Simulation of automatic pneumatic conveying process of automatic feeding system based on computational fluid dynamics-discrete element method
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摘要:
针对深水网箱自动投饵系统颗粒饲料气力输送时易阻塞与破损的问题，为揭示自动投饵系统中颗粒饲料的气力输送运动特性，开展了管道颗粒饲料气固两相流的数值模拟研究。基于气固两相流理论，分别建立了计算流体模型与离散元模型，通过计算流体力学与离散单元法(computational fluid dynamics-discrete element method, CFD-EDM)耦合求解，对饲料颗粒从气力输送管道初始阶段到稳定阶段的运动过程进行了分析，得到颗粒从初始状态到运动稳定阶段的颗粒位置分布情况。对不同位置管道内压力进行了分析对比，得到从管道入口到颗粒运动稳定状态时刻的压降。模拟仿真结果为自动投饵装备的模拟仿真与优化设计提供了参考，使其可以对饲料颗粒运动有更好的导向性，更好地降低弯管处颗粒碰撞的能量损失。
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关键词:
- 饲料颗粒 /
- 流体力学与离散单元法 (CFD-EDM) /
- 自动投饵 /
- 耦合仿真
Abstract:During the pneumatic conveying process of automatic feeding systems for deep-water off-shore cage culture, blockages of pipeline and damage to feed pellets occur easily. To reveal the pneumatic transport characteristics of pellet feed in automatic feeding system, a numerical simulation of gas-solid two-phase flow of feed pellets in a pipeline was carried out. Based on gas-solid two-phase flow theory, both a computational fluid dynamics (CFD) model and discrete element model were established. The movement process of feed particles from initial stage to stable stage of pneumatic conveying pipeline was analyzed, and the position distribution of feed particles from initial stage to stable stage was obtained. Pressures at various locations in the pipeline were analyzed and compared to determine the pressure drop between the pipeline inlet and the instant at which the flow reached the steady state. The results provide references for the simulation and optimization design of automatic baiting equipment, which can better guide the movement of feed particles and reduce the collision energy loss of particles at elbow.
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由于内源性生物钟的存在，生物体在生理、行为和基因表达方面都表现出节律性变化，并且这些生物活动与24 h的光暗周期同步[1]。生物钟系统由三部分组成，首先识别外信号，主要为光信号，信号传输至大脑转为神经信号，从而指挥由生物钟基因和功能蛋白组成的核心振荡器，产生昼夜性分子节律，最后分子节律转换成生理节律和行为节律，调控生物体的睡眠-苏醒循环、体温波动、激素涨落、识别及记忆能力变化等机体活动[2]。
昼夜节律生物钟包括主生物钟和外周生物钟，主生物钟位于中枢部位，外周生物钟位于心脏、肾脏、肝脏骨骼肌等组织细胞内。主生物钟作为中枢昼夜振荡器调节生物体的行为节律，并协调外周组织中振荡器的节律活动。果蝇的中枢生物钟细胞位于下丘脑的外侧神经元中[3]。哺乳动物的核心振荡器位于下丘脑视交叉上核[4]，鸟类和部分鱼类的位于松果体内[5-6]。生物钟基因对于各生物体昼夜节律的发生必不可少，其表达决定于转录和翻译过程的分子振荡，并形成自我调节的反馈环路，因而被认为是组成昼夜节律钟机制的核心元件。生物钟基因在许多物种中都是高度保守的，目前研究所知的生物钟基因主要有Clock、Cry1、Cry2、Cry1a、Per1、Per2、Per3、Bmal1、Npas2、Npas4、Timeless等，其中在脊椎动物主生物钟环路中Clock与Bmal为正调节因子，Per与Cry为负调节因子。Clock或Npas2与Bmal结合形成异质二聚体再与启动子上含E-box反应元件的生物钟基因结合，如Per和Cry基因家族，激活生物钟基因Per和Cry的转录，累积的Per和Cry的蛋白与酪蛋白激酶形成复合体，该复合体磷酸化后可阻断异质二聚体与E-box反应元件结合从而抑制基因转录，形成负反馈转录回路[7]。主生物钟可通过自主神经系统或体液介质调节外周生物钟使外周生物钟与主生物钟同步[8-9]，共同维持一个近24 h的震荡节律。
生物体可以预知光信号的季节性变化并使生命活动与之同步，光周期是调控季节性繁殖动物繁殖的主要环境因素，而光信号作为生物钟系统输入途径最主要的环境信号，对生物钟的调控起到重要作用，主生物钟在接收光信号后会传递至下丘脑，调节下丘脑-垂体-肾上腺轴 (HPA轴) 释放激素，维持昼夜节律性[10]。HPA轴也会以交互抑制的方式影响生物钟系统的活动与节律[11]，因此垂体和下丘脑与生物钟调控密不可分。
花鲈 (Lateolabrax maculatus) 具有适温范围广、适盐性强、肉质鲜美、经济效益高等特点，是中国重要的水产养殖品种。花鲈属短日照季节性繁殖鱼类，研究花鲈长短光照的昼夜节律可以了解其生活习性、繁殖规律等生理活动，从而优化养殖方法，提高经济效益。
本实验通过对花鲈3种光周期：长光照 (16 h光照8 h黑暗，16L∶8D)、短光照 (8L∶16D) 和12 h光照12 h黑暗 (12L∶12D) 的处理，检测花鲈重要生物钟基因Bmal2、Npas4、Per2、Cry1、Cry2、Cry1a、Timeless在垂体和下丘脑中的表达水平，初步探讨了花鲈昼夜生理规律。
1. 材料与方法
1.1 实验样品采集及处理
实验花鲈取自中国水产科学研究院南海水产研究所珠海斗门基地。花鲈养殖水温保持在 (26±2) ℃，所用的海水盐度为10，鱼体质量为 (1 450±80) g，养殖池每天更换1/3的海水并定时清除池内的鱼类代谢物及残渣。分为16L∶8D、8L∶16D和12L∶12D 3组，处理时间为2周。2周后采集实验鱼，在实验开始前24 h停止喂食，样品采集在一昼夜内进行，每隔3 h采集1次，9个采集时间点为6:00、9:00、12:00、15:00、18:00、21:00、24:00、次日3:00、次日6:00，分别对应授权时间 (Zeitgeber Time, ZT) ZT0、ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24。在每组中随机挑选体质健康、无损伤的3条鱼进行解剖，取下丘脑和垂体组织样品迅速存放于液氮中，随后转移至−80 ℃冰箱保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 总RNA提取
采用Trizol法提取下丘脑和垂体的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳以检测RNA的完整性，并通过超微量核酸定量分析系统检测RNA纯度和浓度。
1.2.2 cDNA合成
使用TaKaRa公司的PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒合成cDNA定量模板。第一步反应体积10 µL，反应程序为42 ℃，2 min；第二步反应体积20 µL，反应程序为37 ℃，60 min；85 ℃，5 s；−80 ℃保存备用。
1.2.3 引物设计
利用本课题组已构建的花鲈转录组数据库筛选出Bmal2、Npas4、Per2、Cry1、Cry2、Cry1a、Timeless的EST序列，通过Beacon Designer 7.0软件设计巢式PCR引物克隆验证基因，使用Beacon Designer 7.0软件设计荧光定量特异性引物 (表1)，通过检测定量引物的扩增效率介于95%~105%，内参基因选择花鲈β-actin。
表 1 荧光定量引物Table 1. Primers for qRT-PCR引物名称
Primer name序列 (5'–3')
SequenceqBmal2-F TCTGAAAGTACAGGCGAGCCGTCCCA qBmal2-R CAGTGTAAGTCATCAAAGTCCCCAGT qPer2-F CCCCACCGTCCTTCAG qPer2-R TCCCATTCAGCCGCATTA qNpas4-F GTCATCTCCTGTGTCCTCTTGCT qNpas4-R ACTTCCACTCCCATCTTTGTG qCry1-F GACTGGGCTCTGAATGCTGGAA qCry1-R TGCCTGCTGAATACTGCGTGGAG qCry1a-F CAAAGCAGTATGGGCAGGT qCry1a-R AGTAGAAGAGCCGACAGGAGA qCry2-F GTCAATGCTGGCAGTTGGATGTGG qCry2-R GGGATGTAACGCCTGATGTATTCT qTimeless-F GAAACCAGACAGCCTCACTCCTAC qTimeless-R AAAGACTCCGACAACTGAAACCCT qβ-actin-F CAACTGGGATGACATGGAGAAG qβ-actin-R TTGGCTTTGGGGTTCAGG 1.2.4 荧光定量PCR
使用Roche Light Cycler 480Ⅱ实时定量PCR仪进行qRT-PCR反应，总反应体积为12.5 µL，反应体系为上下引物各0.5 µL、1.5 µL cDNA、6.25 µL SYBRⅡPremix Ex Taq、3.75 µL ddH2O。反应程序为95 ℃，30 s；95 ℃ ，5 s；62 ℃，40 s；42个循环；溶解曲线为95 ℃，1 s；65 ℃，5 s。每个cDNA样本和内部参数均设置3个重复。
1.2.5 数据处理
使用2–ΔΔCt法计算目的基因的表达量，结果以“平均值±标准差 (
$ \overline X \pm {\rm{SD}}$ ) ”表示。用SPSS 22.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，时间差异显著性结果表示为P<0.05。用Matlab软件进行余弦分析，拟合余弦方程为f (t) =M+Acos (tπ/12−φ)；其中f(t) 是指时间对应的基因表达水平；M为波动变化的中线称为中值；A为振幅；φ为峰值相位，是震荡达到峰值的时刻[12] (表2，表3)。表 2 花鲈垂体中生物钟基因mRNA表达的昼夜节律性参数Table 2. Circadian rhythmic parameters of clock genes mRNA expressions in pituitary of L. maculatus基因
Gene光周期
Photoperiod振幅
Amplitude峰值相位
Acrophase中值
MesorP Bmal2 16L∶8D 0.471 12L∶12D − − − 0.416 8L∶16D 0.200 Naps4 16L∶8D 0.070 12L∶12D − − − 0.274 8L∶16D 0.286 Per2 16L∶8D 41.084 1 −18.890 5 43.894 7 <0.001 12L∶12D 0.253 6 0.226 6 0.187 7 <0.001 8L∶16D 0.371 2 −0.366 8 0.452 4 0.001 Cry1 16L∶8D 0.951 9 9.299 7 1.390 5 <0.001 12L∶12D 1.314 0 0.420 3 1.455 6 <0.001 8L∶16D 1.165 7 10.981 0 1.647 0 <0.001 Cryla 16L∶8D 0.364 2 6.375 6 1.577 3 0.002 12L∶12D 0.498 9 0.568 9 0.648 5 <0.001 8L∶16D 0.238 8 −7.008 3 1.027 7 <0.001 Cry2 16L∶8D 47.911 9 0.018 2 31.143 5 <0.001 12L∶12D 3.106 3 15.143 0 2.599 7 <0.001 8L∶16D 29.750 8 −16.533 1 34.491 7 <0.001 Timeless 16L∶8D 0.354 5 −4.266 8 0.860 5 <0.001 12L∶12D 3.368 8 −1.157 9 2.785 8 <0.001 8L∶16D 1.264 4 10.797 5 2.447 2 <0.001 注：振幅为拟合波形峰值之间距离的一半；中值为周期平均值；峰值为相位周期最高幅度的时间点 (弧度)；P为时间点间的差异；后表同此 Note: The amplitude is half of the distance between the peak values of the fitting waveform; the median value is the periodic average value; the peak value is the time point (radian) with the highest amplitude of phase period; P is the difference between time points; the same case in the following table. 表 3 花鲈下丘脑中生物钟基因mRNA表达的昼夜节律性参数Table 3. Circadian rhythmic parameters of clock genes mRNA expressions in hypothalamus of L. maculatus基因
Gene处理组
Photoperiod振幅
Amplitude峰值相位
Acrophase中值
MesorP Bmal2 16L∶8D 0.469 12L∶12D − − − 0.060 8L∶16D 0.260 Naps4 16L∶8D 0.762 12L∶12D − − − 0.166 8L∶16D 0.095 Per2 16L∶8D 0.472 1 −8.423 1 0.808 7 0.018 12L∶12D 2.773 3 −8.478 7 3.971 5 0.001 8L∶16D 0.896 2 −11.462 8 1.088 0 0.004 Cry1 16L∶8D 0.436 6 −5.273 3 1.408 4 0.006 12L∶12D 0.378 3 0.461 1 1.654 0 0.007 8L∶16D 1.741 5 −0.099 9 1.554 6 <0.001 Cryla 16L∶8D 0.096 4 −1.274 2 0.876 5 0.047 12L∶12D 1.000 0 1.436 0 0.000 3 0.017 8L∶16D 1.038 8 −9.228 1 1.978 6 <0.001 Cry2 16L∶8D 44.338 7 7.936 4 24.514 2 <0.001 12L∶12D 2.681 0 8.881 4 4.563 0 <0.001 8L∶16D 6.819 8 8.026 9 4.909 8 <0.001 Timeless 16L∶8D 9.888 2 −4.951 6.863 4 <0.001 12L∶12D 2.955 7 9.236 6 3.071 5 <0.001 8L∶16D 78.572 9 −6.378 3 45.208 1 <0.001 2. 结果
2.1 生物钟基因在花鲈垂体内的昼夜节律
3种光周期条件下，花鲈垂体内各生物钟基因mRNA表达结果显示Per2、Cry1、Cry1a、Cry2、Timeless有显著性时间差异 (P<0.05)，Bmal2、Npas4的时间差异不显著 (P>0.05)。各生物钟基因在垂体中表达的昼夜节律性参数见表2，余弦分析拟合结果见图1。Per2在12L∶12D下有明显节律性，其表达在光亮时达高峰，在光灭时至低谷；在8L∶16D下其节律明显，表达呈先降后升的趋势；在16L∶8D下无明显节律性。Cry1、Cry1a、Cry2作为同源基因在12L∶12D下均表现出明显节律性，其中Cry1、Cry1a表达在早晨达高峰，傍晚至低谷；Cry2表达呈先升后降的趋势，在ZT9—ZT12达高峰。Cry1在16L∶8D下节律变化为先升后降，在8L∶16D下于ZT6左右达高峰。Cry1a在16L∶8D下无明显节律，与12L∶12D相比，8L∶16D下相位左移，于ZT21左右达高峰。Cry2在16L∶8D和8L∶16D下无明显昼夜节律性。Timeless基因在12L∶12D下表现出明显节律性，表达高峰介于ZT6—ZT9，而在16L∶8D和8L∶16D下未表现出明显昼夜节律性 (图1)。
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图 1 3种光周期下花鲈垂体中生物钟基因mRNA昼夜节律表达的时间模式每个点的值代表每个生物钟基因的表达水平，采用“平均值±标准差”表示 (n=3)；不同字母表示显著性差异 (P<0.05)；虚线表示由余弦分析计算出的基因昼夜节律表达余弦函数，图上方条状图表示光周期，白色代表光照，黑色代表黑暗；后图同此Figure 1. Relative expression of clock genes in pituitary of L. maculatus under three photoperiod conditionsThe values are $ \overline X \pm {\rm{SD}} $ (n=3) of the normalized transcript levels of each clock gene. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05). The broken line is the periodic sinusoidal function of gene expression in a circadian cycle constructed from the periodicity parameters. The photoperiod regime is represented by composite block above the graph. White and black represent the light and dark phase, respectively; the same case in the following figure.2.2 生物钟基因在花鲈下丘脑内的昼夜节律
3种光周期条件下，花鲈下丘脑内各生物钟基因mRNA表达结果显示Per2、Cry1、Cry1a、Cry2、Timeless有显著性时间差异 (P<0.05)，Bmal2、Npas4的时间差异不显著 (P>0.05)。下丘脑中Per2在3种光周期下的表达趋势相似，但在12L∶12D下昼夜节律表现出明显的昼低夜高的节律性振荡。Cry1在16L∶8D和8L∶16D下表现无节律性，在12L∶12D下先降后升，峰值出现在清晨。Cry1a在16L∶8D与12L∶12D下无明显节律性，在8L∶16D下节律变化为先降后升，于清晨达到高峰。Cry2在3种光周期下表达趋势相似，均在下午达高峰。Timeless在12L∶12D下节律性变化为先升后降，在16L∶8D下表达于凌晨至高峰，在8L∶16D下则无昼夜节律性 (图2)。
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图 2 3种光周期下花鲈下丘脑中生物钟基因mRNA昼夜节律表达的时间模式Figure 2. Relative expression of clock genes in hypothalamus of L. maculatus under three photoperiod conditions3. 讨论
本实验研究了花鲈在不同光周期条件下生物钟基因在垂体和下丘脑中的表达规律。在12L∶12D条件下，垂体中Per2、Cry1、Cry2、Cry1a、Timeless均有明显的昼夜节律震荡，而在下丘脑中Cry1、Cry1a则无明显节律性震荡。Per2、Cry1、Cry2、Cry1a、Timeless基因在垂体和下丘脑中的表达高峰数值相近，每个基因在垂体和下丘脑中的表达量相近。12L∶12D条件下垂体中的Per2基因表达在光亮时刻达到高峰，而下丘脑中是在光灭时达到高峰。大西洋鲑 (Salmo salar) 松果体中Per2基因在夜晚达到高峰[13]；大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 在正常光照下下丘脑中Per2、Cry1的表达为昼高夜低[14]；小鼠 (Mus musculus) Per2在视交叉上核表达为昼高夜低，在光灭时刻达高峰[15]，与花鲈下丘脑中的表达规律一致。斑马鱼 (Danio rerio) Per2基因在早晨表达量最高，即在光亮时达到高峰[16]，与花鲈垂体中的表达规律一致，Per2在垂体和下丘脑中的表达可能并不平行。Cry2在垂体和下丘脑中的昼夜节律变化一致，均呈现昼高夜低的趋势，Cry2在金鱼 (Carassius auratus) 视网膜[17]、大西洋鲑脑[18]和斑马鱼幼体[19]的表达均在黎明达到高峰。Cry1、Cry1a作为同源基因在垂体中表达的昼夜节律规律相似，但两者在下丘脑中的表达无昼夜节律性，这可能是因为生物钟基因的相互调控并不依赖于Cry1、Cry1a在下丘脑中的表达。Timeless是最先发现的两个生物钟基因之一，它对生物节律的影响与Per基因相似，在垂体中Timeless的表达呈现昼高夜低，在下丘脑中光灭时达到高峰，这与斑马鱼胚胎的表达趋势相同。
不同光周期下基因表达趋势不同，在垂体中，Per2在8L∶16D下与12L∶12D下相比相位发生改变，震荡更强烈，而在16L∶8D下失去昼夜节律性。Cry1的表达，与12L∶12D条件相比，在8L∶16D下到达高峰的时间较晚，而在16L∶8D下达到高峰的时间最晚，但3种周期的震荡高峰都在光亮时间。在小鼠脑中，与短光周期相比，长光周期下Per1升高持续时间更长，在长短光周期中均表现为昼高夜低，Cry1在长短光周期中均表现为昼低夜高[20]。花鲈垂体中Cry1a在16L∶8D下失去节律性，Cry2在8L∶16D、16L∶8D下也失去节律性，Timeless在8L∶16D和16L∶8D下均失去昼夜节律性。同样在大西洋鲑鱼脑中持续的光照会使Per1-like、Cry2、clock、Per2基因均失去节律性。而在尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 的视顶盖中Per1b、Cry2a在持续光照下节律趋势不变[21]，日本鹌鹑 (Coturnix coturnix japonica) 下丘脑内Per2、Cry1在长短光周期下的节律趋势相似[22]，说明不同物种光周期影响基因表达节律的相位、波形和振幅以及它们之间的相位关系。在下丘脑中Per2 在3种光周期下的昼夜节律趋势相同，但8L∶16D、16L∶8D均比12L∶12D下的震荡弱。Cry1在8L∶16D、16L∶8D 下均无明显的昼夜节律，Cry1a在12L∶12D和16L∶8D下均无昼夜节律性，表明下丘脑可能不是Cry1、Cry1a基因发挥作用的主要组织。Cry2在8L∶16D和16L∶8D下昼夜节律趋势基本相同，而12L∶12D与其峰值相位不同。Timeless在16L∶8D下表达高峰在黑暗时间，在12L∶12D下表达高峰在光亮时间且节律震荡更强烈。峰值时间的变化可能意味着不同物种、器官在不同光周期下，生物钟基因表达有不同的响应。
本研究对3种光周期处理后的花鲈重要生物钟基因Bmal2、Npas4、Per2、Cry1、Cry2、Cry1a、Timeless在垂体和下丘脑中的表达水平进行了初步分析，结果表明在正常光照下垂体中Per2、Cry1、Cry2、Cry1a、Timeless表现出昼夜节律性，在下丘脑中Per2、Cry2、Cry1、Timeless表现出昼夜节律性，相同基因在垂体和下丘脑两种组织中的昼夜节律不同，因此花鲈垂体和下丘脑可能有自己独立的昼夜节律。在体外，环境信号似乎可以将所有细胞组织昼夜节律设置成相同的相位；但在体内，各种荷尔蒙、神经信号会对节律进行调整，产生组织特有的节律相位[23]。与哺乳动物不同，鱼类细胞可以直接进行光响应，不需要眼睛和松果体，因此在大脑、松果体、心脏、肝脏等组织中都有独立的昼夜节律，他们可以独立通过光响应同步，也可以相互作用[10, 24-25]。本实验中，长光照或短光照均会改变花鲈垂体和下丘脑中昼夜节律震荡强弱，也会改变峰值相位，部分基因在长光照或短光照下会出现失去昼夜节律性的现象。本研究结果可为花鲈生物钟相关研究提供基础资料。
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图 1 自动投饵系统装备原理结构图
Figure 1. Principle and structure diagram of automatic feeding system
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图 7 饲料颗粒不同运动段形态分布
Figure 7. Morphological distribution of feed particles at different motion stages
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图 8 颗粒运动不同距离处管道截面总压云
Figure 8. Total pressure cloud of pipe cross section at different distance of particle movement
表 1 EDEM中物料属性及接触参数
Table 1 Material properties and contact parameters in EDEM
名称
name参数
parameter数值
volume物料 material 泊松比 0.4 剪切模量/Pa 1×108 密度/kg·m–3 390 壳体 shell 泊松比 0.3 剪切模量/Pa 7.0×1010 密度/kg·m–3 7 800 物料-物料 materiel-materiel 恢复系数 0.2 静摩擦系数 0.6 动摩擦系数 0.01 物料-壳体 materiel-shell 恢复系数 0.15 静摩擦系数 0.3 动摩擦系数 0.01 
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