Comparative pathological study of tilapia naturally infected with Streptococcus agalactiae and virulence gene profiling of isolated strains
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摘要:
在自然感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的罗非鱼(Oreochromis niloticus)成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼体内分别获得14株、4株和2株无乳链球菌。临床和组织病理学分析显示，罗非鱼成鱼出现无规则游动，脑、眼眶、鳃和鳍条充血，眼球突出、白浊，内脏器官肿大、充血，以肾小管玻璃样变性、脑膜炎和心外膜炎等组织病理学变化为特征；罗非鱼稚鱼体表无明显症状，但部分内脏器官呈现肿大、充血现象，以脾脏血管区出血、肾小管上皮细胞变性、脑组织炎症反应较轻为其主要组织病理学特征。此外，罗非鱼胃固有层内及稚鱼肝脏组织中有大量的嗜酸性粒细胞浸润，可观察到无乳链球菌在成鱼的脑、心脏以及稚鱼肝脏中增殖；自然携带无乳链球菌的罗非鱼临床症状和组织学病变均不明显。PCR检测发现，各无乳链球菌毒力基因谱相同，但自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼的病理学损伤差异显著。
Abstract:We isolated 14, 4 and 2 strains of Streptococcus agalactiae from naturally infected adult and juvenile tilapia as well as tilapia naturally carrying S. agalactiae, respectively. The clinical signs and anatomy changes of adult tilapia were as follows: erratic swimming, congestion of brain, eyeballs, gills and fins, exophthalmia, corneal opacity and swelling of visceral organs, which were characterized by histopathological changes with tubular hyaline degeneration, meningitis and epicarditis. The clinical symptoms of juvenile tilapia were not obvious, but some of the internal organs showed swelling and congestion, characterized by main histopathological features of hemorrhage of spleen vascular area, degenerated renal tubular epithelial cells and milder inflammatory response in brain tissue. In addition, eosinophil infiltration was found in the lamina propria of tilapia and in the liver of juvenile fish. It was observed that S. agalactiae proliferated in the brain and heart of adult fish and in the liver of juvenile tilapia, respectively. The clinical symptoms and histological lesions in tilapia carrying S. agalactiae were not obvious. The results of PCR detection show that all the S. agalactiae strains had the same virulence gene profiles, but there were significant differences in pathological damages among adult fish, juvenile fish and tilapia carrying S. agalactiae.
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物种共现(species co-occurrence)是对许多生态过程获得更好理解的基本模式，生态学家常通过分析两个或多个物种在一组空间位置中共同出现的频率，评估物种共现的正、负相关性和随机性。对物种共现模式的研究是许多生态研究的基本任务[1]。
传统生态位构建理论认为，物种在群落中的共现是以生态位分化为前提的，生态位相同的物种可能因竞争共同的资源而发生竞争排除，不能稳定共现[2]，同科属的种类往往表现出较接近的生态位，受空间和食物资源的影响，在时间上出现明显的错位分布[3]。而中性理论认为，物种共现与生态位分化无关，物种在扩散限制的边界内随机聚合形成群落[4-5]。虽然生态位理论和中性理论在物种共现方面存在争议，但近年来更多的生态学家倾向于生态位理论和中性理论并非对立，将生态位理论和中性理论整合可以更好地理解群落构建的机理[6-7]。近年来的研究主要集中于环境筛选和生物相互作用在群落构建中的相对重要性。群落物种特征是群落构建的直接作用对象，所以生态学家通过构建群落零模型(null model)、数据随机化(data randomization)等方法来分析实际群落中物种的分布特征与随机过程导致的特征相似和离散性的异同[8-10]。但是这种用于产生随机化矩阵的方法受随机过程本身的影响往往会产生“一类”或“二类”错误，而概率模型不依赖于数据随机化过程，“一类”或“二类”错误的发生率相对较低[11-12]。
网络分析方法(networks theory)可以获得生物过程与生物群落构建之间的关系，利用网络的属性特点可以反映群落中物种之间的相互关系，并能够通过对物种联结节点赋予不同的权重反映物种之间相互作用的强度[13-14]。该理论已经广泛应用在不同层次的群落构建机制研究中，包括对基因和蛋白质相互作用、代谢路径、共现关系以及食物网的分析[13]。另外，共现网络(co-occurrence networks)也被应用在对不同生物群落的构建模式分析中，在网络中可以通过分析种间联结数量和权重识别群落结构中的核心物种[15-17]。
长江口是我国最大的河口，大量淡水和陆源物质注入为海洋鱼类和其他海洋生物提供了良好的生存环境。受河口冲淡水以及潮汐等多种环境因素的影响，长江口生态系统具有较大的时空变化，栖息环境的差异导致了鱼类群落组成的差异[18]。本研究以长江口鱼类群落为研究对象，使用概率模型和网络分析方法，1) 探讨鱼类群落的种间共现模式；2)分析在栖息环境具明显季节差异的河口水域，鱼类种间共现模式和群落聚集程度的变化；3) 识别群落中的核心物种。进而了解长江口鱼类群落构建和生物多样性维持的机制。
1. 材料与方法
1.1 采样方法
于2012—2014年每年的2月(冬季)、5月(春季)、8月(夏季)和11月(秋季)，对长江口中华鲟自然保护区及附近海域渔业资源进行了定点采样调查，共15个站点(图1)。
调查船为沪崇渔1511号，渔具为双囊底拖网，网口宽6 m，网高2 m，网纲长6 m，囊网网目20 mm。根据GPS定位，当调查船到达站位后，放下拖网，以约2 km·h−1的航速拖曳30 min，随即收网并整理2个囊袋中的渔获物。当渔获物数量较少时，记录全部渔获物的种类、数量、质量、体长等统计量数据，渔获物数量较多时随机抽取一定比例的渔获物进行统计，最后换算成全部渔获物的数量，种类鉴定参考《长江口鱼类》[19]。
1.2 分析方法
随机共现表示2个物种之间的相对分布模式是随机的或独立的，并不表示每个物种的分布都是随机的；正关联的2个物种的分布在空间位置上重叠的可能性更高，负关联的2个物种相反。因此一对物种可能存在的潜在共现关系有3种，即随机、正关联和负关联。这种关联模式的存在可以间接的证明存在某些不确定的生态过程或影响因子导致了特定的种间共现模式[1]。本研究根据每个物种在不同月份和不同站点的渔获数据建立物种出现(1)—不出现(0)的关联矩阵，利用成对概率分析(pair-wise probabilistic analyses)方法验证物种共现的假设[12]。分析在R语言co-occur程序包中进行[20]。该方法可以获得每个种对共现关系的显著性(α>0.05)，并能够识别显著聚集和显著分离的物种。
观察到的种对共现数据用于构建不同季节的种间共现网络，以观察到的鱼类共现关系为边(edges)，以物种作为顶点(nodes)。种间共现网络的构建在R语言igraph程序包中进行[21]。分析物种权度(weighted degree)和中间中心性(betweenness centrality)，以物种权度决定顶点大小。在共现网络中，将群落中与某一物种具有显著正关联的所有物种的种数作为该物种的权度；物种对群落内信息交换的控制能力作为物种的中间中心性，它是将通过节点的二进制最短路径除以2个节点之间的二进制路径的数量来计算的，中间中心性越大，物种对群落内信息交换的控制能力越强，对维持群落结构的稳定就越关键[22]。权重和中间中心性的估算都在R语言tnet程序包中进行[23]。利用局部聚类系数 (local clustering coefficients) 分析物种权重密度，聚类系数是当前与中心节点联结的节点之间的链接数量与可能的链接总数的比例。聚类系数较高的网络具有较强的内聚性[24]。同时使用igraph程序包中的intersection.by.name代码分析每个季节的共现关系都是正相关的种对[21]。
采用相对重要性指数(relative importance index，IRI)作为鱼类优势度的指标：
$${\rm{IRI}} = \left( {N + W} \right) \times F$$ 式中N为某种鱼类占捕获鱼类个体总数的百分比(%)，W为某种鱼类占捕获鱼类总质量的百分比(%)，F为某种鱼类在调查中的出现频率(%)。IRI值大于1 000时为优势种，50~1 000为常见种，其余为偶见种，优势种和常见种为长江口的主要经济鱼类[18]。
所有分析均在R 3.4.3中进行。
2. 结果
调查共发现鱼类38种，属11目18科(表1)。以鲈形目最多(16种)，其中虾虎鱼科最多(9种)，其次是鲱形目和鲽形目各有4种。优势种和常见种共11种。
表 1 长江口鱼类组成 (2012—2014年)Table 1. Fish species composition in Yangtze River estuary (2012−2014)目
Order科
Family种
Species频次
frequency相对重要性指数
IRI鲱形目 Clupeiformes 鳀科 赤鼻棱鳀 Thrissa kammalensis 3 0.62 黄鲫 Setipinna taty 2 0.07 刀鲚 Coilia nasus 56 128.20 凤鲚 Coilia mystus 34 73.15 鲑形目 Salmoniformes 银鱼科 大银鱼 Protosalanx hyalocranius 4 0.18 灯笼鱼目 Myctophiformes 狗母鱼科 龙头鱼 Harpodon nehereus 24 77.77 鳗鲡目 Anguilliformes 海鳗科 海鳗 Muraensox cinereus 3 0.41 鲤形目 Cypriniformes 鲤科 贝氏䱗 Hemiculter bleekeri 3 0.27 长蛇 Saurogobio dumerili 3 0.21 鲇形目 Siluriformes 鲿科 光泽黄颡鱼 Pelteobagrus nitidus 31 58.81 长吻 Leiocassis longirostris 4 0.48 鲻形目 Mugiliformes 鲻科 鲻 Mugil cephalus 2 0.13 鮻 Liza haematocheila 5 0.32 鲈形目 Perciformes 马鲅科 多鳞四指马鲅 Eleutheronema rhadinum 5 0.35 鮨科 中国花鲈 Lateolabrax maculatus 6 1.23 石首鱼科 黄姑鱼 Nibea albifora 16 30.26 白姑鱼 Argyrosomus argentatus 30 47.78 鮸 Miichthys miiuy 8 3.12 棘头梅童鱼 Collichthys lucidus 48 1 340.92 虾虎鱼科 髭缟虾虎鱼 Triaenopogon barbatus 11 7.10 纹缟虾虎鱼 Tridentiger trigonocephalus 1 0.04 波氏吻虾虎鱼 Ctenogobius cliffordpopei 1 0.01 狼牙鳗虾虎鱼 Taenioides anguillaris 54 185.98 拉氏狼牙虾虎鱼 Odontamblyopus lacepedii 5 1.81 睛尾蝌蚪虾虎鱼 Lophiogobius ocellicauda 53 262.44 矛尾虾虎鱼 Chaeturichthys stigmatias 31 198.59 斑尾刺虾虎鱼 Synechogobius ommaturus 11 6.72 孔虾虎鱼 Trypauchen vagina 38 120.72 鲳科 银鲳 Pampus argenteus 8 1.50 䲗科 香斜棘䲗 Repomucenus olidus 2 0.04 鲉形目 Scorpaeniformes 鲂鮄科 小眼绿鳍鱼 Chelidonichthys spinosus 1 0.88 鲬科 鲬 Platycephalus indicus 1 0.01 鲽形目 Pleuronectiformes 舌鳎科 日本须鳎 Paraplagusia japonica 1 0.03 短吻红舌鳎 Cynoglossus joyneri 23 109.89 窄体舌鳎 Cynoglossus gracilis 75 705.37 鳎科 带纹条鳎 Zebrias zebra 1 0.21 鲀形目 Tetraodontiformes 鲀科 暗纹东方鲀 Takifugu obscurus 1 0.02 黄鳍东方鲀 Takifugu xanthopterus 1 0.37 调查期间，38个物种703个种对中，有76个种对呈显著正关联，12个种对为显著负关联，大部分种对(615对，87.5%)为随机关联，且随机关联种对中587对(95.4%)与偶见种有关。与棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)有显著正关联的鱼类有13种，与龙头鱼(Harpodon nehereus)、矛尾虾虎鱼(Chaeturichthys stigmatias)和孔虾虎鱼(Trypauchen vagina)正关联的鱼类各有9种；负关联种对中涉及鱼种最多的是光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus)，共有9对。主要经济鱼类(11种)中正关联种对19对(34.5%)，负关联种对8对(14.5%)。同科种对有52对，其中正关联种对11个，负关联种对2个，分别是矛尾虾虎鱼和斑尾刺虾虎鱼 (Synechogobius ommaturus)，短吻红舌鳎(Cynoglossus joyneri)和窄体舌鳎 (C. gracilis)，其余种对为随机关联(表2，图2)。
表 2 长江口鱼类共现模式呈正相关、负相关和随机性的种对数量Table 2. Number of pairs of fish species with positive, negative and random co-occurrence patterns in Yangtze River estuary月份
month物种数
number of species共现模式
pattern of co-occurrence正相关
positive负相关
negative随机
random2月 Feb. 18 3 3 147 5月 May 24 11 4 261 8月 Aug. 27 51 4 296 11月 Nov. 27 26 6 319 总体 total 38 76 12 615 ![]()
图 2 长江口鱼类种间共现模式Figure 2. Co-occurrence patterns of fish species in Yangtze River estuary鱼类共现模式存在季节差异。随机关联的种对占绝对优势。8月正关联种对最多，其次是11月，2月最少；负关联种对不论是各个季节还是总体，均占比很小 (表2，图3)。共现网络中物种权度和边线数量以8月最为复杂，2月最简单(图4)。
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图 3 长江口鱼类种间共现模式季节变化Figure 3. Seasonal variance of fish species co-occurrence patterns in Yangtze River estuary![]()
图 4 长江口鱼类种间共现网络季节变化Figure 4. Seasonal variation of fish species co-occurrence networks in Yangtze River estuary物种权度的季节变化较大。平均物种权度最高的是8月，其次是11月，最低的是2月(图4，图5)。2月物种权度最高的为髭缟虾虎鱼(Triaenopogon barbatus) (2)；5月除了棘头梅童鱼(4)和矛尾虾虎鱼(4)之外，其他种类都小于4；8月物种权度大于5的种类有8种，其中龙头鱼11，棘头梅童鱼10，短吻红舌鳎、鮸鱼(Miichthys miiuy)和髭缟虾虎鱼均为9，矛尾虾虎鱼8，多鳞四指马鲅(Eleutheronema rhadinum) 和孔虾虎鱼为7；11月物种权度除了棘头梅童鱼(5)和龙头鱼(3)之外，其余种类均≤3。
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图 5 长江口鱼类群落各季节权度和局部聚类系数 (均值±标准误)Figure 5. Bar plots of$\overline X$ ±SE of weight degrees and local clustering coefficients in different seasons in Yangtze River estuary与物种权度相似，物种的中间中心性也存在季节差异。2月最高的为髭缟虾虎鱼(1.00)；5月最高的为棘头梅童鱼(4.50)；8月最高的为龙头鱼(23.26)，其余种类超过5的有棘头梅童鱼(18.87)、髭缟虾虎鱼(18.66)、睛尾蝌蚪虾虎鱼(Lophiogobius ocellicauda，18.46)、短吻红舌鳎(17.01)、矛尾虾虎鱼(16.48)、鮸鱼(13.17)和孔虾虎鱼(7.73)；11月最高也为棘头梅童鱼(13.17)，其余超过5的有龙头鱼(6.33)、白姑鱼(Argyrosomus argentatus，6.00)和凤鲚(Coilia mystus，6.00)。
调查期间长江口发现的鱼类虽然有38种，但不存在每个季节都显著正关联的物种。在3个季节(5月、8月和11月)均正关联的有3个种对，分别为矛尾虾虎鱼与短吻红舌鳎、矛尾虾虎鱼与棘头梅童鱼以及棘头梅童鱼与白姑鱼。
3. 讨论
传统的河口鱼类群落结构研究多采用多元统计分析(包括聚类分析、多维标度排序、主成分分析、对应分析、冗余分析和典范对应分析等)描述变量间的相关关系，以及环境变量对各个物种的影响，这类研究一般不包括物种间的相互作用[25]。本研究利用成对概率模型和网络分析方法分析鱼类种间共现关系，对了解生物时空分布规律和评估种间作用关系具有重要意义。
3.1 长江口鱼类共现模式
部分研究认为鱼类共现主要是物种在生物和环境因素作用下的非随机关联[26-27]，环境因素的作用要大于生物间相互作用[28-29]。本研究证实长江口鱼类群落模式主要是物种的随机共现[16-17]。94.5%的随机共现种对涉及偶见种，表明这种随机共现模式受偶见种影响较大。主要经济鱼类中49%的种间非随机共现模式，说明长江口主要经济鱼类在某些不确定因素的影响下形成了较为稳定的种间共现模式。
一般在环境因子变化较大的环境中，相似性较高的物种表现出相似的生态位，往往是生境过滤共现机制占据主要地位[30]。也有研究认为同科或同属鱼类在时间上出现明显的错位分布，因为生态位接近，时间错位分布可以减少对空间和食物资源的竞争，因而竞争排斥对群落的影响超过环境过滤[3]。但长江口鱼类同科种对仍然以随机共现模式为主。长江口水温、盐度等环境因素的空间梯度较大，对鱼类的环境过滤作用较高，且资源(如小型浮游动物等饵料生物)分布密度较大[18]。以上分析一定程度上说明在调查期间种间对空间和食物资源的竞争对长江口鱼类共现模式的影响较小，环境因子季节变化驱动的随机因素可能是导致长江口鱼类随机共现模式的主要原因，种间共现的正关联性则能够说明物种间对环境需求的相似性[9]。
对环境因子需求的相异性、躲避捕食者或种间对空间或饵料竞争等因素都有可能导致种间共现负关联[11]。光泽黄颡鱼是长江口常见的淡水鱼类，物种出现矩阵显示，光泽黄颡鱼在调查期间的各月均有出现，但光泽黄颡鱼与和其呈负关联的种类(如棘头梅童鱼、龙头鱼和矛尾虾虎鱼等)相比有明显的栖息地选择性差异[18]。鉴于负关联种对间的这种差异以及不明显的捕食关系[31]，本研究认为环境过滤可能是导致种间负关联的主要因素。
3.2 共现模式的季节差异
种间共现模式的季节差异反映了鱼类群落构建季节变动的动力机制[1]。长江口鱼类空间共现模式的季节变化，反映了其鱼类群落组成明显的季节差异。季节性水文变化、自然资源变动可能导致种间共现模式的变化[11]。如夏秋季节长江栖息环境更适合鱼类索饵育肥，其物种丰度、生物多样性要高于其他季节[32-33]，相应的8月和11月的鱼类共现网络复杂程度和群落聚集程度都较高，2月和5月则相对较低。高权度和高中间中心性物种的季节更替进一步证明长江口鱼类群落较大的季节波动，这种更替一定程度上影响了种间共现的随机性[3]。溯河洄游鱼类和海洋洄游鱼类分别在不同时空尺度上的优势导致了长江口鱼类群落出现明显的时空差异[18]，本研究发现这种更替主要与海洋洄游和河口定居型鱼类有关(如2月的髭缟虾虎鱼，5月的棘头梅童鱼和矛尾虾虎鱼，8月的龙头鱼、棘头梅童鱼和髭缟虾虎鱼以及11月的棘头梅童鱼、龙头鱼和白姑鱼等)，说明海洋洄游鱼类和河口定居型鱼类在长江口鱼类共现网络中占主导地位，在生物多样性维持中发挥重要作用。
3.3 长江口鱼类核心物种
在维护群落结构稳定性中，核心物种起着决定作用。控制模拟实验法、物种相互作用相对重要性法、群落重要性指数法、网络分析法和Ecopath with Ecosim模型法是常见的核心种识别方法[15]。本研究以种间共现关系为基础构建鱼类种间关系网，确定了棘头梅童鱼、矛尾虾虎鱼为长江口鱼类核心物种，其中棘头梅童鱼具有较高的IRI和中间中心性，说明其对群落内信息交换的控制能力较强，对维持长江口鱼类群落结构的稳定起关键作用。
3.4 生物多样性保护策略
由于长江口鱼类群落受环境过滤影响较大，并且长江口又是棘头梅童鱼、刀鲚、凤鲚等重要经济鱼类的产卵场和育肥场，季节性洄游鱼类变化对长江口鱼类生物多样性有较大影响。因此为保护长江口鱼类生物多样性，除了采取合理措施保护长江口生态环境(如减少污染物排放，建立海洋牧场以修复河口底栖生态环境、保护底栖生物等)外，还应采取措施降低邻近海域的捕捞强度、实施经济种类的增殖放流、保持长江口与邻近海域的连通性及种群密度。
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图 1 罗非鱼脑组织PCR检测结果
M. Maker DL 2 000；阳. 阳性对照；阴. 阴性对照；1~159. 采自开平养殖场；160~166. 采自高州平养殖场；167~170. 采自廉江养殖场；171~174. 采自吴川养殖场；175~180. 采自惠州养殖场；181~188. 采自河源养殖场
Figure 1. PCR detection results of tilapia brain
positive. positive control; negative. negative control; 1−159. from Kaiping farm; 160-166. from Gaozhouping farm; 167−170. from Lianjiang farm; 171−174. from Wuchuan farm; 175−180. from Huizhou farm; 181−188. from Heyuan farm
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图 2 鱼感染无乳链球菌的眼观剖检变化
罗非鱼成鱼：A. 眼眶充血、眼球突出(↓)，肠道发炎、肠壁变薄、内容物发黄(*)；B. 脑充血、出血(↓)；C. 肝脏肿大、充血、胆囊肿大(*)，脾脏肿大、充血，肾脏肿大(↓)。罗非鱼稚鱼：体表无明显症状；D. 肝脏充血肿大(*)，脾脏肿大(*)，肠壁变薄、内容物发黄；自然携带无乳链球菌罗非鱼：E. 体表正常；内脏无明显症状。斑马鱼：F. 身体弯曲，眼球浑浊，鳍条和腹部充血、出血(↓)
Figure 2. Change in anatomy of fish infected with S. agalactiae
Adult tilapia: A. orbital congestion and exophthalmos (↓), intestinal inflammation, thinning of intestinal wall and yellowing of contents (*); B. cerebral hyperemia and hemorrhage (↓); C. liver enlargement, congestion, gallbladder enlargement (*), splenomegaly, hyperemia and kidney enlargement (↓). Juvenile tilapia: no obvious symptoms on the body surface; D. hepatic hyperemia (*), splenomegaly (*), thinning of intestinal wall and yellowing of contents; tilapia naturally carrying S. agalactiae: E. no obvious symptoms on the body surface; no visceral symptoms. Zebrafish: F. bent body, corneal opacity, and congestion of fins (↓)
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图 3 各株无乳链球菌感染斑马鱼后的累积死亡率
Figure 3. Cumulative motality rate of zebrafish infected with different S. agalactiae strains
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图 4 自然感染无乳链球菌罗非鱼成鱼组织病理学
A. 脑，脑膜炎，脑膜增厚，大量的炎症细胞浸润，脑血管充血；B. 脑，A图
Figure 4. Histopathology of adult tilapia naturally infected with S. agalactiae
A. brain, meningitis, thickening of the meninges, infiltration of a large number of inflammatory cells, cerebral vascular congestion; B. brain,magnified micrograph of the zone in the black frame in A, inflammatory cell aggregation (*), a large number of proliferating S. agalactiae around the blood vessels (↓); C. brain, intravascular microthrombus formation (↓); D. liver, focal inflammatory response, massive accumulation of inflammatory cells (*); E. intestinal, lamina propria congestion (↓), epithelial cells slightly shed; F. gill, gill filament epithelial cell hyperplasia, fusion (↓), sinus congestion (*); G. heart, epicarditis, epicardial thickening, a large number of inflammatory cell infiltration; H. heart, magnified micrograph of the zone in the black frame in G, massive proliferation around the blood vessels S. agalactiae (↓), intravascular inflammatory cell proliferation (*); I. heart, epicardial septic foci, a large number of cells, cell debris (*) and neutrophils in the abscess (↓); J. spleen , hemorrhage (*), splenic artery epithelial cell damage, thrombosis (↓); K. stomach, gastric lamina propria inflammation, vascular congestion (*), a large number of eosinophil infiltration in the inflammation area (↓); L. kidney, kidney tubulous degeneration (↓), renal interstitial hemorrhage (*)
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图 5 自然感染无乳链球菌罗非鱼稚鱼组织病理学
A. 脑，脑炎，小胶质细胞聚集，血管充血；B. 脑，A图
Figure 5. Histopathology of juvenile tilapia naturally infected with S. agalactiae
A. brain, encephalitis, microglia accumulation, vascular congestion; B. brain, magnified micrograph of the zone in the black frame in A, massive proliferation of microglia (*) and vascular congestion (↓); C. liver, liver hemorrhage (*), blood vessels a large number of eosinophil infiltration around; D. liver, magnified micrograph of the zone in the black frame in C, large proliferation of S. agalactiae (*) and hyperplastic eosinophils (↓); E. intestinal, intestinal villi shortened (↓), epithelial cell shedding (*); F. gill, gill silk epithelial cell shedding is "sticky"(↓), sinus congestion (*); G. heart; H. spleen, lymphocyte area shrinkage, vascular area bleeding (*); I. stomach, Inflammatory reaction in the lamina propria of the stomach; J. stomach, magnified micrograph of the zone in the black frame in I, a large number of eosinophils (↓) and neutrophil accumulation (*); K. kidney, tubular degeneration, necrosis; L. kidney, magnified micrograph of the zone in the black frame in K, renal tubular epithelial cells degeneration, shedding (*)
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图 6 自然携带无乳链球菌的罗非鱼组织病理学
A. 脑；B. 肝脏，肝细胞轻微肿胀；C. 肠道；D. 鳃；E. 心脏；F. 脾脏，脾血窦充血；G. 胃，固有层轻微水肿；H. 肾脏，肾小管上皮轻微变性
Figure 6. Histopathology of tilapia carrying S. agalactiae
A. brain; B. liver, liver cells slightly swollen; C. intestine; D. gill; E. heart; F. spleen, spleen sinus congestion; G. stomach, lamina propria edema; H. kidney, the epithelium of kidney tubules is slightly degenerated.
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图 7 无乳链球菌21种毒力基因PCR扩增
M. DNA Marker (DL 2 000); 1. TKP1601; 2. TGZ1601
Figure 7. PCR amplification of 21 virulence gene of S. agalactiae
表 1 样品采集和无乳链球菌菌株分离信息
Table 1 Sample collection and information of separation of S. agalactiae strain
质量/g
mass采样地
sampling city养殖密度/尾·hm–2
breeding density/ind·hm–2发病史
history of disease样品数/尾
number of samples菌株数
number of strains菌株编号
strain No.检出率/%
detection rate≈500 开平市 ≈100 无 159 2 TKP1601-02 1.26 ≈15 高州市 ≈200 爆发 7 4 TGZ1601-04 57.10 ≈500 廉江市 4 4 TLJ1601-04 63.64 吴川市 4 2 TWC1601-02 惠州市 6 0 − 河源市 8 8 TLC1601-08 
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表 2 引物列表
Table 2 Primers of this study
引物
primer上游引物序列 (5'−3')
forward primer sequence下游引物序列 (5'−3')
reverse primer sequence扩增靶标
amplification target长度/bp
length16S rDNA-F/R AGAGTTTGATCC TGGCTCAG TACGGCTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA 1 472 sdi-F/R ATTCTCCTCCTGGCAAAGCC TGACGCTTGGTAGTTGCTGT 16S−23S rDNA 192 fbsA-F/R AGTGTTGGAAATCAAAGTCAAGGT TTCATTGCGTCTCAAACCGC 纤维蛋白结合蛋白A (fbsA) 924 cfb-F/R AACTCTAGTGGCTGGTGCAT CTCCAACAGCATGTGTGATTGC CAMP因子基因 (cfb) 650 dltR-F/R GTCTGAAGGTCCCCAAACCT TGTTACCCAAACGCTCAGGAT 调节蛋白基因 (dltR) 392 ponA-F/R ACAACTTGCTTTGCTCGCTG AGAGCCCTTCTGGCATTGTC 青霉素结合蛋白基因 (ponA) 1 337 hylB-F/R TCCACAACCCGTCACAACAC AACGCGCCCCATATCTACTA 透明质酸酶基因 (hylB) 790 cspA-F/R TGCACGTAACCAGTATCGCA GCACCGAGTTTAACGGCATC 丝氨酸蛋白酶基因 (cspA) 175 sodA-F/R TGATGCGCTTGAGCCACATA GCTTTGATGTAGTTAGGACGAACA 超氧化物歧化酶基因 (sodA) 513 sip-F/R ACAGATACGACGTGGACAGC ACCACGATCTGGCATTGCAT 表面免疫相关蛋白基因 (sip) 1 173 fbsB-F/R AGTTGCGCAAACTTCTGTCC TTTCCGCAGTTGTTACACCG 纤维蛋白结合蛋白B基因 (fbsB) 158 iagA-F/R GCATGGCCATTCCACTGAAG GCTAGCACTCATGGCACCTT 侵袭相关基因 (iagA) 493 scpB-F/R TGCGGCCTTTATCAGTCGAA AACAGTCCCATGATACCCGC C5a肽酶基因 (scpB) 273 bca-F/R TCAAGTTTGGTGCAGCTTCTG TCCGGTACTGACAATACTAACAAT αC蛋白基因 (bca) 616 srr-1-F/R ATGTTGCAGTAAAGCGCTGC GGAAGAGAGTCGTTTTCGGC 富含丝氨酸重复蛋白基因 (srr-1) 727 bibA-F/R TGCATAATATCCAGGTGTAGGCA TGAGAGATTGGGAAGTGGTGC 免疫原性细菌黏附蛋白基因 (bibA) 943 psaA-F/R AGCTGTCACCCTTTTGACCTT TAGGCTTAGGTGCCTGTGCT 肺炎球菌表面抗原A基因 (psaA) 828 lmb-F/R ATTTGTGACGCAACACACGG TCTTGTTTCCGCTTGGAGCA 层黏连蛋白结合蛋白基因 (lmb) 263 spb1-F/R GACATGGGGAGATGGTGGTG AGCTTCTGTGCCCCATTCAA 溶血素Ⅲ (spb1) 652 bac-F/R TGATTCCCTTTTGCTCTGCCA GTTCATGGGAAGCGTTGCTC βC蛋白基因 (bac) 557 pavA-F/R TCGACTTACATTGCCCCACC GGCGGCATCTGTCTTAACCT 纤维蛋白结合蛋白基因 (pavA) 996 cppA-F/R TGCAAATCTTGTCCCTGTGC TCGTACTCGTGCGGTGAATG C3降解蛋白酶基因 (cppA) 387 cylE-F/R ATTCTCCTCCTGGCAAAGCC TGACGCTTGGTAGTTGCTGT β-溶血素/溶细胞素基因 (cylE) 176
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表 3 21对毒力基因检测结果
Table 3 Detection results of 21 virulence genes
毒力基因
virulence gene菌株 strain 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 fbsA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cfb + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + dltR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ponA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + hylB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cspA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + sodA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + sip + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + fbsB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + iagA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + scpB – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – bca + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + srr-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + bibA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + psaA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + lmb – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – spb1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + bac + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + pavA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cppA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cylE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 注：1−2. TKP1601−TKP1602；3−6. TGZ1601−TGZ1604；7−10. TLJ1601−TLJ1604；11−12. TWC1601−TWC1602；13−20. TLC1601−
TLC1608
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