Preliminary study of antibacterial effects of fish anesthetic eugenol on Vibrio anguillarum
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摘要:
水产麻醉剂丁香酚具有良好的抑菌和杀菌作用，不仅对食源性致病菌具有良好的抑制作用，也对水产致病菌具有潜在的抑菌效力。为探讨丁香酚对水产养殖业主要致病菌的抑菌作用，文章初步开展了丁香酚对鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的抑菌效果研究。丁香酚质量浓度为6 400 μg·mL–1时，鳗弧菌培养平板中抑菌圈直径为(21.13±0.74) mm，表明鳗弧菌对此浓度的丁香酚表现为极敏。吸光度测定结果显示微孔中丁香酚质量浓度≥400 μg·mL–1时弧菌没有生长，表明丁香酚对鳗弧菌的最低抑菌浓度(MIC)为400 μg·mL–1。取400 μg·mL–1、800 μg·mL–1和1 600 μg·mL–1微孔中溶液涂抹于培养平板继续培养24 h，质量浓度≥800 μg·mL–1时鳗弧菌没有生长，表明最小杀菌浓度(MBC)为800 μg·mL–1。研究结果表明丁香酚对鳗弧菌具有良好的抑菌作用。
Abstract:Fish anesthetic eugenol, which has good antibacterial and bactericidal effects, has presented great efficacy on the food borne pathogens as well as the pathogenic bacteria in aquaculture. In order to investigate the antibacterial effect of eugenol on the typical pathogenic bacteria in aquaculture, we studied the antibacterial effect of eugenol on Vibrio anguillarum. After 24-hour incubation, the diameter of the inhibition zone was (21.13±0.74) mm at 6 400 μg·mL–1 of eugenol, indicating that V. anguillarum was extremely sensitive to eugenol. It is shown that V. anguillarum did not grow while the eugenol concentration was over 400 μg·mL–1. Hence, the minimum inhibitory concentration (MIC) was 400 μg·mL–1 of eugenol against the bacteria. The solution in the cells of 400 μg·mL–1, 800 μg·mL–1 and 1 600 μg·mL–1 were continually incubated for 24 h after being scribbled on the plate surface. When the concentration of eugenol were over 800 μg·mL–1, no V. anguillarum grew in the plates. It is indicated that the minimum bactericidal concentration (MBC) of eugenol against V. anguillarum was 800 μg·mL–1, and eugenol has excellent antibacterial effects on V. anguillarum.
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罗非鱼(Oreochromis mossambicus)，又称非洲鲫鱼、福寿鱼，绝大多数生活在淡水域，也可在海水中生存[1]。罗非鱼肉质爽口、肌间刺较少且富含蛋白质，同时具有繁殖迅速、易于养殖等特点[2]。中国是全球最大的罗非鱼生产国与出口国，也是美国最大的罗非鱼进口国，向美国的罗非鱼出口产品中，冻罗非鱼片制品所占比例较大，2015年和2016年冻罗非鱼片在美国市场的占有率分别为62.27%和58.44%[3]。
罗非鱼片的色泽直接影响消费者的购买欲望，鱼片红色肉在贮藏过程中由于氧化作用逐渐褐变，从而严重影响了鱼片的感官。目前罗非鱼加工行业通常使用的发色方法有一氧化碳(CO)发色、一氧化氮(NO)发色、亚硝酸盐发色、复合剂发色等。王晶等[4]通过亚硝酸盐与其他试剂复配处理可以使罗非鱼片色泽鲜艳，亚硝酸盐是国标内允许使用的食品添加剂，且能够杀死肉毒菌[5]，可与肌红蛋白形成稳定的MbNO，从而维持红色，前人多从降低亚硝酸盐的角度进行研究[6-8]；碳酸氢钠在食品中常被用作酸度调节剂及保水剂，是一种安全无毒的食品添加剂，用途广泛且价格低廉，Shun等[9]使用碳酸氢钠处理牛肉，发现能够提高牛肉色泽，但目前尚无碳酸氢钠用于罗非鱼片发色方面的研究。CO对罗非鱼片进行发色的方式有气体发色和活体发色[10]。CO的发色机理是通过配位键与肌肉中的肌红蛋白卟啉环结合，生成的碳氧肌红蛋白性质稳定不被氧气氧化，使得罗非鱼片的鲜红色泽能够长时间保持，但CO发色的安全性一直饱受争议，且中国与欧盟都禁止CO用于食品发色[11-12]，因此，更加安全的发色替代技术是当下的研究热点。
鉴于传统发色技术的应用限制，本研究以新鲜罗非鱼片为原料，探讨以亚硝酸钠和碳酸氢钠组成的新发色剂对罗非鱼片发色的效果，以期为新发色技术在罗非鱼乃至其他水产品加工的应用方面提供基础理论数据和参考。
1. 材料与方法
1.1 材料与仪器
新鲜罗非鱼购自广州市海珠区新港西路华润万家客村店，单尾质量500~750 g。
碳酸氢钠、亚硝酸钠等试剂购自国药集团化学试剂有限公司，所用试剂均为分析纯。
仪器为KONICA MINOLTA CR-400色差计(日本)；JJ50电子天平(常熟市双杰测试仪器厂)；Mettler GB204分析天平(瑞士)；DZ500/2D真空包装机(温州市新泰包装机械厂)。
1.2 实验方法
1.2.1 去皮罗非鱼片的制备
取规格、质量相近且同一品种的新鲜罗非鱼[(500±50) g]，在常温条件下放置在水箱中暂养30 min后取出，将鱼击晕后放血，沿鱼的背脊处裁切，取得背部鱼片，单片厚度2.5~3.0 cm。随后将鱼片进行清洗以去除血污，沿鱼片红色肉为中心轴裁切得到12 cm×6 cm左右的矩形鱼片，单只鱼片净质量为(50±2) g。
1.2.2 单因素条件对新发色剂发色效果的影响
1) 亚硝酸钠质量浓度对发色效果的影响。分别以0.15 g·L–1、0.25 g·L–1、0.35 g·L–1、0.45 g·L–1、0.50 g·L–1的亚硝酸钠溶液作为发色剂，加入3.0 g·L–1的碳酸氢钠溶液，浸泡鱼片20 min，观测亚硝酸钠质量浓度对罗非鱼片红色变化值Δa*的影响。
2) 发色助剂质量浓度对发色效果的影响。分别以1.5 g·L–1、3.0 g·L–1、4.5 g·L–1、6.0 g·L–1、7.5 g·L–1的碳酸氢钠溶液作为复配试剂，加入0.25 g·L–1的亚硝酸钠溶液，浸泡20 min，观测碳酸氢钠质量浓度对Δa*的影响。
3) 浸泡时间的影响。以3.0 g·L–1碳酸氢钠与0.25 g·L–1亚硝酸钠的混合溶液进行实验，分别浸泡10 min、20 min、30 min、40 min、50 min，观测浸泡时间对Δa*的影响。
1.2.3 罗非鱼片红度值的测定
参考Li等[13]的方法略有改动，每块鱼片浸泡前后分别在红色肉中心轴进行红度值a*的测定。测定前用白色和黑色标准板进行标准校正，使用CIE-LAB系统测定鱼片红色肉的红度值a*。每个处理取4片罗非鱼片，每片测定3次，取上述12个测量值的平均值为最后测量值。在实际生产及销售过程中人们更重视罗非鱼片的红色值，并以其作为鱼片新鲜与否的主要判断指标，而色差值Δa*相对于其他指标如白度、亮度等更具代表性，因此，本文以Δa*作为该发色效果的衡量指标，Δa*值即为鱼片发色前后的差值。
$$ \Delta{\rm{a}}^*={\text{鱼片发色后}}{\rm{a}}^*{\text{值}}-{\text{鱼片发色前}}{\rm{a}}^*{\text{值}} $$ 1.2.4 响应面实验设计
在上述实验的基础上，利用软件Design-Expert 10.0中的Box-Behnken进行响应面优化设计，以新发色剂溶液的亚硝酸钠质量浓度、碳酸氢钠质量浓度和浸泡时间为响应变量。以发色后的Δa*为响应值设计响应面实验。实验因素和水平见表1。
表 1 响应面实验设计因素与水平Table 1. Factors and levels used in response surface experiment因素
factor水平 level –1 0 1 碳酸氢钠/g·L−1 (A) sodium bicarbonate 3 4.5 6 亚硝酸钠/g·L−1 (B) sodium nitrite 0.25 0.35 0.45 浸泡时间/min (C) soaking time 10 20 30 1.2.5 亚硝酸盐残留测定
由于使用亚硝酸盐发色后，其残留量也是文章的关注点。参照GB 5009.33—2016的《食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第二法分光光度法略作调整，称取处理后鱼片样品5 g，加入硼砂饱和溶液，搅拌均匀，70 ℃沸水浴提取15 min，冷却后加入亚铁氰化钾溶液、乙酸锌溶液使蛋白质沉淀，加水定容至100 mL，吸取5 mL滤液显色、测定。在波长为538 nm处测其吸光度值，记录数据后计算亚硝酸盐含量。计算公式为：
$$ X = \left[ {\left( {C - {C_0}} \right) \times V \times A \times 1\;000} \right]/\left( {m \times 1\;000} \right) $$ 式中，X为鱼片亚硝酸盐的质量分数(mg·kg−1)；C为测定的质量浓度(μg·mL−1)；C0为空白测定的质量浓度(μg·mL−1)；V为定容体积(mL)；m为取样的鱼片质量(g)；A为稀释倍数；1 000为转换系数。
1.3 数据处理
实验数据利用Excel 2016软件整理，用SPSS 20.0软件分析方差及显著性，数据以“平均值±标准差(
$\overline{X}\pm {\rm SD}$ )”表示，用Design-Expert 10.0软件进行响应面实验设计和结果统计分析，P<0.05为差异显著。2. 结果与讨论
2.1 单因素实验
2.1.1 亚硝酸钠质量浓度对罗非鱼片发色效果的影响
亚硝酸钠质量浓度介于0.15~0.35 g·L–1，罗非鱼片Δa*值随亚硝酸钠质量浓度增加而显著升高(P<0.05)，而当质量浓度大于0.35 g·L–1时，Δa*值的变化不显著(P>0.05，图1)。这可能是因为浸泡初期，肌红蛋白与亚硝酸钠反应产生红色的氮氧肌红蛋白使得鱼片色泽改善，而随着浸泡时间的增加，鱼片表面的肌红蛋白和亚硝酸钠完全反应，不再生成新的MbNO，色泽的变化不明显[14-15]。因此选取亚硝酸钠质量浓度0.35 g·L–1为0水平进行响应面设计实验。
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图 1 不同水平亚硝酸钠处理后鱼片 (红色肉) 的红度值变化不同小写字母表示差异显著，图2、图3、图7同此Figure 1. Change of redness value of fillets (dark muscle) after treatment with different concentrations of sodium nitriteDifferent lowercase letters indicate significant difference. The same case in Fig.2, Fig.3 and Fig.7.2.1.2 碳酸氢钠质量浓度对罗非鱼片发色效果的影响
碳酸氢钠质量浓度介于1.5~4.5 g·L–1，罗非鱼片Δa*值随碳酸氢钠质量浓度的增加而显著上升(P<0.05)，质量浓度大于4.5 g·L–1时，Δa*值变化不显著(P>0.05，图2)；这可能是由于在弱碱条件下能够增强肌红蛋白色氨酸和铁卟啉环的荧光强度，鱼片的色泽有所增强，pH的进一步升高使得高铁肌红蛋白含量上升，其荧光强度迅速衰减[16-18]。因此选取碳酸氢钠质量浓度4.5 g·L–1为0水平进行响应面设计实验。
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图 2 不同水平碳酸氢钠处理后鱼片 (红色肉) 的红度值变化Figure 2. Change of redness value of fillets (dark muscle) after treatment with different concentrations of sodium bicarbonate2.1.3 浸泡时间对罗非鱼片发色效果的影响
浸泡时间介于10~20 min，罗非鱼片Δa*值随浸泡时间延长而显著增加(P<0.05)，而当浸泡时间大于20 min，Δa*值开始出现缓慢下降(图3)；这是由于鱼片经过长时间浸泡，其表面产生MbNO饱和，而水中的氧气使得肌红蛋白被氧化，同时肌肉内外的渗透压不平衡使得红色肉区域的色素分散，鱼片色泽有下降趋势[19-20]。因此选取浸泡时间20 min为0水平进行响应面设计实验。
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图 3 不同浸泡时间处理后的鱼片 (红色肉) 红度值变化Figure 3. Change of redness value of of tilapia fillets (dark muscle) after different soaking time2.2 响应面优化复合发色的条件
2.2.1 实验设计及结果
实验结果见表2，对表中实验数据进行回归拟合，建立新发色剂处理罗非鱼片的工艺参数回归模型。回归方程为：
表 2 响应面法优化实验结果Table 2. Experimental results of Box-Behnken design实验号
test No.碳酸氢钠
sodium bicarbonate亚硝酸钠
sodium nitrite浸泡时间
soaking time红度值Δa*
redness value1 −1 0 −1 0.68 2 0 0 0 1.96 3 0 0 0 1.82 4 0 1 −1 1.75 5 0 0 0 1.69 6 0 0 0 1.82 7 0 1 1 1.98 8 −1 1 0 1.03 9 1 −1 0 0.98 10 0 0 0 1.86 11 1 1 0 1.95 12 −1 −1 0 0.72 13 −1 0 1 0.85 14 0 −1 1 1.23 15 1 0 1 1.36 16 0 −1 −1 0.83 17 1 0 −1 1.12 $$ Y=1.83 + 0.27A+0.37B+0.13C + 0.16AB- 0.55{A^2} - 0.27{C^2} $$ 式中Y为红度值Δa*；A为碳酸氢钠质量浓度(g·L–1)；B为亚硝酸钠质量浓度(g·L–1)；C为浸泡时间(min)。
2.2.2 方差分析
对回归方程进行方差分析及显著性检验(表3)。在响应面方差分析中，该回归模型的显著性水平P<0.000 1，说明模型极显著，而表示模型数据变异情况失拟项的P为0.439，大于0.05，失拟项不显著，说明模型数据比较稳定，可以充分反映实际情况，回归模型较好；由表3可知模型的决定系数R2=0.98，表示模型的实验结果与预测结果较接近，此实验模型的校正系数RAdj=0.95，表明实验的响应值有95%的几率受实验因素的影响，说明实验结果可靠。由表3中F参数可知各因素对Δa*影响的主次顺序为B>A>C，即亚硝酸钠质量浓度对Δa*的影响最大，其次是碳酸氢钠质量浓度，最后是浸泡时间。由方差分析可知3个单因素对响应值影响的显著水平均为P<0.01，表示3种单因素对响应值均具有极显著的影响；AB交互作用对响应值的影响显著(P<0.05)，模型中二次项A2和C2对响应值的影响达到极显著水平(P<0.01)，其他影响均不显著(P>0.05)。
表 3 回归与方差分析结果Table 3. Analysis of variance for fitted regression model方差来源
source of variation平方和
SS自由度
df均方
MSF P Prob>F 显著性
significance模型 model 3.68 9 0.41 41.35 <0.000 1 ** A-碳酸氢钠 sodium bicarbonate 0.57 1 0.57 57.30 0.000 1 ** B-亚硝酸钠 sodium nitrite 1.09 1 1.09 109.92 <0.000 1 ** C-浸泡时间 soaking time 0.14 1 0.14 13.66 0.007 7 ** AB 0.11 1 0.11 11.00 0.012 8 * AC 0.001 1 0.001 0.12 0.735 3 BC 0.007 1 0.007 0.73 0.421 1 A2 1.29 1 1.29 129.87 <0.000 1 ** B2 0.05 1 0.05 4.92 0.062 1 C2 0.32 1 0.32 32.18 0.000 8 ** 残差 residual 0.069 7 0.02 失拟项 lack of fit 0.032 3 0.01 1.12 0.439 1 纯误差 pure error 0.038 4 0.009 总和 cor total 3.75 16 R2=0.98 RAdj=0.95 注：*. P<0.05；**. P<0.01 2.2.3 响应面交互作用分析和优化
采用Design-Expert软件对实验结果进行回归拟合，响应曲面图见图4~图6。响应面呈规则的凸起形表明在实验因素水平范围内存在极大值，即响应面的最高点[21]。从响应面图中可知A、B、C 3个因子对Y有显著的影响作用，这与方差分析的结果也一致。
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为了进一步得到各因素的最佳条件组合，使得罗非鱼片红色肉的Δa*值达到最优值，采用Design-Expert软件对各因素和响应值的数据进行优化分析。通过分析得到A、B、C的编码值分别为0.238、0.210、0.191，换算得到相应的碳酸氢钠质量浓度A=4.98 g·L–1、亚硝酸钠质量浓度B=0.39 g·L–1、浸泡时间C=21.9 min，优化的罗非鱼片红色肉的Δa*理论值为1.988。从实际操作便利方面考虑，最佳条件取碳酸氢钠质量浓度5.0 g·L–1、亚硝酸钠质量浓度0.4 g·L–1、浸泡时间22 min，在此优化条件下重复3次实验，测得处理后的罗非鱼片红色肉的Δa*=1.97，而预测值Δa*=1.98，通过显著性分析实验值和预测值之间的显著性P>0.05，不显著，表明实验确定的模型可以用于预测实际值。Mantilla等[22]用100% CO对罗非鱼片进行死后处理，得到Δa*值=6，相比处理前提升了35.29%，本实验方法达到了此CO发色方法近一半的效果，具有一定参考意义。
2.3 碳酸氢钠与亚硝酸钠复合发色处理后鱼片的亚硝酸盐残留变化
贮藏30 d内罗非鱼片的亚硝酸盐残留量变化不显著(P>0.05，图7)，贮藏30 d后亚硝酸盐的残留量为8.71 mg·kg–1，低于国标GB 2760—2014的限定值(30 mg·kg–1) 。
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图 7 复合发色处理后的罗非鱼片在贮藏期间的亚硝酸盐残留量变化Figure 7. Change of nitrite residues of tilapia fillets after complex chromogenic treatment during storage3. 结论
本实验在单因素实验的基础上以新发色剂溶液的亚硝酸钠、碳酸氢钠质量浓度和发色剂溶液浸泡时间为响应变量，以罗非鱼片红色肉Δa*值为响应值进行响应面实验，最终得到新发色剂溶液的最佳发色条件为亚硝酸钠质量浓度0.4 g·L–1、碳酸氢钠质量浓度5.0 g·L–1、浸泡时间22 min。通过验证实验(n=3)，得到罗非鱼片红色肉的Δa*为1.97，提升了17.35%，较接近模型的预测值1.98，从感官上与CO发色的鱼片相近，说明该处理条件对罗非鱼片进行发色可行。经测定亚硝酸盐的残留量≤30 mg·kg–1，符合GB 2760—2014标准。还需进一步研究亚硝酸钠与碳酸氢钠复合试剂发色鱼片的品质及色泽稳定性，并与传统CO发色罗非鱼片进行比较，完善此复合发色的工艺。
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图 1 丁香酚对鳗弧菌的MIC
Figure 1. Minimum inhibitory concentration of eugenol against V. anguillarum
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图 2 30 ℃培养24 h平板上鳗弧菌的生长状况
Figure 2. Growth of V. anguillarum on plate incubated at 30 ℃ for 24 h
表 1 丁香酚对鳗弧菌的抑菌圈直径
Table 1 Inhibition zone diameter of eugenol on V. anguillarum
mm 直径
diameter平均
mean标准差
tandard deviation相对标准偏差/%
relative standard deviation丁香酚 eugenol 21.06 22.24 20.86 20.64 20.56 21.63 20.05 20.94 22.16 21.13 0.74 3.50 氯霉素 (200 μg·mL–1) chloramphenicol 44.32 45.23 43.26 43.34 44.64 45.28 43.86 44.88 44.62 44.38 0.75 1.69 5%乙醇 ethanol 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 8.00 0.00 0.00 
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表 2 丁香酚对不同细菌MIC和MBC
Table 2 Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of eugenol against different bacteria
细菌种类
bacterial species最低抑菌浓度/μg·mL–1
MIC最小杀菌浓度/μg·mL–1
MBC文献
Reference金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 600 700 [30] 128~512 – [31] 400 600 [32] 李斯特菌 Listeria monocytogenes 500 800 [33] 弯曲空肠杆菌 Campylobacter jejunni 1.25 – [34] 沙门氏菌 Salmonella anatum 400 600 [32] 大肠杆菌 Escherichia coli 400 600 [32] 嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila 800 1 600 [18] 800~3 200 1 600~3 200 [17] 维氏气单胞菌 Aeromonas veronii 800 1 600 [18] 格氏乳球菌 Lactococcus garvieae 30 – [35] 弗氏柠檬酸杆菌 Citrobacter freundii 1 600 1 600 [18] 鳗弧菌 Vibrio anguillarum 400 800 本研究
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