凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)是中国重要的经济养殖品种，2014年养殖产量达到157.69×10⁴ t^[1]。近年来对虾肝胰腺坏死综合征等病害持续发生，严重影响对虾养殖产业健康发展^[2]，有学者认为蓝藻等产毒藻类可能是引起对虾肝胰腺坏死的重要因子之一^[3]。蓝藻是水体常见的有害藻类，在养殖过程中，大量的残饵和粪便造成养殖水体富营养化水平不断升高^[4]，蓝藻水华在养殖池塘水体中频频发生^[5]。颤藻(Oscillatoria sp.)是蓝藻水华的主要微藻种类之一，已报道的颤藻种类有280多种^[6]，其中绿色颤藻(Oscillatoria chlorina)分布水域广泛，在淡水及海水养殖池塘均有发现，且常为池塘的优势藻种^[7-8]。LEHMAN等^[9]发现颤藻可伤害对虾的肝胰脏等，使对虾出现停食、空胃、肝胰脏糜烂等不良症状；曹平等^[10]报道质量浓度高于22.5 mg · L^-1的颤藻显著降低凡纳滨对虾成活率。目前对绿色颤藻的相关研究主要集中在颤藻治理及防控等方面^[11-12]，而关于绿色颤藻对凡纳滨对虾危害的机制尚不清楚，该文章研究了绿色颤藻细胞、颤藻粗提液以及颤藻细胞分泌物对凡纳滨对虾的毒性，探索了不同颤藻浓度和不同水温下对虾对颤藻毒素的响应，并对颤藻粗提液的毒性物质做了初步分析，明确了对对虾产生危害的颤藻细胞成分以及颤藻浓度与水温对颤藻毒性的影响，为对虾健康养殖和颤藻防控提供依据。

1.   材料与方法

1.1   养殖系统

养殖实验系统由18个直径为60 cm，高为120 cm的塑钢养殖桶组成。水体盐度36，pH 7.6~7.8。养殖用水经多级沙滤和含氯消毒剂进行处理，曝气24 h，显微镜检测确保水体中无微藻。实验对虾取自深圳市高位池养殖的健康凡纳滨对虾，实验前对虾暂养7 d，每天投喂3次全人工配合饲料，每天换30%水量，以充气方式将溶解氧控制在6.8~7.2 mg · L^-1。实验对虾体长(7.1±1.0)cm，体质量(3.6±0.5)g。

1.2   微藻培养与粗提取液制备

绿色颤藻由中国水产科学研究院南海水产研究所提供，以BG11培养基在25 ℃和1 500 lx条件下进行扩大培养。

收集处于对数生长期的颤藻细胞，4 000 r ·min^-1离心10 min，以无菌磷酸缓冲液(phosphate buffer saline，PBS)重复洗涤3次。以PBS作溶剂分别配制湿藻质量浓度为25.2 mg · mL^-1(C1)、5.04 mg · mL^-1(C2)、2.52 mg · mL^-1(C3)、0.504 mg · mL^-1(C4)、0.252 mg · mL^-1(C5)的藻液。将不同浓度的藻液置于冰上，在功率100 W下超声破碎20 min(新芝JY92-ⅡDN)，然后在4 ℃、6 000 r · min^-1的条件下离心10 min，收集上清液获得不同浓度的颤藻粗提液(参照GB/T 57050.8—2006改进)。

1.3   实验设计

1.3.1   不同颤藻细胞组分对对虾的致死效应

对虾随机分为实验组与对照组，每组设3平行，每平行各30尾对虾。实验组分别注射湿藻质量浓度约为5.04 mg · mL^-1的颤藻细胞、颤藻粗提液和藻细胞培养液，每尾注射50 μL，对照组注射等体积的无菌PBS。注射后，对虾放养在体积150 L、水温28 ℃水体中，每隔0.5 h观察对虾成活情况，并记录对虾死亡数量及死亡时间。

1.3.2   不同浓度颤藻粗提液对对虾的致死效应

对虾随机分为实验组与对照组，每组设3平行，每平行各30尾对虾。取浓度分别为C1、C2、C3、C4和C5的颤藻粗提液对实验组对虾进行攻毒，每尾注射50 μL，对照组注射等体积的无菌PBS。注射后，对虾放养在体积150 L、水温28 ℃水体中，每隔0.5 h观察对虾存活情况，并记录对虾死亡数量及死亡时间。

1.3.3   不同温度下对虾对颤藻毒素的响应

参考对虾养殖生产季节的水温变化范围^[13]，以恒定控温棒先将实验水体的水温稳定控制在22 ℃、28 ℃、34 ℃ 3个梯度。再根据1.3.2的结果，选取湿藻质量浓度为2.52 mg · mL^-1的颤藻粗提液注射对虾，对照组注射等体积的无菌PBS。注射后，对虾放养在体积150 L水体中，每隔0.5 h观察对虾存活情况，并记录对虾死亡数量及死亡时间。

1.4   颤藻毒素的提取与检测

1.4.1   颤藻毒素提取

参照生活饮用水标准检验方法(GB/T 57050.8—2006)，称取湿藻质量0.540 g颤藻细胞，加入10 mL 70%甲醇，超声破碎20 min(功率100 W)，6 000 r · min^-1离心10 min，收集上清液，沉淀再加入10 mL 70%甲醇超声提取1次，合并2次提取上清液，于50 ℃水浴中氮吹除去甲醇。管中剩余液体过C₁₈小柱(预先用5 mL甲醇、5 mL水活化)，用3 mL 20%甲醇润洗离心管，洗液一并过小柱，然后再加3 mL 20%甲醇淋洗小柱，用3 mL甲醇洗脱小柱，收集洗脱液，用去离子水定容至5 mL，-20 ℃保存待测。样品制备重复3次，每次均设3个平行。

1.4.2   颤藻毒素检测

参照GB/T 57050.8—2006微囊藻检测方法，选用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)检测颤藻毒素。微囊藻毒素混合标准品(MC-RR/YR/LR)加入1 mL甲醇溶解，配制成250 μg · mL^-1母液。取一定量母液用50%甲醇梯度稀释，分别配制质量浓度为5 μg · mL^-1、2.5 μg · mL^-1、0.5 μg · mL^-1、0.25 μg · mL^-1、0.1 μg · mL^-1的标准液。使用液相色谱仪(岛津SHIMADZU LC-20A)对标准液和颤藻粗提液预处理样品进行检测。

1.5   数据分析

死亡率(%)=(死亡数量/实验初总数量)×100

死亡速率=死亡数量/时间

所得实验数据均以平均值±标准差(X±SD)表示，用SPSS 11.0进行方差分析(ANOVA)和Duncan多重比较，P < 0.05表示差异显著，以Pearson进行指标的相关性分析。

2.   结果与分析

2.1   颤藻细胞、颤藻粗提液及藻细胞培养液对对虾的毒性效应

注射PBS及藻细胞培养液组对虾未出现死亡，注射颤藻细胞后12 h内对虾受影响较小，死亡率仅为2.22%，12 h后对虾死亡率开始大幅度上升，72 h后对虾全部死亡(图 1)。对虾在注射颤藻粗提液后立即出现死亡，12 h后死亡率达到22.09%，72 h后死亡率为91.04%，实验结束时(第168小时)，对虾死亡率为93.72%。可见藻细胞培养液对凡纳滨对虾的成活率没有影响，颤藻细胞及颤藻粗提液能够显著降低对虾的成活率(P < 0.05)，且颤藻粗提液发挥毒性效应比颤藻细胞更迅速。实验结束时颤藻细胞注射组和颤藻粗提液注射组对虾累计死亡率之间没有明显差异(P>0.05)，综上分析，颤藻对对虾的危害成分主要是颤藻粗提物所含的有毒物质。

图  1  颤藻细胞、颤藻粗提液及藻细胞培养液注射组对虾的死亡率

不同字母表示差异显著(P＜0.05)，后图同此。

Figure  1.  Mortality of shrimp caused by Oscillatoria cell, Oscillatoria crude extract and cell cultured medium

Different letters represent significant difference (P < 0.05). The same case in the following figures.

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2.2   颤藻粗提液对对虾的毒性效应

PBS注射组对虾未出现死亡，实验组对虾注射颤藻粗提液后，除C5组之外，其余各组对虾均出现不同程度的死亡(图 2)。C1和C2组对虾死亡率在第12小时高达100%和97.78%，第168小时C2组也达到100%；C3组的对虾死亡率略低于C1、C2组，第12小时为62.22%，第168小时达到86.67%；C4组对虾死亡率大幅降低，第12小时为1.11%，第168小时也仅为2.22%，与C1、C2和C3组对虾累计死亡率差异极其显著(P < 0.01)。由此可见，颤藻粗提液的毒性具有显著的浓度效应，随着颤藻粗提液浓度升高，对虾的死亡率和死亡速率都明显上升，且颤藻粗提液致对虾死亡必须高于一定范围的浓度，致死质量浓度应该在0.504~2.52 mg · mL^-1范围内。

图  2  不同浓度颤藻粗提液注射组对虾的死亡率

Figure  2.  Mortality of shrimp caused by different concentrations of crude extract

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2.3   温度对对虾响应颤藻粗提液毒性的影响

22 ℃、28 ℃和34 ℃条件下对虾注射PBS后均未出现死亡，注射2.52 mg · mL^-1的颤藻粗提液后对虾出现不同程度的死亡(图 3)。22 ℃组对虾在注射后0~6 h期间未出现死亡，24 h死亡率为10.0%，168 h达到20.0%；28 ℃组对虾在注射后0~6 h期间同样未出现死亡，24 h死亡率为60.0%，168 h达到82.2%；34 ℃组对虾在注射后立即死亡，6 h死亡率为43.47%，24 h死亡率为93.47.3%，168 h达到97.8%。可见，在温度较低时，粗提液对对虾致死效应相对微弱，随着水温上升，对虾注射粗提液后死亡率显著提高(P < 0.05)。所以水温的升高可以显著增强颤藻粗提液对凡纳滨对虾的毒性，表明当养殖对虾受到颤藻毒性胁迫时，温度越高，对虾的死亡率越高。所以在高温季节养殖对虾应该把蓝藻作为水体环境的重要监测指标加以严格控制。

图  3  不同温度组注射粗提液后对虾的死亡率

Figure  3.  Mortality of shrimp caused by crude extract at different water temperatures

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2.4   颤藻粗提液有毒物质的检测

微囊藻毒素是蓝藻细胞产生的最常见的毒性物质之一，HPLC是检测微囊藻毒素最常用的方法，其最低检测质量浓度为0.06 μg · L^-1。混合标准品MC-RR/YR/LR检测标准曲线如图 4所示，y=18 705x(MC-RR)-355.55，y=16 326x(MC-YR)-306.46，y=19 163x(MC-LR)+281.29，x为标准品的浓度，y为峰面积，曲线的拟合度系数(R2)分别为0.999 5、0.999 7、1.000 0，标准曲线线性关系良好。如图 5所示，MC-RR、MC-YR和MC-LR标准品的保留时间分别为8.5~9.2 min，9.2~9.8 min和10.6~11.6 min。而湿藻质量浓度为108.0 mg · mL^-1颤藻粗提取液HPLC检测结果显示，样品在8.5~11.6 min内均没有出现特异的吸收峰，峰面积接近于零，说明样品中未检测到MC-RR/YR/LR(图 6)。所以颤藻粗提液致对虾死亡的毒性物质并非是MC-RR/YR/LR等常见的微囊藻毒素，其所含有的毒性物质具体为何种藻毒素有待进一步研究。

图  4  HPLC检测MC-RR/YR/LR标准曲线

Figure  4.  Standard curve of MC-RR/YR/LR HPLC detection results

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图  5  MC-RR/YR/LR标准品色谱检测结果

Figure  5.  Results of MC-RR/YR/LR standard samples detected by HPLC

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图  6  颤藻粗提液样品的色谱检测结果

Figure  6.  Results of crude extract of O.chlorina detected by HPLC

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3.   讨论

颤藻隶属于蓝藻门，蓝藻纲，颤藻目，颤藻科，多生活在含氮量高、有机质丰富的高温水体中，是池塘常见的有害微藻之一^{[6, 14]}。彭聪聪等^[8]调查发现对虾养殖池塘后期颤藻密度能够达到10⁸~10⁹个· L^-1，颤藻数量、生物量超过浮游微藻总量的50%以上，微藻多样性指数低的池塘对虾容易发病。颤藻水华极易引发“倒藻”，可导致大量羟胺、硫化物等有毒物质释放，会造成对虾因应激致病而死亡^[15]，曹平等^[10]发现颤藻能够抑制对虾生长，降低对虾成活率。该研究同样发现颤藻细胞及其粗提液对凡纳滨对虾具有急性毒性，而颤藻细胞分泌物对对虾无致死效应，有学者曾报道颤藻粗提取物会导致小鼠生长缓慢，肝脏肿大^[16]。颤藻等蓝藻细胞最大的危害是能够产生微囊藻毒素等蓝藻毒素，而蓝藻毒素主要是细胞内毒素，当细胞破裂或藻类腐烂分解后，毒素才会被释放到水体中^[17]。该研究颤藻细胞注射组与粗提液注射组之间对虾死亡率无明显差异，推测致对虾死亡的毒性物质可能是微囊藻毒素。实验结果还显示粗提液致死效应随着颤藻细胞浓度增加而显著增强(P < 0.01)，说明毒素浓度随着藻细胞浓度上升而升高，穆丽娜等^[18]发现MC-LR浓度与蓝藻细胞数量密切相关。

水温是影响对虾对颤藻粗提液毒性的响应另一个重要因子，研究结果显示当水温从22 ℃上升至34 ℃，对虾注射颤藻粗提液后死亡率从20.00%急剧增加至97.78%，致死效应时间从6 h缩短至30 min，差异显著(P < 0.05)，推测可能是水温影响了对虾对有毒物质的吸收和运输。蔡诤等^[19]报道水温升高可以提升水产动物的吸收和代谢能力，从而增强和加速丁香酚对日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)的麻醉效果；梅景良等^[20]也提出水温能够通过影响牛蛙(Rana catesbiana)心脏活动、血液循环而抑制或增强药物的效应。温度还可以直接影响藻类毒性，VANDER和ELOFF^[21]研究发现，在一定温度范围内，温度升高显著增强铜绿微囊藻毒性，但有关温度与藻类产毒关系的报道并不统一。LEE等^[22]发现温度和微囊藻毒素产量呈负相关；吴和岩等^[23]报道铜绿微囊藻细胞内产毒量在20 ℃最高；而吴溶等^[24]报道铜绿微囊藻的藻毒素最佳释放条件为28℃，推测这些差异可能由于藻种不是相同一株所导致。该研究使用的颤藻菌株产毒量与温度之间的关系尚待进一步的探究。

微囊藻毒素(Microcystin，MC)是最常见的蓝藻毒素之一，目前已报道的微囊藻毒素有70余种异构体，其中MC-RR、MC-YR和MC-LR最为常见，多由颤藻、微囊藻等蓝藻细胞产生^{[17, 25]}。该研究检测结果表明，实验使用的颤藻粗提液未含有MC-RR/YR/LR，推测实验颤藻株产生的毒素可能是其他亚型微囊藻毒素，或是其他类型毒素。HITZFELD等^[26]曾报道颤藻可以产生鱼腥藻毒素-a及其同系物等神经毒素。

近年来，对虾养殖发生了严重的病害，检测出多种病原^[27-28]，有学者提出这可能是由于养殖密度急剧增加，导致水体富营养化严重，蓝藻易形成优势种群，蓝藻水华暴发频繁，降低了对虾抗病能力，容易被病原侵染而发生病害^[29-31]。该研究结果表明，高浓度的颤藻粗提液(≥2.52 mg · mL^-1)可以造成对虾大量死亡，且随着藻细胞浓度和水温升高，致死效应显著增强。在养殖生产过程中，随着养殖持续，池塘水体积累大量的残饵、代谢产物等有机物，水温也逐渐上升，在养殖中后期颤藻细胞具有较高的生态竞争能力，大量繁殖形成水华^{[7-8, 13]}，危害对虾健康生长。因此，对虾养殖过程中必须防控颤藻等有害微藻的大量繁殖，尤其在高温季节需要采用正确有效的养殖管理措施。有研究报道，可以通过定向培养有益微藻种群或者添加芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)^[32]，竞争营养物质，抑制颤藻等有害微藻的生长，或是添加蓝藻溶藻细菌，特异性杀灭有害蓝藻^[33-34]，这是对虾健康养殖的重要措施之一。