黄斑篮子鱼(Siganus oramin)俗称泥猛，为广温、广盐性近岸小型鱼类，全球分布广泛，在中国主要分布于南海、东海南部及台湾海峡^[1-3]。黄斑篮子鱼肉质鲜美，营养价值高，具有较高的食用价值和一定的保健作用^[4]。因其食性为杂食偏植食，喜啃食附着藻类，可清洁网衣，具有饲养周期短、养殖成本低等优点，市场开发潜力巨大^[3]。近年来，黄斑篮子鱼鱼排网箱养殖和池塘鱼虾混养趋于规模化^[5-9]。

为降低鱼类对捕捞、人工繁殖和标记等操作的应激反应，生产上常将其麻醉以起到保护作用^[9-10]。麻醉可减少鱼在运输过程中的损伤，提高运输质量和成活率^[11]。黄斑篮子鱼的应激反应十分强烈，受刺激后各鳍张开、体色变深并向下冲刺，成鱼比幼鱼更甚，由于各鳍上生长着藏有毒液的硬刺，被刺后会产生剧痛感。目前，黄斑篮子鱼人工规模化苗种培育技术尚未突破，养殖用苗主要从自然海区中直接捕获，常因在捕捞和运输中的彼此刺伤而导致饲养失败。因此，在人工操作前将其麻醉很有必要。

丁香酚为植物提取物，价廉易得，代谢物能快速排出，不会诱发机体产生突变物质，不会对人类及环境造成危害，可在食品中直接添加^[12]。美国FDA (Food and Drug Administration)认定丁香酚对人体安全，在食品、牙科中广泛运用^[13]。澳大利亚、智利、芬兰、日本等将丁香酚作为合法的水产麻醉剂，麻醉后的水产品经过一定的休药期即可上市^[14-15]。丁香酚作为鱼类麻醉剂在斑点叉尾鮰幼鱼(Ictalurus punctaus)^[16]、斑马鱼(Danio rerio)^[17]、大西洋鲑(Salmo salar)^[18]、俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)^[19]、鲫(Carassius auratus)^[20]、锦鲤(Cyprinus carpio)^[21]、罗非鱼^[22]、翘嘴鲌(Culter alburnus)^[23]、泰国斗鱼(Betta splendens)^[24]、神仙鱼(Pterophyllum scalare)^[25]和Amphilophus labiatus×A. trimaculatus^[26]等鱼种上的研究已有报道，研究表明，丁香酚对不同鱼种的适宜麻醉浓度存在较大差异。

本实验研究了丁香酚对黄斑篮子鱼幼鱼的麻醉效果，旨在探索黄斑篮子鱼幼鱼人工操作时丁香酚的最佳使用浓度，为生产提供参考。

1.   材料与方法

1.1   材料

实验用黄斑篮子鱼幼鱼取自大亚湾大鹏澳海域，地笼诱捕后在高位池挂网箱暂养，挑选活力强、健康无伤的个体进行实验，实验鱼体质量为(4.83±1.30) g，全长为(7.22±0.57) cm。实验前停食1 d，实验在室内自制透明玻璃缸静水中进行，玻璃缸规格为长×宽×高=20 cm×20 cm×50 cm，缸内放一气石，微充氧。丁香酚购自常熟尚齿齿科材料有限公司，浅黄色挥发性液剂，丁香酚质量百分比为96%，密度为1.036 1~1.05 g·mL^–1。实验用水为沙滤自然海水，盐度31，水温(29.3±1.1) ℃，溶解氧大于6 mg·L^–1，pH 7.9。

1.2   方法

1.2.1   麻醉剂的配制

实验开始前半小时配制丁香酚溶液，将丁香酚与无水乙醇(体积比为1∶9)混合作为母液，实验时按所需浓度将母液稀释并充分搅匀使用。

1.2.2   麻醉和复苏阶段行为特征观察

在麻醉剂浓度低时，实验鱼无法进入麻醉状态；在麻醉剂浓度高时，实验鱼很快进入麻醉状态，而麻醉过程的行为特征则难以区分。为观察到稳定且明显的麻醉分期特征，需要一个适当的麻醉浓度。根据预实验结果，观察黄斑篮子鱼幼鱼麻醉过程中的行为特征，设定相对合适的丁香酚质量浓度为30 mg·L^–1。

随机选取5尾黄斑篮子鱼幼鱼置于30 mg·L^–1的丁香酚溶液中，麻醉后小心捞出放入自然海水中复苏，用高清摄像机将麻醉和复苏全过程拍摄下来，之后通过现场观察和录像对各时期的行为特征进行分期。麻醉和复苏的分期标准参考刘长琳等^[10]和张志山等^[23]，并结合黄斑篮子鱼幼鱼自身行为特征。

1.2.3   最终麻醉程度

根据丁香酚麻醉预实验结果，设计7个浓度梯度，分别为10 mg·L^–1、20 mg·L^–1、30 mg·L^–1、40 mg·L^–1、60 mg·L^–1、80 mg·L^–1和100 mg·L^–1。每个梯度实验用鱼20尾，测定各浓度下1 h内实验鱼能达到的最终麻醉程度。

1.2.4   不同丁香酚浓度的麻醉效果

根据丁香酚麻醉预实验结果，分别在10 mg·L^–1、20 mg·L^–1、30 mg·L^–1、40 mg·L^–1、60 mg·L^–1、80 mg·L^–1和100 mg·L^–1等7个丁香酚浓度下测定黄斑篮子鱼幼鱼的入麻时间和复苏时间，每个浓度实验用鱼3尾，重复3次。其中入麻时间为放入麻醉液中至进入4期麻醉状态所需时间；复苏时间为从4期麻醉状态放入自然海水中至完全复苏所需时间。

1.2.5   空气中暴露对复苏的影响

将黄斑篮子鱼幼鱼置于30 mg·L^–1的丁香酚溶液中，进入4期麻醉状态后捞出，迅速放于湿毛巾上，并用另一块湿毛巾盖住躯干和尾部，在空气中持续暴露，分别于第2、第4、第6、第8、第10、第12、第14、第16、第18 分钟各选3尾放入自然海水中复苏，并记录复苏时间，实验用鱼30尾，重复3次。

1.2.6   麻醉对呼吸频率的影响

根据丁香酚麻醉预实验结果，在10 mg·L^–1、20 mg·L^–1、30 mg·L^–1、40 mg·L^–1、60 mg·L^–1、80 mg·L^–1、100 mg·L^–1等7个丁香酚溶液中，分别测定黄斑篮子鱼幼鱼在10 s、20 s、40 s、1 min、1 min 30 s、2 min、3 min、5 min等时间的呼吸频率。每个浓度实验用鱼3尾，重复3次，鳃盖一张一合为呼吸1次，通过录像统计连续10 s的呼吸次数，再换算为每分钟的呼吸次数，即为呼吸频率。

1.2.7   数据处理

实验所得数据用Microsoft Excel 2016和SPSS 20.0软件进行统计分析。

2.   结果

2.1   麻醉和复苏阶段的行为特征

在30 mg·L^–1的丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼麻醉和复苏过程中各分期的时间及行为特征见表1。

表  1  30 mg·L^–1丁香酚溶液中黄斑篮子鱼幼鱼进入各麻醉和复苏分期的时间及行为特征

Table  1.  Time and behavioral expression of juvenile S. oramin entering anaesthesia and recovery stages with 30 mg·L^–1 eugenol

分期 stage		t/s	行为特征 behavioral characteristic
麻醉 anaesthesia	1期 (轻度镇静期)	3.2±0.84	产生应激反应，在缸内游动迅速，鳃盖张合加快。
	2期 (深度镇静期)	9.2±2.39	鳃盖张合略微加快，勉强保持平衡，在小范围内缓慢游动。
	3期 (平衡失调期)	33.4±4.40	开始失去平衡，在水体中侧倾，无游动。
	4期 (麻醉期)	90.0±8.75	侧躺在缸底，鳃盖有规律缓慢张合，对外界刺激无反应。
	5期 (深度麻醉期)	388.48±33.87	鱼体静止，鳃盖张合极度缓慢且无规律。
	6期 (延髓麻醉期)	407.8±33.48	鱼体静止，鳃盖停止张合，发生休克，继续浸泡将死亡。
复苏 recovery	1期	3.7±1.06	鱼体静止平躺在水底，鳃盖开始张合。
	2期	69.6±9.6	开始恢复平衡，偶尔摆尾，但不能保持平衡，鳃盖张合加快。
	3期	102.3±10.1	完全恢复平衡，摆尾正常，鳃盖张合有力，对刺激反应较为迟钝。
	4期	146.7±15.7	鳃盖张合正常，完全恢复正常游动，对刺激有迅速反应。

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2.2   黄斑篮子鱼幼鱼在丁香酚溶液中的最终麻醉程度

丁香酚质量浓度小于100 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼在1 h内达到最终麻醉程度(图1)。10 mg·L^–1丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼的最终麻醉程度为2期(100%)；20 mg·L^–1丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼的最终麻醉程度为4期(100%)；30 mg·L^–1丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼的最终麻醉程度一部分为4期(30%)、另一部分达到6期(70%)；当丁香酚质量浓度大于40 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼的最终麻醉程度均能达到6期(100%)。

图  1  黄斑篮子鱼幼鱼在7种丁香酚浓度中的最终麻醉程度

Figure  1.  Final anesthetic level of juvenile S. oramin with seven different eugenol mass concentrations

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2.3   丁香酚麻醉黄斑篮子鱼幼鱼的有效浓度

水温(29.3±1.1) ℃时，黄斑篮子鱼幼鱼在不同浓度丁香酚溶液中的入麻时间、复苏时间及麻醉时的呼吸频率结果见图2。其中丁香酚质量浓度为20 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼在3 min时只能达到2期麻醉状态(图中未列出)。当丁香酚质量浓度为30~100 mg·L^–1时，随着丁香酚浓度上升，黄斑篮子鱼幼鱼入麻时间逐渐下降，除60 mg·L^–1和80 mg·L^–12个浓度下的入麻时间差异不显著外(P>0.05)，其余各浓度下的入麻时间均有显著差异(P<0.05)。丁香酚质量浓度为30~80 mg·L^–1时，进入4期麻醉的黄斑篮子鱼幼鱼呼吸频率随丁香酚浓度上升而降低，复苏时间随丁香酚浓度上升而增加，当丁香酚质量浓度为100 mg·L^–1时，复苏时间比60 mg·L^–1和80 mg·L^–1时短，对应的呼吸频率也高。当丁香酚质量浓度为30~100 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼均能在3 min内进入4期麻醉并在4 min内完全复苏；因此，30 mg·L^–1丁香酚浓度为达到理想麻醉效果的最低浓度，适合在生产中推广使用。

图  2  不同丁香酚浓度下黄斑篮子鱼幼鱼的入麻时间、复苏时间及麻醉时呼吸频率

同一指标下，标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05)，标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05)

Figure  2.  Anesthesia time, recovery time and respiratory rate of juvenile S. oramin at different eugenol concentrations

Values with different letters for the same index are significantly different (P<0.05), while those with the same letters are not significantly different (P>0.05).

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2.4   空气中暴露时间对黄斑篮子鱼幼鱼复苏的影响

在30 mg·L^–1的丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼在(141.8±23.2) s后均能进入4期麻醉。空气中暴露时间对黄斑篮子鱼幼鱼复苏的实验结果见图3，在空气中暴露时间小于8 min时，复苏时间随着在空气中暴露时间的增加而减少；而大于8 min后，复苏时间随空气中暴露时间的延长而增加；在空气中暴露时间为8 min时复苏时间最短。当在空气中暴露时间小于6 min时，复苏率为100%；超过8 min后，复苏率逐渐下降；在空气中暴露12 min、14 min、16 min和18 min的复苏率分别为86.7%、73.3%、60%和26.7%。

图  3  空气中暴露时间对黄斑篮子鱼幼鱼复苏时间和复苏率的影响

Figure  3.  Effect of air exposure time on recovery time and recovery rate of juvenile S. oramin

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2.5   丁香酚麻醉对黄斑篮子鱼幼鱼呼吸频率的影响

黄斑篮子鱼幼鱼在不同浓度丁香酚溶液中的呼吸频率见图4。在10 mg·L^–1、20 mg·L^–1、30 mg·L^–1等低浓度丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼的呼吸频率先略微下降至对照组水平以下，之后保持稳定，其中在10 mg·L^–1和20 mg·L^–1下处于镇静期，30 mg·L^–1下处于麻醉期。在40 mg·L^–1丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼的呼吸频率在20 s内从320次·min^–1下降至180~200次·min^–1并在3 min内基本维持稳定，之后再次下降直到5 min时停止呼吸。而在60 mg·L^–1丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼的呼吸频率同样在20 s内从320次·min^–1下降至180~200次·min^–1，但只维持1 min后再次下降直到1 min 30 s时呼吸停止。当质量浓度为80 mg·L^–1和100 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼在1 min 30 s以内均停止呼吸。在10 mg·L^–1丁香酚溶液中，黄斑篮子鱼幼鱼在20 s内呼吸频率下降比20 mg·L^–1丁香酚溶液中更快，并在1 min 30 s内基本维持在250~270次·min^–1，之后上升到略微低于对照组水平；当丁香酚质量浓度为80 mg·L^–1和100 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼呼吸频率在停止呼吸前持续明显下降，直到40 s和1 min时呼吸停止。

图  4  不同丁香酚浓度对黄斑篮子鱼幼鱼呼吸频率的影响

Figure  4.  Effect of different eugenol mass concentrations on respiratory rate of juvenile S. oramin

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3.   讨论

3.1   丁香酚麻醉黄斑篮子鱼幼鱼的有效浓度

丁香酚作为一种鱼类麻醉剂，其作用机制是鱼体通过鳃丝或体表摄入后，首先抑制脑皮质，导致触觉丧失，鱼体麻木，再作用于基底神经节与小脑，最后作用于脊髓，全身麻醉，鱼体进入深度镇静，呼吸平缓，鳃盖张合减慢^[16]。国内外学者对鱼类有效麻醉浓度的定义相对统一，即理想的麻醉浓度应使实验鱼在3 min内进入4期麻醉，且5 min内完全复苏，存活率为100%^[12-23]。本实验结果表明，丁香酚对黄斑篮子鱼幼鱼有较好的麻醉效果，具有入麻快、复苏时间短、复苏率高等优点。在水温(29.3±1.1) ℃时，丁香酚对体质量为(4.83±1.30) g的黄斑篮子鱼幼鱼的有效浓度为30 mg·L^–1。通过对比丁香酚麻醉不同鱼种的有效浓度(表2)可知，丁香酚在不同鱼种、不同水温和不同规格条件下的有效浓度存在较大差异，本研究中得出的丁香酚麻醉黄斑篮子鱼幼鱼的有效浓度(30 mg·L^–1)处于中等水平，高于斑点叉尾鮰^[16]、斑马鱼^[17]、锦鲤^[21]和神仙鱼^[25]等，低于大西洋鲑^[18]、俄罗斯鲟^[19]、鲫^[20]、罗非鱼^[22]、翘嘴鲌^[23]和A. labiatus × A. trimaculatus^[26]等。

表  2  不同实验鱼种的丁香酚有效质量浓度

Table  2.  Effective mass concentration of eugenol on different test fish

鱼种 fish species	水温/℃ water temperature	规格 specification	质量浓度/mg·L–1 mass concentration	文献 Reference
斑点叉尾鮰 I. punctaus	22±0.5	幼鱼，体质量 (3.2±1.5) g	12~27	[16]
斑马鱼 D. rerio	28±1	幼鱼，体质量 (0.36±0.03) g	20	[17]
大西洋鲑 S. salar	14	成鱼，体质量 80~1 00 g	50	[18]
俄罗斯鲟 A. gueldenstaedti	20±0.5	幼鱼和成鱼，体质量 30~7 680 g	100.82	[19]
鲫 C. auratus	28	成鱼，体质量 (130±10) g	40	[20]
锦鲤 C. carpio	18~20	幼鱼，体质量 (35±5) g	15-20	[21]
罗非鱼 T. mossambica	23~25	幼鱼和成鱼，体质量 2.7~487 g	45	[22]
翘嘴鲌 C. alburnus	24	幼鱼，体质量 30 g	40~60	[23]
神仙鱼 P. scalare	25.1±1.4	幼鱼和成鱼，体质量 1~10 g	5.5	[25]
A. labiatus × A. trimaculatus	28±1	幼鱼和成鱼，体质量 12~53 g	50	[26]
黄斑篮子鱼 S. oramin	29.3±1.1	幼鱼，体质量 (4.83±1.30) g	30	本研究

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丁香酚质量浓度低于80 mg·L^–1时，进入4期麻醉后的黄斑篮子鱼幼鱼的复苏时间随丁香酚浓度增大而延长，呼吸频率反之；而当丁香酚质量浓度为100 mg·L^–1时，复苏时间反而降低，对应的呼吸频率增加。笔者认为，造成该结果的原因是当黄斑篮子鱼幼鱼处于高浓度的丁香酚溶液中时，丁香酚能在更短时间内作用到鱼体中枢神经系统，很快进入麻醉状态，但由于时间短，进入体内的麻醉剂量相对少，所以复苏过程需要代谢的丁香酚的量相对更少，鱼体更容易复苏。本实验结果也显示当丁香酚质量浓度大于80 mg·L^–1时，黄斑篮子鱼幼鱼的入麻时间短，不及时取出并复苏将对鱼体造成伤害；因此，实际生产中建议黄斑篮子鱼幼鱼的丁香酚麻醉质量浓度不宜超过80 mg·L^–1。

3.2   空气中暴露时间对黄斑篮子鱼幼鱼复苏的影响

在鱼类运输、人工繁殖、标记放流等人工操作时，常需将鱼体短时间暴露在空气中，为降低鱼的应激反应，操作前对其进行麻醉是有效且常用的方法。本实验结果表明，空气中暴露时间小于8 min时，黄斑篮子鱼幼鱼复苏时间随在空气中暴露时间的增加而下降；而当空气中暴露时间大于8 min时，复苏时间随空气中暴露时间的延长而增加；在空气中暴露时间为8 min时复苏时间最短。在丁香酚深度麻醉鲫鱼^[20]和麻醉翘嘴鲌^[23]的研究中，复苏时间随空气中暴露时间的增加而减少，而在丁香酚深度麻醉大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)^[27]的研究中，复苏时间随空气中暴露时间的增加而延长。本实验结果与MS-222深度麻醉赤眼鳟(Squaliobarbus curriculus)^[28]幼鱼的研究结果相似，即复苏时间先随空气中暴露时间的增加而减少，达到某个时间点后又随着空气中暴露时间的增加而延长。笔者认为这是当黄斑篮子鱼幼鱼暴露在空气中后，鱼体不再继续富集丁香酚，同时，丁香酚及其代谢物在机体内迅速代谢^[29]，实际上已经进入了复苏期，体表和鳃部有水，鱼体呼吸部分恢复，因而在暴露前期，复苏时间逐渐减少；随着在空气中暴露时间的增加，黄斑篮子鱼幼鱼麻醉程度逐渐降低，运动能力和耗氧量逐渐增加，而体表和鳃部的水中溶氧逐渐被消耗，实验鱼出现缺氧休克，因此，后期复苏时间逐渐增加，死亡率逐渐升高。

本实验结果表明，当丁香酚质量浓度为30 mg·L^–1时，空气中暴露6 min以内复苏率为100%。因此，丁香酚麻醉的黄斑篮子鱼幼鱼离水操作不宜超过6 min。

3.3   丁香酚对黄斑篮子鱼幼鱼呼吸频率的影响

一般情况下，较高的呼吸频率表示鱼体的麻醉程度低，反之则表示麻醉程度高^[28]。本实验结果表明，当丁香酚麻醉浓度低时(10 mg·L^–1、20 mg·L^–1)，黄斑篮子鱼幼鱼的呼吸频率略微下降至对照组水平以下，之后停留在镇静期，呼吸频率保持稳定。当丁香酚麻醉浓度较高时(30 mg·L^–1、40 mg·L^–1、60 mg·L^–1、80 mg·L^–1、100 mg·L^–1)，黄斑篮子鱼幼鱼的呼吸频率在20 s内迅速下降，且丁香酚的浓度越高，下降越快，该结果与MS-222麻醉赤眼鳟幼鱼^[28]的研究结果类似，笔者认为可能原因为当丁香酚浓度高时，实验鱼在单位时间内通过鳃部和体表摄入的丁香酚更多，抑制鱼体中枢神经系统的速度更快，因此加快了呼吸频率的下降。本研究中，黄斑篮子鱼幼鱼在10 mg·L^–1、20 mg·L^–1的丁香酚溶液中的呼吸频率在一定时间后维持一定量的小幅波动，原因可能为鱼体对丁香酚的代谢速度和吸入速度达到一个相对平衡。