Development and evaluation of di-/tri-nucleotide-repeated microsatellites by RAD-seq in Decapterus macrosoma
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摘要:
通过对长体圆鲹(Decapterus macrosoma)基因组进行RAD-Seq高通量测序，共获得58 180条微卫星序列，选取112条二、三核苷酸重复的微卫星序列设计引物，经筛选后，共获得27个具有多态性的微卫星标记。利用一个长体圆鲹群体对通过筛选的微卫星标记的种群遗传学特征进行评价。结果显示，27对引物扩增的序列中18个位点为二核苷酸重复，重复次数为9~14次，9个位点为三核苷酸重复，重复次数为6~10次，等位基因数(Na)为5~17 (平均10.6)，表观杂合度(Ho)为0.342 9~0.857 1 (平均0.631 7)，期望杂合度(He)为0.538 3~0.911 8 (平均0.796 8)，多肽信息含量(PIC)为0.497~0.886 (平均0.780 9)，除1个位点外，其他位点PIC值均大于0.500，表明开发的微卫星位点具有较高的多态性。“哈迪-温伯格”平衡(HWE)检测结果显示，19个标记等位基因频率符合HWE。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。该研究开发的27个微卫星标记可为长体圆鲹种群遗传学研究提供基础。
Abstract:A total of 58 180 microsatellites were developed by RAD-Seq high-throughput sequencing technology in Decapterus macrosoma. One hundred and twelve microsatellite loci were randomly selected from di-/tri-nucleotide repeat microsatellite loci. Finally, twenty-seven highly polymorphic markers were developed. The population genetic analysis finds 18 dinucleotide-repeated microsatellite loci (9−14 repeated) and 9 trinucleotide-repeated microsatellite loci (6−10 repeated). The number of alleles (Na) ranged from 5 to 17 (mean 10.6). The observed and expected heterozygosities ranged from 0.342 9 to 0.857 1 (mean 0.631 7) and 0.538 3 to 0.911 8 (mean 0.796 8), respectively. The polymorphism information content (PIC) ranged from 0.497 to 0.886 (mean 0.780 9), and the PIC at all loci except for one was geater than 0.500, indicating that the microsatellites were highly polymorphic. The Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) test shows that 19 microsatellite markers conformed to HWE. There is no linkage imbalance among the 27 loci. The 27 microsatellites developed by this study will be useful for further population genetic analysis.
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在细菌中，反式编码小RNAs (trans-encoded sRNAs，sRNAs，以下称为小RNA)来自2个编码基因的基因间区，通常是一类大小为50~500 nt的非编码RNA分子[1]。小RNA主要通过与其靶标mRNA不完全配对，影响mRNA的稳定性，从而激活或者抑制靶标mRNA的翻译，并且同一小RNA通常调控多个靶标基因，从而形成响应环境的调节活性网络[1]。小RNA还可通过模拟靶蛋白底物，修饰或抑制靶蛋白的生物学活性，例如RsmZ通过隔离的方式调节蛋白活性[2]。此外，也有少数小RNA与转录因子等蛋白相互作用，从而抑制相关蛋白活性[3]。研究发现小RNA对细菌的生长、繁殖具有重要的调节作用，它们可感应环境变化，调控细胞代谢途径、生长方式并使之与环境相适应。各种调控功能的小RNA在弧菌(Vibrio)中也有相应发现和研究，尤其是霍乱弧菌(V. cholerae)和哈维弧菌(V. harveyi)[4]，而溶藻弧菌(V. alginolyticus)中关于小RNA的研究仅Huang等[5]发现了3个与黏附、趋化及运动相关的小RNA，以及笔者前期发现的1个与代谢相关的小RNA srvg23535[6]，更多的从小RNA角度揭示溶藻弧菌环境适应及致病性等的研究尚未见报道。
溶藻弧菌广泛分布在河口与海洋，是一种常见的水产养殖病原菌，可感染包括南美白对虾(Penaeus vannamei)、点带石斑鱼(Epinephelus coioides)、文蛤(Meretrix meretrix)、花鲈(Lateolabrax japonicus)、黑鲷(Acanthopagrus schlegelii)、真鲷(Pagrosomus major)、牙鲆(Paralichthys olivaceus)、大菱鲆(Psetta maxima)等在内的多种水产动物，对中国南方水产养殖业造成极大威胁。此外，溶藻弧菌常常引起人体严重腹泻、发热及脱水，严重感染甚至可引发中耳炎和外耳炎等，是人类重要的致病菌[7-8]。细菌入侵宿主并在宿主中生存的过程中，为了适应快速变化的环境，进化出包括菌落相变、群感效应在内的多种机制[9-10]，而这些机制都处于严格精准的基因表达调控体系中。转录、转录后、翻译及翻译后等过程都可作为基因表达的调控节点[11-12]，绝大多数基因的表达都在其中一个或多个节点接收环境信号的控制，从而组成复杂的调控网络以应对不断变化的环境条件。因此，研究小RNA对溶藻弧菌环境适应及致病性等的功能调控，将有利于进一步揭示其对溶藻弧菌的基因调控机制。
笔者前期鉴定得到溶藻弧菌小RNA srvg17985，并发现其仅存在于弧菌中，且序列上相对保守。本研究利用同源重组技术构建srvg17985缺失突变株，并对突变株的生物学特性进行分析，为进一步鉴定srvg17985调控靶标基因，进而阐明其基因调控机制奠定了基础；研究成果将丰富溶藻弧菌小RNA的调控功能，初步揭示小RNA在溶藻弧菌乃至海洋病原弧菌环境适应中的作用。
1. 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株、质粒和引物
表 1 本研究所用菌株和质粒Table 1. Strains and plasmids used in this study菌株、质粒
strain, plasmid相关特征
relevant characteristics来源
source菌株 strains V. alginolyticus ZJ-T 氨苄青霉素抗性，野生菌株ZJ-51的半透明/平滑变体；
从中国南部沿海的患病石斑鱼中分离参考文献[13] ZJ-T-Δsrvg17985 氨苄青霉素抗性；ZJ-T中缺失srvg17985 本研究 Escherichia coli Π3813 laclQ，thi1，supE44，endA1，recA1，hsdR17，gyrA462，zei298::Tn10[Tc]，ΔthyA::erm-pir116； 自杀质粒pSW7848的中间宿主 参考文献[14] E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462，zei298::Tn10；接合作用供体菌 参考文献[15] 质粒 plasmids pSW7848 氯霉素抗性；自杀质粒，R6K起点，复制需要Pir蛋白，
具有ccdB毒性基因参考文献[16] pSW7848-Δsrvg17985 氯霉素抗性；pSW7848含有待缺失srvg17985的上下游同源臂 本研究 表 2 本研究所用引物Table 2. Primers used in this study引物
primer序列 (5'–3')
sequencepSW7848-F GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC pSW7848-R GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC srvg17985-UP-F aagcttgatatcgaattcCGCCAAACACGCCAAACA srvg17985-UP-R acctcgttATTTAAAGCATGGTTCATTTTTCTCAAAAAAC srvg17985-DOWN-F tgctttaaatAACGAGGTAGAGGCGCAC srvg17985-DOWN-R ttggtaacgaatcagacGCAAATCAAATTGCAATGCGC Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG Δsrvg17985-check-F CAATTCTCTCGCGTTTGGTC Δsrvg17985-check-R CATTGCTGACAACGTGTCTTG 1.1.2 主要试剂
高保真酶PrimeSTAR® Max DNA polymerase、限制性内切酶DpnI购自Takara公司，用于营养缺陷型大肠杆菌Π3813生长的2′-Deoxythymidine (Thy)以及用于限铁环境生长测试的2-2′-联吡啶(2,2′-Dipyridyl，DIP)购自生工生物工程(上海)股份有限公司，营养缺陷型大肠杆菌GEB883生长所需的2,6-Diaminopimelic acid(DAP)购自Sigma公司，等温组装的试剂盒ClonExpressMultiS One Step Cloning Kit购自Vazyme公司，抗生素纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司，PM (Phenotype MicroArray)板购自华粤行仪器有限公司。
1.1.3 主要培养基
LB (luria-bertani)培养基、TSB (tryptic soy broth)培养基购自BD公司。1 L LB含10 g胰蛋白胨，5 g酵母提取物，10 g 氯化钠(NaCl)。1 L TSB含17 g胰酪蛋白胨，3 g大豆蛋白胨，2.5 g D-葡萄糖，5.0 g NaCl，2.5 g 磷酸氢二钾(K2HPO4)。1 L固体培养基含琼脂15 g。在LB培养基基础上将NaCl质量浓度提高至30 g·L−1即配制得到LBS (luria-bertani-salt)培养基。
1.2 方法
1.2.1 srvg17985缺失株的构建
参考Deng等[17]的方法并进行一定修改，构建srvg17985缺失突变株，srvg17985的序列信息见图1，使用pSW7848-F/R引物对线性化扩增自杀质粒pSW7848，使用引物对srvg17985-UP-F/R和srvg17985-DOWN-F/R扩增上下游同源臂片段，并将线性化质粒片段与上下游同源臂片段进行等温组装，使用引物对Del-check-pSW7848-F/R对重组自杀质粒进行PCR及测序检测，鉴定正确的质粒大小约为5.5 kb，命名为pSW7848-Δsrvg17985。接着通过接合作用，将重组自杀质粒pSW7848-Δsrvg17985从供体菌大肠杆菌GEB883-pSW7848-Δsrvg17985送入到受体菌溶藻弧菌野生株ZJ-T。根据自杀质粒pSW7848不能在溶藻弧菌中复制，具有氯霉素抗性，并在受阿拉伯糖诱导后毒性基因ccdB表达的特点，利用氯霉素和阿拉伯糖进行先后两次筛选，重组自杀质粒上的srvg17985上下游同源臂片段与溶藻弧菌基因组的srvg17985上下游同源臂片段先后发生两次同源重组，从而获得溶藻弧菌srvg17985缺失株，命名为ZJ-T-Δsrvg17985。重组自杀质粒构建及同源重组筛选突变株流程见图2。
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图 1 srvg17985的序列信息下划线部分为srvg17985的序列，深灰色背景部分依次为上下游同源臂扩增的引物对Figure 1. Sequence information of srvg17985The underlined is the sequence of srvg17985 and the dark gray background indicates the primer pairs for the amplification of two flanking fragments.![]()
图 2 重组自杀质粒构建和突变株筛选A1. 上游；A2. 下游Figure 2. Construction of recombinant suicide vector and screening of mutant strainA1. up stream；A2. down stream1.2.2 菌株生长测试
将单个克隆的溶藻弧菌野生株ZJ-T及小RNA缺失突变株ZJ-T-Δsrvg17985分别接种至LBS液体培养基，于30 ℃、200 r·min–1振摇培养16 h过夜，过夜菌液用新鲜LBS培养基稀释1 000倍于灭菌锥形瓶中，30 ℃、200 r·min–1振摇培养，不同时间利用分光光度计(BIO-RAD Smart-SpecTM Plus)测定OD600，绘制生长曲线。重复实验3次，使用IBM SPSS Statistics 19软件进行单因素协方差分析(ANCOVA) (以野生株和突变株为固定因子，以时间为协变量，以OD600值为因变量)。
1.2.3 游动性和涌动性测试
同1.2.2过夜菌液，调整培养液浓度至相同吸光度(OD600=1.0)，取5 μL平行3次点样到0.3%琼脂半固体LBS平板上测试其游动性，同时取5 μL平行3次点样到1.5%琼脂固体LBS平板上测试其涌动性，分别于30 ℃静置培养16 h和24 h，测量菌斑直径。实验至少重复3次。使用IBM SPSS Statistics 19软件进行Student's t检验，P<0.05作为统计学显著性阈值。
1.2.4 胞外蛋白酶分泌测试
同1.2.2过夜菌液，调整培养液浓度至相同吸光度(OD600=5.0)，取5 μL平行3次点样到LBS添加1%脱脂奶粉平板上，30 ℃静置培养24 h，测量蛋白分解圈直径及克隆直径。实验至少重复3次。“蛋白分解圈直径/克隆直径”值表示蛋白酶分泌能力。使用IBM SPSS Statistics 19软件进行Student's t检验，P<0.05作为统计学显著性阈值。
1.2.5 限铁环境下的生长测试
同1.2.2过夜菌液，调整培养液浓度至相同吸光度(OD600=5.0)，同时10倍倍比稀释各菌株菌液至最高稀释倍数为106，然后将倍比稀释菌液依次取5 μL平行3次点样到LBS平板，以及LBS添加120 μmol·L–1 DIP的平板上，30 ℃静置培养24 h，观察细菌所能生长的最大稀释倍数。实验至少重复3次。
1.2.6 LBS平板上对不同抗生素的敏感性测试
同1.2.2过夜菌液，将200 μL过夜菌涂布到TSB平板(12 cm，正方形)后，将各抗生素纸片置于平板上，30 ℃静置培养24 h后观察并测量抑菌圈直径，取3个位置测定经过抗生素纸片中心的抑菌圈直径，重复测定3次，取平均值。重复实验3次，使用IBM SPSS Statistics 19软件进行Student's t检验，P<0.05作为统计学显著性阈值。
1.2.7 PM板测试细菌代谢
参考Bochner等[18]的方法，利用PM02和PM08板分别测试细菌对95种碳源以及95种多肽氮源(表3、表4)的利用。在LBS固体平板上划线复活细菌，30 ℃静置培养过夜。1) 510 μL的染料A (100×)与7 990 μL含14% NaCl的水溶液一起加入到42.5 mL接种液(inoculating fluid，IF)1.2×IF-0中，得到51 mL的1.0×IF-0；2)对于每个菌株，用灭菌棉签刮取固体平板上的克隆，重悬在25 mL的1.0×IF-0中，利用浊度仪测定浊度，得到浊度为85%的孵育液；3)对于PM02板，每孔吸取浊度为85%的孵育液100 μL；对于PM08板，向浊度为85%的孵育液中加入适当体积的2 mol·L–1的琥珀酸钠，使得最终浓度为20 mmol·L–1，并每孔吸取100 μL孵育液；4)将准备好的孵育板于30 ℃静置培养5 d，并在不同的时间点利用MultiDisk Ascent读板仪(Thermo Fisher Scientific)测定OD590，并将各孔OD590减去空白孔OD590，指示细菌的代谢活性。重复实验3次，使用IBM SPSS Statistics 19软件进行单因素协方差分析(ANCOVA) (以野生株和突变株为固定因子，以时间为协变量，以OD590值为因变量)，并对有显著性差异的因子各时间点进行Student's t检验，P<0.05作为统计学显著性阈值。
表 3 PM02板测试组分Table 3. Test components of PM02 plate孔
well (PM02)A B C D E F G H 1 空白 N-乙酰基-D-半乳糖胺 龙胆 D-棉子糖 癸酸 D-乳酸甲酯 乙酰胺 L-鸟氨酸 2 硫酸软骨素C N-乙酰-神经氨酸 L-葡萄糖 水杨甙 己酸 丙二酸 L-丙氨酰胺 L-苯丙氨酸 3 α-环糊精 β-D-阿洛糖 D-乳糖醇 景天庚酮糖酐 柠康酸 6-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-
D-葡糖-己酸N-乙酰-L-谷氨酸 L-焦谷氨酸 4 β-环糊精 苦杏仁甙 D-松三糖 L-山梨糖 D, L-柠康酸 草酸 L-精氨酸 L-缬氨酸 5 γ-环糊精 D-阿拉伯糖 麦芽糖醇 水苏糖 D-氨基葡萄糖 草酰苹果酸 甘氨酸 D, L-肉碱 6 糊精 D-阿拉伯糖醇 a-甲基-D-葡萄糖苷 D-塔格糖 2-羟基苯甲酸 奎尼酸 L-组氨酸 仲丁胺 7 明胶 L-阿拉伯糖醇 β-甲基-D-半乳糖苷 松二糖 4-羟基苯甲酸 D-核糖酸-1, 4-内酯 L-高丝氨酸 D, L-章鱼胺 8 糖原 熊果苷 3-甲基葡萄糖 木糖醇 β-羟基丁酸 癸二酸 羟基-L-脯氨酸 腐胺 9 菊粉 2-脱氧-D-核糖 β-甲基-D-葡萄糖醛酸 N-乙酰基-D-葡糖胺醇 γ-羟基丁酸 山梨酸 L-异亮氨酸 二羟基丙酮 10 昆布多糖 i-赤藓糖醇 α-甲基-D-甘露糖苷 γ-氨基-N-丁酸 α-酮基-戊酸 琥珀酸 L-亮氨酸 2, 3-丁二醇 11 甘露聚糖 D-岩藻糖 β-甲基-D-木糖苷 δ-氨基戊酸 衣康酸 D-酒石酸 L-赖氨酸 2, 3-丁酮 12 果胶 3-0-β-D-吡喃半乳糖基-
D-阿拉伯糖帕拉金糖 丁酸 5-酮基-D-葡萄糖酸 L-酒石酸 L-蛋氨酸 3-羟基2-丁酮 表 4 PM08板测试组分Table 4. The test components of PM08 plate孔
well (PM08)A B C D E F G H 1 空白 甘氨酸-天冬氨酸 赖氨酸-甘氨酸 脯氨酸-谷氨酸 苏氨酸-苯丙氨酸 缬氨酸-丝氨酸 γ-谷氨酸-甘氨酸 甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸 2 L-谷氨酰胺 甘氨酸-异亮氨酸 赖氨酸-甲硫氨酸 脯氨酸-异亮氨酸 苏氨酸-丝氨酸 β-丙氨酸-丙氨酸 γ-D-谷氨酸-甘氨酸 甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸 3 丙氨酸-天冬氨酸 组氨酸-丙氨酸 甲硫氨酸-酸苏氨酸 脯氨酸-赖氨酸 色氨酸-缬氨酸 β-丙氨酸-甘氨酸 甘氨酸-D-丙氨酸 甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸 4 丙氨酸-谷氨酰胺 组氨酸-谷氨酸 甲硫氨酸-酪氨酸 脯氨酸-丝氨酸 酪氨酸-异亮氨酸 β-丙氨酸-组氨酸 甘氨酸-D-天冬氨酸 甘氨酸-甘氨酸-异亮氨酸 5 丙氨酸-异亮氨酸 组氨酸-组氨酸 苯丙氨酸-天冬氨酸 脯氨酸-色氨酸 酪氨酸-缬氨酸 甲硫氨酸-β-丙氨酸 甘氨酸-D-丝氨酸 甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸 6 丙氨酸-甲硫氨酸 异亮氨酸-天冬酰胺 苯丙氨酸-谷氨酸 脯氨酸-缬氨酸 缬氨酸-丙氨酸 β-丙氨酸-苯丙氨酸 甘氨酸-D-苏氨酸 甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸 7 丙氨酸-缬氨酸 异亮氨酸-亮氨酸 谷氨酰胺-谷氨酸 丝氨酸-天冬酰胺 缬氨酸-谷氨酰胺 D-丙氨酸-D-丙氨酸 甘氨酸-D-缬氨酸 缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸 8 天冬氨酸-丙氨酸 亮氨酸-天冬酰胺 苯丙氨酸-甲硫氨酸 丝氨酸-天冬氨酸 缬氨酸-谷氨酸 D-丙氨酸-甘氨酸 亮氨酸-β-丙氨酸 甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸 9 天冬氨酸-谷氨酰胺 亮氨酸-组氨酸 苯丙氨酸-酪氨酸 丝氨酸-谷氨酰胺 缬氨酸-赖氨酸 D-丙氨酸-亮氨酸 亮氨酸-D-亮氨酸 亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸 10 天冬氨酸-甘氨酸 亮氨酸-脯氨酸 苯丙氨酸-缬氨酸 丝氨酸-谷氨酸 缬氨酸-甲硫氨酸 D-亮氨酸-D-亮氨酸 苯丙氨酸-β-丙氨酸 亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸 11 谷氨酸-丙氨酸 亮氨酸-酪氨酸 脯氨酸-精氨酸 苏氨酸-天冬氨酸 缬氨酸-苯丙氨酸 D-亮氨酸-甘氨酸 丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸 苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸 12 甘氨酸-天冬酰胺 赖氨酸-天冬氨酸 脯氨酸-天冬酰胺 苏氨酸-谷氨酰胺 缬氨酸-脯氨酸 D-亮氨酸-酪氨酸 D-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸 酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸 2. 结果
2.1 成功构建srvg17985缺失突变株
扩增得到大小约3.3 kb的线性化质粒片段以及大小均约为1 kb的上下游同源臂片段(图3-A、图3-B)，和预期大小一致，将上下游同源臂片段与质粒线性化片段等温组装后，PCR扩增检测得到大小约为2.3 kb的片段(图3-C)，与预期大小一致，成功构建重组自杀质粒pSW7848-Δsrvg17985。通过接合作用，重组自杀质粒上的srvg17985上下游同源臂片段与野生株ZJ-T的srvg17985上下游同源臂片段发生两次同源交换，这可能使得染色体上的srvg17985缺失，用Δsrvg17985-check-F/R引物对进行PCR检测，野生株可扩增出大小为631 bp的片段，而srvg17985缺失株则扩增出大小为490 bp的片段(图3-D)，测序鉴定，从而成功缺失srvg17985的第1个到第141个碱基(图1)，获得srvg17985缺失突变株。
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图 3 pSW7848 PCR线性化片段 (A)、srvg17985上下游同源臂片段 (B)、重组自杀质粒的PCR鉴定扩增片段 (C) 以及srvg17985缺失株的PCR鉴定 (D)泳道M1. DNA Marker DL10 000；泳道1. pSW7848线性化片段；泳道M2. DNA Marker DL2 000；泳道2/3. srvg17985上/下游片段；泳道M3. DNA Marker DL10 000；泳道4. 重组子pSW7848-srvg17985检测片段；泳道M4. DNA Marker DL2 000；泳道5. 野生株ZJ-T；泳道6. srvg17985候选突变株Figure 3. Linearized segment of pSW7848 (A), upstream and downstream homologous segments of srvg17985 (B), segment of identification of recombinant suicide vector by PCR (C) and identification of srvg17985 deletion mutant by PCR (D)Lane M1. DNA Marker DL10 000; Lane 1. linearized segment of pSW7848; Lane M2. DNA Marker DL2 000; Lane 2/3. UP/DOWN segments of srvg17985; Lane M3. DNA Marker DL10 000; Lane 4. segment of identification of the recombinant suicide vector by PCR; Lane M4. DNA Marker DL2 000; Lane 5. wild type ZJ-T; Lane 6. deletion candidate of srvg179852.2 srvg17985对溶藻弧菌在LBS培养基中生长的影响
srvg17985缺失后，在LBS培养基中，突变株的生长相对野生型无显著差异(P>0.05)，说明srvg17985不参与调控溶藻弧菌在LBS中的生长(图4)。
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图 4 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS培养基中的生长曲线误差线对应于标准偏差Figure 4. Growth curves of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 in LBS mediumError bars correspond with standard deviations.2.3 srvg17985对溶藻弧菌运动性的调控
srvg17985缺失后，在0.3% 琼脂LBS平板上的游动性及1.5% 琼脂LBS平板上的涌动性相对野生株无显著变化(P>0.05)，这说明srvg17985不参与调控溶藻弧菌的运动性(图5-A、图5-B)。
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图 5 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在0.3%和1.5%琼脂LBS平板上的运动性 (A) 和统计分析 (B)Figure 5. Motility of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 on 0.3% and 1.5% LBS agar plates (A) and statistical analysis (B)2.4 srvg17985对溶藻弧菌胞外蛋白酶分泌的影响
srvg17985缺失后，在1%脱脂奶粉LBS平板上，菌株胞外蛋白酶的分泌相对野生株无显著差异(P>0.05)，这表明srvg17985不参与调控溶藻弧菌胞外蛋白酶的分泌(图6-A、图6-B)。
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图 6 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS+1%脱脂奶粉平板上胞外蛋白酶的分泌 (A) 和统计分析 (B)图A内箭头指向菌斑边缘，外箭头指向蛋白酶分泌圈边缘Figure 6. Extracellular protease activities of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 mutant on LBS agar plates containing 1% skimmed milk (A) and statistical analysis (B)The inner arrow points to the edge of the plaque, and the outer arrow points to the edge of the proteolytic ring in Fig. A.2.5 srvg17985对溶藻弧菌铁离子代谢的影响
srvg17985缺失后，突变株相对野生株在LBS添加铁离子螯合剂DIP平板上的生长无显著差异，这说明srvg17985不参与调控溶藻弧菌对铁离子的吸收代谢(图7)。
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图 7 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS以及LBS添加120 μmol·L–1 DIP平板上的生长情况Figure 7. Growth ability of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 on LBS plate and LBS plate supplemented with 120 μmol·L–1 DIP2.6 srvg17985对溶藻弧菌抗生素敏感性的影响
野生株和srvg17985突变株均对包括林可霉素、万古霉素、克林霉素在内的18种抗生素具有抗性；野生株对红霉素表现抗性，缺失株对红霉素表现中介敏感，但两者的抑菌圈直径差异不显著(P>0.05)；两菌株对其他的11种抗生素表现出不同程度的敏感，但均无显著性差异(P>0.05，表5)。
表 5 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985对各抗生素抗性Table 5. Antibiotics resistance of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985抗生素
antibiotic浓度/μg·片−1
concentration抑菌圈直径/mm size of inhibition zone ZJ-T ZJ-T-Δsrvg17985 林可霉素 lincomycin 2 0.00/R 0.00/R 万古霉素 vancomycin 30 0.00/R 0.00/R 克林霉素 clindamycin 2 0.00/R 0.00/R 氯霉素 chloramphenicol 300 21.00±1.41/S 20.00±0.00/S 氨苄青霉素 ampicillin 10 0.00/R 0.00/R 苯唑西林 oxacillin 1 0.00/R 0.00/R 哌拉西林 piperacillin 100 0.00/R 0.00/R 卡那霉素 kanamycin 30 0.00/R 0.00/R 青霉素-G penicillin-G 10 0.00/R 0.00/R 头孢唑啉 cefazolin 30 11.00±1.41/R 11.00±1.41/R 妥布霉素 tobramycin 10 12.50±0.71/I 12.67±2.31/I 新霉素 neomycin 30 13.67±2.52/I 15.00±2.65/I 新生霉素 novobiocin 30 21.00±5.66/S 20.50±4.95/S 四环素 tetracycline 30 15.67±6.03/I 16.33±3.06/I 红霉素 erythromycin 15 12.00±2.65/R 14.00±1.41/I 麦迪霉素 medemycin 30 11.50±0.71/R 12.50±3.54/R 多粘菌素B polymyxin B 300 12.33±2.31/S 14.00±2.83/S 多西环素 doxycycline 30 19.50±3.54/S 20.00±2.83/S 乙酰螺旋霉素 acetylspiramycin 30 0.00/R 0.00/R 大观霉素 spectinomycin 100 10.33±1.53/R 11.00±1.41/R 米诺霉素 minocycline 30 24.00±5.66/S 25.50±4.95/S 头孢克肟 cefixime 5 10.67±1.53/R 12.00±4.24/R 阿莫西林 amoxicillin 10 0.00/R 0.00/R 阿奇霉素 azithromycin 15 0.00/R 0.00/R 克拉霉素 clarithromycin 15 12.33±0.58/R 11.00±1.73/R 罗红霉素 roxithromycin 15 11.00±1.41/R 10.67±0.58/R 替考拉宁 teicoplanin 30 0.00/R 0.00/R 磷霉素 fosfomycin 200 17.33±2.31/S 18.00±1.41/S 链霉素 streptomycin 300 11.33±1.53/S 11.00±1.41/S 庆大霉素 gentamicin 120 18.00±4.36/S 17.00±1.73/S 注：S. 敏感；I. 中介；R. 耐药 Note: S. susceptible; I. intermediate; R. resistance to drug 2.7 srvg17985对溶藻弧菌代谢的调控
1) PM02测试了细菌对95种不同碳源的利用(表3)，发现srvg17985缺失后，细菌以昆布多糖、果胶以及二羟基丙酮为碳源时，在稳定期相对野生株生长量更大(One-Way ANCOVA：F值分别为35.482、18.853、33.292；P值均小于0.001；Student's t检验：19.5 h之后各时间点P<0.05，图8)，说明srvg17985负调控溶藻弧菌对昆布多糖、果胶以及二羟基丙酮的代谢。此外，二羟基丙酮孔吸光度在约70 h处下降，其后在约100 h处又上升(图8)。
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图 8 srvg17985缺失对昆布多糖、果胶、二羟基丙酮以及丙氨酸-天冬氨酸代谢的影响误差线对应于标准偏差Figure 8. Effect of srvg17985 deletion on metabolism of laminarin, pectin, dihydroxyacetoneor Ala-AspError bars correspond with standard deviations.2) PM08测试了细菌对95种不同多肽的利用(表4)，其中A03孔由于测定误差，舍去102 h时间点的数据进行分析，发现srvg17985缺失后，可利用丙氨酸-天冬氨酸为氮源，而野生株却不能(One-Way ANCOVA：F=89.639，P<0.001；Student's t检验：0.0 h之后各时间点P<0.05，图8)，说明srvg17985负调控溶藻弧菌对丙氨酸-天冬氨酸的代谢。
3. 讨论
越来越多的研究表明小RNA对细菌遗传变异、生长繁殖、致病机制等具有重要的调控作用[3,19]。本研究发现溶藻弧菌中小RNA srvg17985缺失后不影响其在LBS中的生长、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收代谢、对所测试的30种抗生素抗性以及对所测试的大多数单一碳源、单一氮源的利用，但对昆布多糖、果胶以及二羟基丙酮的利用增强，表现为稳定期生长量更大，并变得可利用丙氨酸-天冬氨酸作为氮源。
细菌感染宿主的第一步是黏附，而运动性可促进细菌对宿主的黏附，进而影响细菌的定殖，因此与细菌致病性密切相关[20]。摄铁系统和胞外蛋白酶也被报道是溶藻弧菌2个重要的致病因子[21-22]。目前，已有小RNA被报道参与调控细菌的运动性和铁代谢等，进而影响细菌致病性。如Ryan等[23]发现小RNA DsrA的缺失导致肠道沙门氏菌(Salmonella enterica)运动性减弱，同时毒力降低；Wagner和Romby[2]发现小RNA RyhB感受到环境中铁离子浓度下降时，通过下调相关基因的表达，从而调控细菌的摄铁系统，进而影响其致病性。而本研究发现小RNA srvg17985缺失后不影响溶藻弧菌的运动性、胞外蛋白酶分泌以及对铁的吸收代谢，因此，srvg17985很可能不通过类似小RNA DsrA和RyhB等方式调控溶藻弧菌的致病性，但其对溶藻弧菌致病性是否具有调控作用，仍需进一步通过细胞感染实验以及宿主攻毒实验等进行验证。
抗生素的滥用导致细菌耐药性增加，细菌耐药性是细菌对抗菌药物的自然反应，是对环境的一种适应。小RNA作为细菌广泛存在的调节元件，调节细菌对抗生素的适应性而介导细菌耐药。Guo等[24]发现，在大肠杆菌中，小RNA ralR及其靶基因ralA双缺失后，对磷霉素的敏感性显著增强；Moon等[25]发现，小RNA mgrR负调控耐药相关基因eptB，从而影响对两性霉素B的耐药性。本研究发现，溶藻弧菌野生株和小RNA srvg17985缺失株对测定的多种抗生素均具有抗性，且两者对测定的30种抗生素具有相似的抗菌谱，因此srvg17985并不通过调控溶藻弧菌对这些抗生素的耐药性，影响其对环境的适应。
代谢调控是细菌适应环境变化的另一策略，而小RNA也被报道参与细菌代谢调控。如Spot 42调控细菌对葡萄糖、L-果糖、D-木糖、D-丹麦醇、N-乙酰神经氨酸和L-乳酸等的吸收和代谢[4,26]；GcvB与细菌甘氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、精氨酸、丝氨酸以及某些二肽和寡肽的转运和代谢密切相关[27-28]。本研究发现，小RNA srvg17985缺失后，溶藻弧菌对昆布多糖、果胶以及二羟基丙酮的利用增强，并且变得可利用丙氨酸-天冬氨酸作为氮源。
昆布多糖是吡喃葡萄糖以1, 3-糖苷键结合而成的多糖，是最丰富的碳源之一，大约13%的原核生物能够以昆布多糖作为单一碳源生长[29]，因此，昆布多糖的代谢对海洋细菌的生长至关重要。果胶是一类以D-半乳糖醛酸为主，并由少量D-半乳糖、D-阿拉伯糖、D-甘露糖、L-岩藻糖等多达12种的单糖组成的杂多糖[30]。而二羟基丙酮为单糖中非还原性丙糖中的一种，是最简单的酮糖。目前为止，未见小RNA对昆布多糖、果胶及二羟基丙酮代谢调控的报道。本研究首次发现，小RNA srvg17985缺失后对三者的利用增强，因此，其可能负调控三者的转运、多糖分解为单糖、以及分解为单糖后的降解代谢等过程。分析溶藻弧菌ZJ-T基因组序列发现，其基因组上存在100多个碳转运和降解相关的基因，参与果糖和甘露糖代谢、半乳糖代谢和柠檬酸循环等过程[31]。srvg17985很可能与其中某些基因的mRNA作用，影响其表达，从而调控溶藻弧菌碳转运和降解，具体调控机制还需进一步研究。此外，溶藻弧菌对二羟基丙酮利用的吸光度在约70 h处出现下降，其后在大约100 h处又出现上升的趋势。吸光度的大小与培养液中悬浮物，如活菌、死菌、裂解细菌以及微生物分泌物等的量有关[32]。因此，此消彼长的状态很可能是培养后期，细菌的繁殖、死亡、裂解以及分泌物数量交替变化较大，导致吸光度测定此起彼伏，但是其具体的代谢特性可结合活菌计数等进一步研究[32]。
氨基酸作为蛋白质的基本骨架、酶的主要成分，参与能量供给、酶催化、碳氮代谢等几乎所有生命活动，其精细调控对细菌生命活动具有重要意义。本研究发现，溶藻弧菌野生株ZJ-T不能利用丙氨酸-天冬氨酸二肽，但srvg17985缺失后可利用丙氨酸-天冬氨酸作为氮源生长。笔者前期研究发现，溶藻弧菌野生株ZJ-T可利用丙氨酸和天冬氨酸单一氨基酸作为单一碳氮源生长[17]。因此，srvg17985很可能通过调控丙氨酸-天冬氨酸二肽的转运以及分解成单一氨基酸的过程，从而影响细菌生长，而不参与调控二肽分解为单一氨基酸后的降解代谢。基因组序列分析发现，溶藻弧菌ZJ-T基因组上存在多个寡肽转运蛋白，如BAU10_05965、BAU10_05980和BAU10_15980[31]，但srvg17985具体调控的靶标基因及其调控机制需进一步深入研究。
本研究首次对溶藻弧菌小RNA srvg17985的环境适应调控功能进行分析，实验结果丰富了溶藻弧菌小RNA的调控研究。结果表明srvg17985参与调控溶藻弧菌对昆布多糖、果胶、二羟基丙酮以及丙氨酸-天冬氨酸的代谢，但其调控机制未知。因此，下一步笔者将利用IntaRNA和TargetRNA2等软件进行靶标预测，并结合转录组差异表达谱分析，挖掘srvg17985调控的可能靶标基因，进一步通过凝胶迁移结合(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)实验、双质粒荧光报告基因相互作用检测系统等鉴定srvg17985与靶标基因的相互作用机制，从而阐明srvg17985对溶藻弧菌碳氮代谢的基因调控作用，从小RNA角度揭示溶藻弧菌的环境适应性。
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表 1 长体圆鲹基因组中不同类型SSR统计
Table 1 Different types of SSR statistics in D. macrosoma genome
重复单元
repeat unit微卫星数量/个
number of microsatellite占比/%
ratio一核苷酸 mono-nucleotide 8 184 11.61 二核苷酸 di-nucleotide 37 646 53.39 三核苷酸 tri-nucleotide 13 960 19.80 四核苷酸 tetra-nucleotide 7 741 10.98 五核苷酸 penta-nucleotide 2 255 3.20 六核苷酸 hexa-nucleotide 722 1.02 合计 total 70 508 100.00 
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表 2 27对长体圆鲹微卫星引物信息
Table 2 Information of 27 pairs of primers in D. macrosoma
位点
locus引物序列 (5'−3')
primer sequence重复单元
repeat motif退火温度/℃
annealing temperature期望长度/bp
allele sizeDma03 F:CCACGCCTATTGAGTTACAGA (CA)9 60 186 R:GAGCCAGTGGATGAACAGAGT Dma07 F:GCCCCTGTGGGTGTGTGA (CA)9 60 225 R:GGGTGGTGGGTTCGGTTT Dma12 F:GAACCAGTGCCTACAATAGA (AC)9 60 243 R:CTGCTCACGGTAAGTCCA Dma15 F:ACAGGAAGGAACAGGACAG (TG)10 55 254 R:TATTGAAGTGAAAAAGCCG Dma22 F:CGCTGTTGAAATGAAGAAGA (GT)10 60 317 R:AGTGATGTCGCCTCATAAAT Dma23 F:AAACTGAGGGCGAGATAGAGG (AC)10 55 190 R:CCACAGGCTGAGTAAACCAAC Dma26 F:ATCCCATTCACCGACATAG (TG)10 58 258 R:CTGTGGTATCGTTCCCTGT Dma28 F:TGATTGGCTTCTACTCTGC (AC)10 55 281 R:AGTGGCTTGTTTGACTCTTAT Dma36 F:GGATGTAGTGAAGAGGGGAG (GT)11 55 239 R:CACAATCAGTGTTATGGCAG Dma38 F:GCCAATAAAGGCAAACAGT (CA)11 60 227 R:ATCCGAGACAAAGACATACAA Dma39 F:AGTGTGCTGACTTTTCTCTG (CA)11 55 241 R:TTATTGTTTGTTGTCTGGGT Dma45 F:CTCCTTTTTCTTCTTCCTCT (CA)11 60 281 R:CTACCTGCTCTTCAACTCAT Dma51 F:TGACAGCCTCCACTACTCC (GA)12 55 225 R:GCTAACCAGACACGCAAA Dma54 F:AAAGCCCATCTGTCTCGT (GT)12 60 202 R:TGTTTCAGTCCGTTCCTG Dma58 F:TCAAGAGGGAGTGGGAGC (AC)12 58 279 R:TCAAATGGGTGTTTAGCG Dma64 F:GCTCAGACTGCGTGGACA (TG)13 55 314 R:GCTGGTGAACAACAGGACA Dma72 F:TTCCGCAGGCATAAAAAC (CT)13 58 301 R:CCAAGGTCCGCTACACTA Dma76 F:TTCTCGCTGACCTGCTTG (TG)14 55 253 R:GCGTCCTCGTCGTCTTTC Dma81 F:GAGACACGGTCAGAAAACA (TGC)6 60 216 R:GGAAGTAGGACTCTAGGGG Dma82 F:CTGTCACTCCATTCCTATTCC (GTT)6 58 244 R:CCTACATTTGTGCTTTTGTTC Dma83 F:CTCTAAAGCCGACCTAACC (CTT)6 58 239 R:TGTCTCAACACAGCGAAAC Dma84 F:AAACTAACTCATCACCAG (TGT)6 55 283 R:AAACGACAGGAACTCAAT Dma85 F:CTCACTTTGACCCAACCAG (AGG)6 55 256 R:CCTTTCACCGAGACACCAG Dma131 F:TGCGGATGGGTGGTAGTGT (GGT)8 55 208 R:ATTGCTGGTAGTCGGTGGC Dma132 F:CCCAGTGAGACCAGAACCA (GCT)8 55 268 R:GACCCGTAGACAGGAGAGT Dma135 F:GTTGTTGTTTTTTTCCTT (GCA)9 55 301 R:CATCAGTCTGGCTTTATA Dma145 F:ACGATACAGCAGCCGAAG (TCA)10 60 197 R:AGTGATGTCGCCTCATAAAT
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表 3 长体圆鲹微卫星标记的种群遗传学特征
Table 3 Characteristics of microsatellite loci in D. macrosoma
位点
locusN Na Ho He PHWE PIC Dma03 35 8 0.857 1 0.790 9 0.042 0 0.746 0 Dma07 35 9 0.771 4 0.855 9 0.553 4 0.825 0 Dma12 34 11 0.685 7 0.816 6 0.106 4 0.809 0 Dma15* 35 14 0.542 9 0.911 8 0.000 0 0.890 0 Dma22* 32 14 0.485 7 0.813 2 0.000 0 0.864 0 Dma23 34 17 0.714 3 0.864 8 0.003 3 0.868 0 Dma26* 34 14 0.428 6 0.869 1 0.000 0 0.870 0 Dma28 35 11 0.742 9 0.837 7 0.035 3 0.803 0 Dma36 35 9 0.685 7 0.786 3 0.054 5 0.743 0 Dma38* 34 12 0.628 6 0.851 2 0.000 0 0.849 0 Dma39* 33 12 0.514 3 0.782 0 0.000 0 0.793 0 Dma45 34 12 0.771 4 0.847 8 0.139 2 0.844 0 Dma51* 31 12 0.485 7 0.784 5 0.000 0 0.859 0 Dma54 35 15 0.771 4 0.900 6 0.139 0 0.878 0 Dma58 34 12 0.771 4 0.845 6 0.449 7 0.843 0 Dma64* 31 13 0.428 6 0.788 3 0.000 0 0.865 0 Dma72 35 8 0.628 6 0.713 9 0.155 7 0.659 0 Dma76 35 12 0.685 7 0.908 1 0.003 6 0.886 0 Dma81 35 8 0.628 6 0.795 0 0.045 7 0.752 0 Dma82 35 5 0.485 7 0.538 3 0.023 6 0.497 0 Dma83* 34 8 0.342 9 0.705 8 0.000 0 0.674 0 Dma84 35 7 0.542 9 0.704 8 0.005 9 0.649 0 Dma85 35 8 0.828 6 0.747 8 0.876 9 0.704 0 Dma131 35 9 0.628 6 0.717 6 0.646 6 0.661 0 Dma132 35 8 0.657 1 0.746 6 0.365 5 0.692 0 Dma135 34 10 0.742 9 0.840 5 0.241 8 0.835 0 Dma145 34 7 0.600 0 0.749 3 0.077 4 0.725 0 注：N. 有效样品数；Na. 等位基因数；Ho. 表观杂合度；He. 期望杂合度；PHWE. “哈迪-温伯格”平衡显著性检验P值；PIC. 多态信息含量；*. 经Bonferroni校正后显著背离“哈迪-温伯格”平衡 (校正P<0.001 85) Note: N. effective number of samples; Na. number of alleles; Ho. observed heterozygosity; He. expected heterozygosity; PHWE. Hardy–Weinberg probability test; PIC. polymorphism information content; *. significant deviation from HWE after Bonferroni's correction (adjusted P-value<0.001 85)
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表 4 长体圆鲹二、三核苷酸重复微卫星标记的比较
Table 4 Comparison on di- and trinucleotide-repeated microsatellite loci in D. macrosoma
序列
sequence引物数
primer number重复次数
repeat number筛选效率
efficiencyPIC 二核苷酸重复
di-nucleotide-repeated18 9~14 22.2% 0.827 4 三核苷酸重复
tri-nucleotide-repeated9 6~10 29.0% 0.687 7
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[1] 中国科学院动物研究所, 中国科学院海洋研究所, 上海水产学院. 南海鱼类志[M]. 北京: 科学出版社, 1962: 387-389. [2] 杨吝, 张旭丰, 谭永光, 等. 南海北部灯光围网渔获组成分析[J]. 南方水产, 2009, 5(6): 65-70. doi: 10.3969/j.issn.1673-2227.2009.06.012 [3] 张立, 李渊, 林龙山, 等. 南海中南部主要经济种类渔业资源声学评估[J]. 海洋渔业, 2016, 38(6): 577-587. doi: 10.3969/j.issn.1004-2490.2016.06.003 [4] 张俊, 张鹏, 陈作志, 等. 南海外海鲹科鱼类资源量及其分布[J]. 南方水产科学, 2016, 12(4): 38-48. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.04.005 [5] 张鹏, 张俊, 李渊, 等. 秋季南海中南部海域的一次灯光罩网探捕调查[J]. 南方水产科学, 2016, 12(2): 67-74. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.010 [6] SHIRAISHI T, TANAKA H, OHSHIMO S, et al. Age, growth and reproduction of two species of scad, Decapterus macrosoma and D. macarellus in the waters off southern Kyushu[J]. Jpn Agr Res Q, 2010, 44(2): 197-206. doi: 10.6090/jarq.44.197
[7] BALASUBRAMANIAN N K, NATARAJAN P. Resource characteristics of the scads, Decapterus russelli and D. macrosoma of the Vizhinjam area, southwest coast of India[J]. Indian J Fish, 1999, 46(2): 111-122.
[8] POTIE M, DRAPEAU L. Modelling and forecasting the catch of the scads (Decapterus macrosoma, Decapterus russellii) in the Javanese purse seine fishery using ARIMA time series models[J]. Asian Fish Sci, 2000, 13: 75-85.
[9] 翟云, 吴仁协, 牛素芳, 等. 基于SLAF-seq技术开发蓝圆鲹微卫星标记及跨物种扩增检测[J]. 应用海洋学学报, 2018, 37(3): 426-434. doi: 10.3969/J.ISSN.2095-4972.2018.03.016 [10] DEWOODY J A, AVISE J C. Microsatellite variation in marine, freshwater and anadromous fishes compared with other animals[J]. J Fish Biol, 2000, 56(3): 461-473. doi: 10.1111/jfb.2000.56.issue-3
[11] EUSTICE M, YU Q Y, LAI C W. Development and application of microsatellite markers for genomic analysis of papaya[J]. Tree Genet Genome, 2008, 4(2): 333-341. doi: 10.1007/s11295-007-0112-2
[12] VARELA A I, RITCHIE P A, SMITH P J. Global genetic population structure in the commercially exploited deep-sea teleost orange roughy (Hoplostethus atlanticus) based on microsatellite DNA analyses[J]. Fish Res, 2013, 140: 83-90. doi: 10.1016/j.fishres.2012.12.011
[13] 海萨, 李家乐, 郭焱, 等. 河鲈微卫星引物筛选[J]. 水生态学杂志, 2008, 1(6): 90-94. [14] 赵哲霞, 蒋珊, 王滨花, 等. 黄颡鱼属SSR分子鉴定及其遗传多样性[J]. 南昌大学学报(理科版), 2014, 38(5): 498-501. doi: 10.3969/j.issn.1006-0464.2014.05.019 [15] 翟云, 吴仁协, 牛素芳, 等. 采用高通量技术开发花鲈二碱基重复微卫星标记[J]. 基因组学与应用生物学, 2018(9): 1-11. [16] CASTOE T A, STREICHER J W, MEIK J M, et al. Thousands of microsatellite loci from the venomous coralsnake Micrurus fulvius and variability of select loci across populations and related species[J]. Mol Ecol Resour, 2012, 12(6): 1105-1113. doi: 10.1111/1755-0998.12000
[17] 鲁翠云, 毛瑞鑫, 李鸥, 等. 鲤鱼三、四核苷酸重复微卫星座位的筛选及特征分析[J]. 农业生物技术学报, 2009, 17(6): 979-987. doi: 10.3969/j.issn.1674-7968.2009.06.007 [18] 谭照君, 张天奇, 鲁翠云, 等. 鲢三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选及其特征分析[J]. 上海海洋大学学报, 2011, 20(3): 328-335. [19] 李文升, 刘翠, 鲁翠云, 等. 草鱼三、四核苷酸重复微卫星标记的分离与特征分析[J]. 中国水产科学, 2011, 18(4): 742-750. [20] THIEL T, MICHALEK W, VARSHNEY R K, et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (Hordeum vulgare L.)[J]. Theor Appl Genet, 2003, 106(3): 411-422. doi: 10.1007/s00122-002-1031-0
[21] SCHUELKE M. An economic method for the fluorescent labeling of PCR fragments[J]. Nat Biotechnol, 2000, 18(2): 233-234. doi: 10.1038/72708
[22] ROUSSET F. genepop'007: a complete re-implementation of the genepop software for Windows and Linux[J]. Mol Ecol Resour, 2008, 8(1): 103-106. doi: 10.1111/j.1471-8286.2007.01931.x
[23] KALINOWSKI S T, TAPER M L, MARSHALL T C. Revising how the computer program CERVUS accommodates genotyping error increases success in paternity assignment[J]. Mol Ecol, 2007, 16(5): 1099-1106. doi: 10.1111/j.1365-294X.2007.03089.x
[24] 杨兵, 林琳, 李纯厚, 等. 基于高通量测序的二长棘鲷微卫星标记开发与评价[J]. 南方水产科学, 2015, 11(4): 116-120. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.04.017 [25] 秦海峰, 龙宁, 吴建国, 等. 甜叶菊微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选[J]. 作物学报, 2014, 40(3): 447-456. [26] LIN L, LI C H, CHEN Z Z, et al. Development and characterization of twenty-three microsatellite markers for the purpleback flying squid (Symplectoteuthis oualaniensis)[J]. Conserv Genet Resour, 2015, 7(1): 161-163. doi: 10.1007/s12686-014-0318-1
[27] KONG X L, CHEN Z Z, LIN L, et al. Polymorphic micro-satellite loci isolated from the yellowbelly threadfin bream, Nemipterus bathybius[J]. Genet Mol Res, 2014, 13(3): 5254-5257. doi: 10.4238/2014.July.24.3
[28] 房祖业, 陈晓东, 吴咏诗, 等. 大刺鳅 (Mastacembelus armatus) 二、三、四碱基重复微卫星标记的筛选和特征分析[J]. 海洋与湖沼, 2018, 49(1): 174-182. [29] 高峰涛, 邵长伟, 崔忠凯, 等. 基于高通量测序的青石斑鱼基因组微卫星开发及评价[J]. 中国海洋大学学报(自然科学版), 2017, 47(4): 52-57. [30] SONG W T, PANG R Y, NIU Y Z, et al. Construction of high-density genetic linkage maps and mapping of growth-related quantitative trail loci in the Japanese flounder (Paralichthys olivaceus)[J]. PLoS One, 2012, 7(11): 50404. doi: 10.1371/journal.pone.0050404
[31] SONG W, LI Y, ZHAO Y, et al. Construction of high-density microsatellite genetic linkage maps and mapping of sexual and growthrelated traits in half-smooth tongue sole (Cynoglossus semilaevis)[J]. PLoS One, 2012, 7(12): e52097. doi: 10.1371/journal.pone.0052097
[32] 曾晓芸, 杨宗英, 田辉伍, 等. 基于Mi-Seq高通量测序分析裸体异鳔鳅鮀微卫星组成[J]. 淡水渔业, 2015, 45(1): 3-7. doi: 10.3969/j.issn.1000-6907.2015.01.001 [33] 熊良伟, 王帅兵, 封琦, 等. 基于高通量测序的中华鳑鲏基因组微卫星特征分析及标记开发[J]. 江苏农业科学, 2018, 46(18): 164-168. [34] XIONG L W, WANG Q, QIU G F. Large-scale isolation of microsatellites from Chinese mitten crab Eriocheir sinensis via a solexa genomic survey[J]. Int J Mol Sci, 2012, 13(12): 16333-16345. doi: 10.3390/ijms131216333
[35] 高焕, 孔杰. 串联重复序列的物种差异及其生物功能[J]. 动物学研究, 2005, 26(5): 555-564. doi: 10.3321/j.issn:0254-5853.2005.05.017 [36] BOTSTEIN D, WHITE R L, SKOLNICK M, et al. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J]. Am J Hum Genet, 1980, 32(3): 314-331.
[37] ELLEGREN H. Microsatellite evolution: a battle between replication slippage and point mutation[J]. Trends Genet, 2002, 18(2): 70.
[38] WEBER J L. Informativeness of human (dC-dA) n·(dG-dT) n polymorphisms[J]. Genomics, 1990, 7(4): 524-530. doi: 10.1016/0888-7543(90)90195-Z
[39] 龚小玲, 李思发, 蔡完其, 等. 澳洲鳗鲡微卫星分子标记的筛选与检测[J]. 中国水产科学, 2009, 16(1): 133-138. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2009.01.019 -
期刊类型引用(1)
1. 孟璐，车金远，黄旭雄，罗土炎，鲍宝龙. 溶藻弧菌RseB基因缺失对凡纳滨对虾致病性的影响. 上海海洋大学学报. 2023(04): 681-689 . 
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