登录号
Table 2 Genes and sequence accession numbers used for alignment and construction of phylogenetic tree
物种
species基因
gene登录号
accession No.原鸡 Gallus gallus Elovl4 ENSGALG00000015876 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4a ENSTRUG00000004612 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4b ENSTRUG00000014717 红鳍东方鲀 Takifugu rubripes Elovl4-like XP_003974148.1 人 Homo sapiens Elovl4 ENSG00000118402 斑马鱼 Danio rerio Elovl4a ENSDARG00000006773 斑马鱼 Danio rerio Elovl4-like1 ENSDARG00000068551 斑马鱼 Danio rerio Elovl4-like2 ENSDARG00000057365 大西洋鳕 Gadus morhua Elovl4a ENSGMOT00000002680.1 大西洋鳕 Gadus morhua Elovl4-like ENSGMOT00000020430.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4a ENSGACT00000008132.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4b ENSGACT00000017607.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like1 ENSGACT00000016161.1 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like2 ENSGACG00000012189 三刺鱼 Gasterosteus aculeatus Elovl4-like3 ENSGACG00000012118 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4a ENSTNIG00000002416 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4b ENSTNIG00000010936 河鲀 Tetraodon nigroviridis Elovl4-like ENSTNIG00000010693 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4a MG674424 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4b MG674425 卵形鲳鲹 Trachinotus ovatus Elovl4-like MK215859 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4a ENSXMAP00000006115.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4b ENSXMAP00000007217.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4-like1 ENSXMAP00000011156.1 斑剑尾鱼 Xiphophorus maculatus Elovl4-like2 ENSXMAP00000013098.1 眼斑雀鳝 Lepisosteus oculatus Elovl4-like ENSLOCP00000021081.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4a ENSAMXP00000017270.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4b ENSAMXP00000006663.1 墨西哥脂鲤 Astyanax mexicanus Elovl4-like ENSAMXP00000005396.1 秀美花鳉 Poecilia formosa Elovl4a ENSPFOP00000018605.2 青鳉 Oryzias latipes Elovl4b ENSORLG00000017019 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4a ENSONIP00000009094.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4b ENSONIP00000000842.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4-like1 ENSONIP00000011380.1 尼罗罗非鱼 Oreochromis niloticus Elovl4-like2 ENSONIP00000002524.1
下载: 导出CSV
表 3 卵形鲳鲹Elovl4-like基因在酿酒酵母中的功能鉴定
Table 3 Functional characterization of Elovl4-like gene in T. ovatus
底物脂肪酸
FA substrate产物
product转化率/%
conversion活性
activity亚油酸 18:2n-6 20:2n-6 0.83 C18 → C20 γ-亚麻酸 18:3n-6 20:3n-6 0 C18 → C20 二十碳五烯酸 20:5n-3 22:5n-3 0.82 C20 → C22 α-亚麻酸 18:3n-3 20:3n-3 0 C18 → C20 十八碳四烯酸 18:4n-3 20:4n-3 0 C18 → C20 花生四烯酸 20:4n-6 22:4n-6 0 C20 → C22 二十二碳四烯酸 22:4n-6 24:4n-6 0 C22 → C24 二十二碳五烯酸 22:5n-3 24:5n-3 0 C22 → C24 二十二碳六烯酸 22:6n-3 24:6n-3 0 C22 → C24
下载: 导出CSV
-
[1] KABEYA N, YAMAMOTO Y, CUMMINS S F, et al. Polyunsaturated fatty acid metabolism in a marine teleost, Nibe croaker Nibea mitsukurii: functional characterization of Fads2 desaturase and Elovl5 and Elovl4 elongases[J]. Comp Biochem Physiol B, 2015, 188: 37-45. doi: 10.1016/j.cbpb.2015.06.005
[2] 谢帝芝, 王树启, 游翠红, 等. 鱼类高度不饱和脂肪酸合成的影响因素及其机理[J]. 中国水产科学, 2013, 20(2): 456-466. [3] MONROIG Ó, WEBB K, IBARRA C L, et al. Biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids in marine fish: characterization of an Elovl4-like elongase from cobia Rachycentron canadum and activation of the pathway during early life stages[J]. Aquaculture, 2011, 312(1/2/3/4): 145-153.
[4] KUAH M K, JAYA-RAM A, SHU-CHIEN A C. The capacity for long-chain polyunsaturated fatty acid synthesis in a carnivorous vertebrate: functional characterisation and nutritional regulation of a Fads2 fatty acyl desaturase with Delta 4 activity and an Elovl5 elongase in striped snakehead (Channa striata)[J]. Biochim Biophys Acta, 2015, 1851(3): 248-260. doi: 10.1016/j.bbalip.2014.12.012
[5] YOU C H, MIAO S S, LIN S Y, et al. Expression of long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) biosynthesis genes and utilization of fatty acids during early development in rabbitfish Siganus canaliculatus[J]. Aquaculture, 2017, 479: 774-779. doi: 10.1016/j.aquaculture.2017.07.028
[6] CASTRO L, TOCHER D R, MONROIG O. Long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis in chordates: insights into the evolution of Fads and Elovl gene repertoire[J]. Prog Lipid Res, 2016, 62(6): 25-40.
[7] YAN J, LIANG X, CUI Y, et al. Elovl4 can effectively elongate C18 polyunsaturated fatty acids in loach Misgurnus anguillicaudatus[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 495(4): 2637-2642. doi: 10.1016/j.bbrc.2017.12.123
[8] MONROIG O, ROTLLANT J, CERDA-REVERTER J M, et al. Expression and role of Elovl4 elongases in biosynthesis of very long-chain fatty acids during zebrafish Danio rerio early embryonic development[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1801(10): 1145-1154. doi: 10.1016/j.bbalip.2010.06.005
[9] CARMONA-ANTONANZAS G, MONROIG O, DICK J R, et al. Biosynthesis of very long-chain fatty acids (C>24) in Atlantic salmon: cloning, functional characterisation, and tissue distribution of an Elovl4 elongase[J]. Comp Biochem Physiol B, 2011, 159(2): 122-129. doi: 10.1016/j.cbpb.2011.02.007
[10] JIN M, MONROIG O, NAVARRO J C, et al. Molecular and functional characterisation of two elovl4 elongases involved in the biosynthesis of very long-chain (>C24) polyunsaturated fatty acids in black seabream Acanthopagrus schlegelii[J]. Comp Biochem Physiol B, 2017, 212: 41-50. doi: 10.1016/j.cbpb.2017.06.008
[11] XIE D Z, CHEN F, LIN S Y, et al. Long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis in the euryhaline herbivorous teleost Scatophagus argus: functional characterization, tissue expression and nutritional regulation of two fatty acyl elongases[J]. Comp Biochem Physiol B, 2016, 198: 37-45. doi: 10.1016/j.cbpb.2016.03.009
[12] SUN X X, GUO H Y, ZHU K C, et al. Feed type regulates the fatty acid profiles of golden pompano Trachinotus ovatus (Linnaeus 1758)[J]. J Appl Anim Res, 2016, 46(1): 60-63.
[13] 郑攀龙, 马振华, 郭华阳, 等. 卵形鲳鲹尾部骨骼胚后发育研究[J]. 南方水产科学, 2014, 10(5): 45-50. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.05.007 [14] 赵超平, 郭华阳, 张健, 等. 卵形鲳鲹AQP1a分子特征及其对急性盐度胁迫的表达响应[J]. 南方水产科学, 2018, 14(4): 56-65. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.04.007 [15] 于文博, 朱克诚, 郭华阳, 等. 卵形鲳鲹MHCⅡβ基因的克隆与表达分析[J]. 南方水产科学, 2017, 13(4): 69-79. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.04.009 [16] 孙潇潇. 卵形鲳鲹Fads2去饱和酶与Elovl5延长酶基因特征与功能研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2017: 48-58. [17] MONROIG Ó, WANG S, ZHANG L, et al. Elongation of long-chain fatty acids in rabbitfish Siganus canaliculatus: cloning, functional characterisation and tissue distribution of Elovl5- and Elovl4-like elongases[J]. Aquaculture, 2012, 350-353: 63-70. doi: 10.1016/j.aquaculture.2012.04.017
[18] OBOH A, BETANCOR M B, TOCHER D R, et al. Biosynthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids in the African catfish Clarias gariepinus: molecular cloning and functional characterisation of fatty acyl desaturase (fads2) and elongase (elovl2) cDNAs7[J]. Aquaculture, 2016, 462: 70-79. doi: 10.1016/j.aquaculture.2016.05.018
[19] LI W X, FENG Z F, SONG X J, et al. Cloning, expression and functional characterization of the polyunsaturated fatty acid elongase (2) gene from sea cucumber (Apostichopus japonicus)[J]. Gene, 2016, 593(1): 217-224. doi: 10.1016/j.gene.2016.08.023
[20] WANG S Q, MONROIG Ó, TANG G X, et al. Investigating long-chain polyunsaturated fatty acid biosynthesis in teleost fish: functional characterization of fatty acyl desaturase (Fads2) and Elovl5 elongase in the catadromous species, Japanese eel Anguilla japonica[J]. Aquaculture, 2014, 434: 57-65. doi: 10.1016/j.aquaculture.2014.07.016
[21] COOK H W, MCMASTER C R. Chapter 7 Fatty acid desaturation and chain elongation in eukaryotes[J]. New Compr Biochem, 2002, 36(2): 181-204.
[22] LI S L, MONROIG Ó, CARLOS NAVARRO J, et al. Molecular cloning and functional characterization of a putative Elovl4 gene and its expression in response to dietary fatty acid profiles in orange-spotted grouper Epinephelus coioides[J]. Aquacult Res, 2017, 48(2): 537-552. doi: 10.1111/are.12902
[23] JAKOBSSON A, WESTERBERG R, JACOBSSON A. Fatty acid elongases in mammals: their regulation and roles in metabolism[J]. Prog Lipid Res, 2006, 45(3): 237-249. doi: 10.1016/j.plipres.2006.01.004
[24] MORAIS S, MONROIG O, ZHENG X, et al. Highly unsaturated fatty acid synthesis in Atlantic salmon: characterization of ELOVL5- and ELOVL2-like elongases[J]. Mar Biotechnol, 2009, 11(5): 627-639. doi: 10.1007/s10126-009-9179-0
[25] KITAZAWA H, MIYAMOTO Y, SHIMAMURA K, et al. Development of a high-density assay for long-chain fatty acyl-CoA elongases[J]. Lipids, 2009, 44(8): 765-773. doi: 10.1007/s11745-009-3320-8
[26] TOCHER D R. Fatty acid requirements in ontogeny of marine and freshwater fish[J]. Aquacult Res, 2010, 41(5): 717-732. doi: 10.1111/are.2010.41.issue-5
[27] 魏帮鸿, 杨志刚, 施秋燕, 等. 水生动物脂肪酸延长酶基因研究进展[J]. 基因组学与应用生物学, 2017, 36(10): 4159-4165. [28] MARTIN P A, BRUSH R S, MANDAL M A, et al. Role of Stargardt-3 macular dystrophy protein (ELOVL4) in the biosynthesis of very long chain fatty acids[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2008, 105(35): 12843-12848. doi: 10.1073/pnas.0802607105
[29] INAGAKI K, AKI T, FUKUDA Y, et al. Identification and expression of a rat fatty acid elongase involved in the biosynthesis of C18 fatty acids[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2002, 66(3): 613-621. doi: 10.1271/bbb.66.613
-
期刊类型引用(15)
1. 张华锋，罗纲，张瑞芳，侯学龙，翟婷婷，琚鸿睿. 液质联用法同时测定猪肉中磺胺类和喹酮类药物残留. 食品安全导刊. 2024(17): 79-83 . 
百度学术
2. 张丹鹤，周莹莹，刘定舟，朱欣欣，崔倩倩，贾松涛，赵林萍. 鸡肉中三种喹诺酮药物残留检测的不确定度评定. 现代食品. 2022(14): 214-218 . 百度学术
3. 梁大伟，王悦秋，谭琳. 恩诺沙星-d_5的合成. 化学试剂. 2019(02): 190-193 . 百度学术
4. 李卿沛，王吉河，张妍，代春梅. 高效液相色谱串联质谱法测定猪肉中磺胺甲恶唑不确定度的评定. 农业科技与信息. 2019(11): 54-56+61 . 百度学术
5. 张昊，冯家力，陈东洋，袁春晖，曾栋，刘先军，李帮锐. 凝胶渗透色谱-液相色谱法测定沉积物中多环芳烃的不确定度评定. 实用预防医学. 2019(10): 1201-1205 . 百度学术
6. 蓝草，邹游，欧阳少伦，吴映璇，邵琳智. 液相色谱-串联质谱法测定动物源性食品中硝基咪唑类药物残留量的不确定度评估. 农产品加工. 2017(04): 35-40+44 . 百度学术
7. 李华，杨娟，陈黎. 超高液相色谱-串联质谱法测定猪肉中8种喹诺酮类兽药残留的不确定度评定. 食品安全质量检测学报. 2017(08): 3237-3243 . 百度学术
8. 蒋翠红. HPLC法和HPLC-MS/MS法检测水产品中喹诺酮类药物的方法比较. 农技服务. 2016(01): 102 . 百度学术
9. 张燕，徐幸，郭启新，舒平，赵用，杨朝义，赵燕娜. 高效液相色谱-串联质谱法测定牛奶中3种磺胺类药物残留不确定度的评定. 食品安全质量检测学报. 2015(01): 303-309 . 百度学术
10. 张信仁，唐庆强，张云. 液相色谱-串联质谱法测定鳗鱼中甲苯咪唑含量的不确定度评定. 食品安全质量检测学报. 2015(05): 1713-1718 . 百度学术
11. 吴健，朱峰，吉文亮，李放，阮丽萍，刘华良. 高效液相色谱-质谱联用法同时检测水体中14种喹诺酮类药物残留. 食品安全质量检测学报. 2015(12): 4966-4974 . 百度学术
12. 张惠峰，綦天华. 高效液相色谱法测定水产品中甲基睾酮残留量的不确定度评定. 食品科学. 2015(18): 199-203 . 百度学术
13. 彭家杰，李绪鹏，莫炯怀，邹潍力，卢伟华. HPLC法水产品中诺氟沙星盐酸环丙沙星恩诺沙星残留量的不确定度评定. 农业与技术. 2014(06): 23-25 . 百度学术
14. 杨金兰，李刘冬，陈培基，黎智广，黄珂，王强，杨宏亮. 高效液相色谱法测定罗非鱼中孔雀石绿残留量的不确定度. 广东海洋大学学报. 2013(06): 62-66 . 百度学术
15. 曹爱英，张园，赵春晖，王秀林，潘勇，李英，宗超，曹洁. 液质联用法测定水产品中泰乐霉素含量不确定度评价. 中国渔业质量与标准. 2013(04): 21-24 . 百度学术
其他类型引用(0)
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
- 被引次数: 15
粤公网安备 44010502001741号
