Comparative pathological study of tilapia naturally infected with Streptococcus agalactiae and virulence gene profiling of isolated strains
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摘要:
在自然感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的罗非鱼(Oreochromis niloticus)成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼体内分别获得14株、4株和2株无乳链球菌。临床和组织病理学分析显示，罗非鱼成鱼出现无规则游动，脑、眼眶、鳃和鳍条充血，眼球突出、白浊，内脏器官肿大、充血，以肾小管玻璃样变性、脑膜炎和心外膜炎等组织病理学变化为特征；罗非鱼稚鱼体表无明显症状，但部分内脏器官呈现肿大、充血现象，以脾脏血管区出血、肾小管上皮细胞变性、脑组织炎症反应较轻为其主要组织病理学特征。此外，罗非鱼胃固有层内及稚鱼肝脏组织中有大量的嗜酸性粒细胞浸润，可观察到无乳链球菌在成鱼的脑、心脏以及稚鱼肝脏中增殖；自然携带无乳链球菌的罗非鱼临床症状和组织学病变均不明显。PCR检测发现，各无乳链球菌毒力基因谱相同，但自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼的病理学损伤差异显著。
Abstract:We isolated 14, 4 and 2 strains of Streptococcus agalactiae from naturally infected adult and juvenile tilapia as well as tilapia naturally carrying S. agalactiae, respectively. The clinical signs and anatomy changes of adult tilapia were as follows: erratic swimming, congestion of brain, eyeballs, gills and fins, exophthalmia, corneal opacity and swelling of visceral organs, which were characterized by histopathological changes with tubular hyaline degeneration, meningitis and epicarditis. The clinical symptoms of juvenile tilapia were not obvious, but some of the internal organs showed swelling and congestion, characterized by main histopathological features of hemorrhage of spleen vascular area, degenerated renal tubular epithelial cells and milder inflammatory response in brain tissue. In addition, eosinophil infiltration was found in the lamina propria of tilapia and in the liver of juvenile fish. It was observed that S. agalactiae proliferated in the brain and heart of adult fish and in the liver of juvenile tilapia, respectively. The clinical symptoms and histological lesions in tilapia carrying S. agalactiae were not obvious. The results of PCR detection show that all the S. agalactiae strains had the same virulence gene profiles, but there were significant differences in pathological damages among adult fish, juvenile fish and tilapia carrying S. agalactiae.
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无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)也称B族链球菌(Group B Streptococcus，GBS)，为兼性厌氧革兰氏阳性球菌，是一种重要的人兽鱼共患菌，可引起孕妇子宫内膜炎、新生儿脑膜炎、败血症和肺炎等疾病[1-4]；也可感染猪、兔、奶牛、猫和犬等动物[5-7]；同时，无乳链球菌也是罗非鱼(Oreochromis niloticus)的主要病原菌。罗非鱼是联合国粮食与农业组织推荐的21世纪全球最重要的淡水养殖品种之一[8]。根据2018年中国渔业统计年鉴①，广东淡水养殖罗非鱼产量为722 625 t，占全国罗非鱼总产量的45.6%，同时随着养殖规模扩大，无乳链球菌病对罗非鱼养殖造成了严重损失，并逐年加剧。2008年前，广东地区感染罗非鱼的链球菌多为海豚链球菌(S. iniae)，而2009年后无乳链球菌成为该鱼的主要病原菌[9-10]。早前研究发现，无乳链球菌只感染罗非鱼亲鱼及100 g以上的幼鱼、成鱼[11-12]，然而近些年来发现，感染无乳链球菌的罗非鱼有小型化趋势[13-14]，此外，还存在罗非鱼自然携带无乳链球菌的情况[15]，由于其临床症状不明显，食用罗非鱼生鱼片的安全性应当引起重视。无乳链球菌的强、弱毒株对罗非鱼造成的病理学差异显著[16]，但尚未见自然感染无乳链球菌罗非鱼成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌罗非鱼的比较病理学报道。
目前对人及哺乳动物源无乳链球菌致病机制的研究较为深入，至少有19种毒力因子被证实与无乳链球菌的致病性有关，如与孔毒素相关的β-血溶素/细胞毒素(β-H/C，CylE)和CAMP因子；参与免疫逃逸的唾液酸荚膜多糖(CPS)、超氧化物歧化酶(SodA)、C5α肽酶(ScpB)和丝氨酸蛋白酶(CspA)；抑制抗菌肽的脂磷壁酸、青霉素结合蛋白(PBP1a)和菌毛抗原；促进粘附和侵袭宿主细胞的纤维蛋白结合蛋白A (FbsA)、免疫原性细菌粘附素(BibA)以及与侵染相关的蛋白(IagA)等[17-19]。然而，对鱼源无乳链球菌的毒力因子缺乏深入研究，已有针对罗非鱼无乳链球菌的scpB和sip等毒力基因克隆、表达及免疫原性相关的研究[20-21]；Zhang等[22]分析了从罗非鱼分离的无乳链球菌的6种毒力相关基因，发现所检测的罗非鱼分离菌株具有相同的毒力基因谱：bca+、bac+、fbsA+、sip+、cfb+、scpB–和lmb–；Kannika等[23]也通过血清型分类、多重PCR方法鉴定罗非鱼源无乳链球菌14种毒力相关基因，发现血清型Ia缺少lmb、spb1和scpB，而血清型Ⅲ仅缺少bac。本研究比较了自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼和自然携带无乳链球菌的罗非鱼之间的病理学差异，同时分析了无乳链球菌各菌株毒力基因谱的特征，以期为罗非鱼无乳链球菌的致病性研究提供有益参考。
1. 材料与方法
1.1 样品来源
罗非鱼样品品系均为吉富罗非鱼(GIFT O. niloticus)，共188尾，其中，采自开平市养殖场的为无爆发疾病且无临床症状的罗非鱼，共159尾，体质量约500 g；采自高州、廉江、吴川、惠州和河源等地养殖场的为正爆发无乳链球菌病的罗非鱼，共29尾，分成鱼、稚鱼2种。其中罗非鱼成鱼体质量约500 g，稚鱼体质量约15 g (表1)。
表 1 样品采集和无乳链球菌菌株分离信息Table 1. Sample collection and information of separation of S. agalactiae strain质量/g
mass采样地
sampling city养殖密度/尾·hm–2
breeding density/ind·hm–2发病史
history of disease样品数/尾
number of samples菌株数
number of strains菌株编号
strain No.检出率/%
detection rate≈500 开平市 ≈100 无 159 2 TKP1601-02 1.26 ≈15 高州市 ≈200 爆发 7 4 TGZ1601-04 57.10 ≈500 廉江市 4 4 TLJ1601-04 63.64 吴川市 4 2 TWC1601-02 惠州市 6 0 − 河源市 8 8 TLC1601-08 1.2 病原菌分离与鉴定
在无菌条件下，对所采罗非鱼进行解剖，观察并记录剖检变化，用接种环在肾、脑取样，划线于脑心浸出液肉汤(BHI)固体培养基，28 ℃培养24~48 h，挑取优势菌落进行纯化培养：1)按照常规方法进行革兰氏染色，观察细菌形态；2)按照HiPure Bacterial DNA Kit (Magen) 细菌DNA提取试剂盒操作说明提取细菌基因组，采用细菌16S rDNA通用引物(表2)进行扩增并测序，分别利用ClustalX 2.0和MEGA 5.2进行序列比对并构建系统发育树；3)将纯化后的细菌用20%的甘油保存于– 80 ℃备用。
表 2 引物列表Table 2. Primers of this study引物
primer上游引物序列 (5'−3')
forward primer sequence下游引物序列 (5'−3')
reverse primer sequence扩增靶标
amplification target长度/bp
length16S rDNA-F/R AGAGTTTGATCC TGGCTCAG TACGGCTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA 1 472 sdi-F/R ATTCTCCTCCTGGCAAAGCC TGACGCTTGGTAGTTGCTGT 16S−23S rDNA 192 fbsA-F/R AGTGTTGGAAATCAAAGTCAAGGT TTCATTGCGTCTCAAACCGC 纤维蛋白结合蛋白A (fbsA) 924 cfb-F/R AACTCTAGTGGCTGGTGCAT CTCCAACAGCATGTGTGATTGC CAMP因子基因 (cfb) 650 dltR-F/R GTCTGAAGGTCCCCAAACCT TGTTACCCAAACGCTCAGGAT 调节蛋白基因 (dltR) 392 ponA-F/R ACAACTTGCTTTGCTCGCTG AGAGCCCTTCTGGCATTGTC 青霉素结合蛋白基因 (ponA) 1 337 hylB-F/R TCCACAACCCGTCACAACAC AACGCGCCCCATATCTACTA 透明质酸酶基因 (hylB) 790 cspA-F/R TGCACGTAACCAGTATCGCA GCACCGAGTTTAACGGCATC 丝氨酸蛋白酶基因 (cspA) 175 sodA-F/R TGATGCGCTTGAGCCACATA GCTTTGATGTAGTTAGGACGAACA 超氧化物歧化酶基因 (sodA) 513 sip-F/R ACAGATACGACGTGGACAGC ACCACGATCTGGCATTGCAT 表面免疫相关蛋白基因 (sip) 1 173 fbsB-F/R AGTTGCGCAAACTTCTGTCC TTTCCGCAGTTGTTACACCG 纤维蛋白结合蛋白B基因 (fbsB) 158 iagA-F/R GCATGGCCATTCCACTGAAG GCTAGCACTCATGGCACCTT 侵袭相关基因 (iagA) 493 scpB-F/R TGCGGCCTTTATCAGTCGAA AACAGTCCCATGATACCCGC C5a肽酶基因 (scpB) 273 bca-F/R TCAAGTTTGGTGCAGCTTCTG TCCGGTACTGACAATACTAACAAT αC蛋白基因 (bca) 616 srr-1-F/R ATGTTGCAGTAAAGCGCTGC GGAAGAGAGTCGTTTTCGGC 富含丝氨酸重复蛋白基因 (srr-1) 727 bibA-F/R TGCATAATATCCAGGTGTAGGCA TGAGAGATTGGGAAGTGGTGC 免疫原性细菌黏附蛋白基因 (bibA) 943 psaA-F/R AGCTGTCACCCTTTTGACCTT TAGGCTTAGGTGCCTGTGCT 肺炎球菌表面抗原A基因 (psaA) 828 lmb-F/R ATTTGTGACGCAACACACGG TCTTGTTTCCGCTTGGAGCA 层黏连蛋白结合蛋白基因 (lmb) 263 spb1-F/R GACATGGGGAGATGGTGGTG AGCTTCTGTGCCCCATTCAA 溶血素Ⅲ (spb1) 652 bac-F/R TGATTCCCTTTTGCTCTGCCA GTTCATGGGAAGCGTTGCTC βC蛋白基因 (bac) 557 pavA-F/R TCGACTTACATTGCCCCACC GGCGGCATCTGTCTTAACCT 纤维蛋白结合蛋白基因 (pavA) 996 cppA-F/R TGCAAATCTTGTCCCTGTGC TCGTACTCGTGCGGTGAATG C3降解蛋白酶基因 (cppA) 387 cylE-F/R ATTCTCCTCCTGGCAAAGCC TGACGCTTGGTAGTTGCTGT β-溶血素/溶细胞素基因 (cylE) 176 1.3 样品组织中无乳链球菌DNA的检测
在无菌条件下，取脑组织50~100 mg，加入1 mL无菌PBS和玻璃珠至2 mL离心管中，通过组织裂解器研磨获得组织悬液，并按照HiPure Bacterial DNA Kit (Magen)细菌DNA提取试剂盒的操作说明提取，即得到高纯度的细菌DNA，于–20 ℃保存备用。参照Berridge等[24]用无乳链球菌的16S−23S rDNA间区序列引物(表2)，使用PCR的方法检测各样品中的无乳链球菌。
1.4 斑马鱼(Danio rerio)致病力实验
参照Patterson等[25]方法，将纯化的20株无乳链球菌扩大培养，用生理盐水配成1.0×104 CFU·mL–1的细菌悬液，腹腔注射健康斑马鱼，注射剂量为25 μL·尾–1和15尾·组–1，设置2个平行。对照组注射等量无菌生理盐水，水温为30 ℃，连续观察14 d，记录临床症状和死亡率。
1.5 病理组织学观察
将采集的罗非鱼肝、脑、心、脾、肾、肠、胃、鳃等组织固定于10%甲醛溶液中，根据临床症状、细菌分离和组织PCR检测结果，分别选取各养殖区3尾自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼做后续的脱水、透明、浸蜡、包埋、组织切片，并进行苏木素-伊红(HE)染色，显微镜下观察组织病理学变化及拍照。用上述方法，对采自开平市养殖场无发病史且无明显临床症状的罗非鱼，根据细菌分离和组织PCR检测结果，选取自然携带无乳链球菌的样品进行组织病理学分析。
1.6 无乳链球菌毒力基因检测
筛选出21个无乳链球菌毒力基因[26-29]，利用Primer Premier 6.0设计各基因对应的PCR引物，具体信息详见表2。由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。参照HiPure Bacterial DNA Kit (Magen) 细菌DNA提取试剂盒提取20株无乳链球菌的基因组DNA，PCR反应体系为12.5 μL，包括r-Taq 6.25 μL，10 pmol·L–1引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，其余以无菌水补齐。PCR反应条件为94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃最终延伸8 min；4 ℃保存。琼脂糖凝胶电泳后对所扩增条带进行测序。
2. 结果
2.1 细菌鉴定
细菌在BHI平板上生长缓慢，24 h后可见明显单菌落，边缘平滑，灰白色，不透明。革兰氏染色结果显示，细菌呈革兰氏阳性，形状为球状，单个、短或长链状排列，初步鉴定为无乳链球菌(表1)。扩增上述20株无乳链球菌疑似株的16S rDNA序列并进行BLAST比对，发现其序列与已报道的无乳链球菌的同源性均可达99%以上，系统进化树分析表明所有菌株与鱼源无乳链球菌形成独立分支。
2.2 样品组织中无乳链球菌DNA检测
用无乳链球菌16S−23S rDNA特异性引物检测随机采集的188尾罗非鱼的脑组织(包括来自既无无乳链球菌病发病史又无临床症状的开平市养殖场的159尾样品)，其中2尾呈无乳链球菌阳性；来自高州发病养殖场罗非鱼稚鱼7尾，其中4尾呈无乳链球菌阳性；来自廉江、吴川、惠州和河源等地发病养殖场的罗非鱼成鱼22尾，其中14尾呈无乳链球菌阳性(图1)。样品组织PCR检测结果与细菌分离鉴定结果完全吻合(表1)。
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图 1 罗非鱼脑组织PCR检测结果M. Maker DL 2 000；阳. 阳性对照；阴. 阴性对照；1~159. 采自开平养殖场；160~166. 采自高州平养殖场；167~170. 采自廉江养殖场；171~174. 采自吴川养殖场；175~180. 采自惠州养殖场；181~188. 采自河源养殖场Figure 1. PCR detection results of tilapia brainpositive. positive control; negative. negative control; 1−159. from Kaiping farm; 160-166. from Gaozhouping farm; 167−170. from Lianjiang farm; 171−174. from Wuchuan farm; 175−180. from Huizhou farm; 181−188. from Heyuan farm2.3 各菌株对斑马鱼致病性
将无乳链球菌腹腔注射斑马鱼，部分鱼2 d后出现打转游动、眼球浑浊、腹部和胸鳍基部充血、身体弯曲(图2-F)等临床病症。斑马鱼感染无乳链球菌后，从第1天开始出现死亡，死亡高峰期集中在第1~第4天，在感染第5~第6天后死亡数量逐渐变少，第7天后不再出现死鱼，20株无乳链球菌感染斑马鱼后15 d内的累积死亡率为53.3%~86.7%，PBS对照组的累计死亡率为0% (图3)。
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图 2 鱼感染无乳链球菌的眼观剖检变化罗非鱼成鱼：A. 眼眶充血、眼球突出(↓)，肠道发炎、肠壁变薄、内容物发黄(*)；B. 脑充血、出血(↓)；C. 肝脏肿大、充血、胆囊肿大(*)，脾脏肿大、充血，肾脏肿大(↓)。罗非鱼稚鱼：体表无明显症状；D. 肝脏充血肿大(*)，脾脏肿大(*)，肠壁变薄、内容物发黄；自然携带无乳链球菌罗非鱼：E. 体表正常；内脏无明显症状。斑马鱼：F. 身体弯曲，眼球浑浊，鳍条和腹部充血、出血(↓)Figure 2. Change in anatomy of fish infected with S. agalactiaeAdult tilapia: A. orbital congestion and exophthalmos (↓), intestinal inflammation, thinning of intestinal wall and yellowing of contents (*); B. cerebral hyperemia and hemorrhage (↓); C. liver enlargement, congestion, gallbladder enlargement (*), splenomegaly, hyperemia and kidney enlargement (↓). Juvenile tilapia: no obvious symptoms on the body surface; D. hepatic hyperemia (*), splenomegaly (*), thinning of intestinal wall and yellowing of contents; tilapia naturally carrying S. agalactiae: E. no obvious symptoms on the body surface; no visceral symptoms. Zebrafish: F. bent body, corneal opacity, and congestion of fins (↓)2.4 临床症状与剖检病变
罗非鱼成鱼在水中打转、无规则游动，体表发黑、身体弯曲，眼球白浊、突起、眼眶和鳍条充血；鳃丝充血，肠道发炎、肠壁变薄，其内容物发黄(图2-A)；脑充血、出血(图2-B)；肝脏、脾脏和肾脏肿大、充血，胆囊肿大(图2-C)；肛门红肿。罗非鱼稚鱼体表无明显症状；肝脏、脾脏肿大、充血，肠壁变薄，其内容物发黄(图2-D)。自然携带无乳链球菌的罗非鱼无明显的临床症状和剖检病变(图2-E)。
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图 3 各株无乳链球菌感染斑马鱼后的累积死亡率Figure 3. Cumulative motality rate of zebrafish infected with different S. agalactiae strains2.5 组织病理学变化
2.5.1 脑
罗非鱼成鱼脑组织表现出显著的炎症反应，小胶质细胞增生，脑膜增厚，伴随大量的炎症细胞浸润，炎症反应区的血管周围伴有大量增殖的无乳链球菌(图4-A，4-B)，脑血管内微血栓形成(图4-C)；罗非鱼稚鱼脑组织炎症反应较轻，小胶质细胞聚集，脑血管充血(图5-A，5-B)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼脑组织正常(图6-A)。
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图 4 自然感染无乳链球菌罗非鱼成鱼组织病理学A. 脑，脑膜炎，脑膜增厚，大量的炎症细胞浸润，脑血管充血；B. 脑，A图
Figure 4. Histopathology of adult tilapia naturally infected with S. agalactiaeA. brain, meningitis, thickening of the meninges, infiltration of a large number of inflammatory cells, cerebral vascular congestion; B. brain,magnified micrograph of the zone in the black frame in A, inflammatory cell aggregation (*), a large number of proliferating S. agalactiae around the blood vessels (↓); C. brain, intravascular microthrombus formation (↓); D. liver, focal inflammatory response, massive accumulation of inflammatory cells (*); E. intestinal, lamina propria congestion (↓), epithelial cells slightly shed; F. gill, gill filament epithelial cell hyperplasia, fusion (↓), sinus congestion (*); G. heart, epicarditis, epicardial thickening, a large number of inflammatory cell infiltration; H. heart, magnified micrograph of the zone in the black frame in G, massive proliferation around the blood vessels S. agalactiae (↓), intravascular inflammatory cell proliferation (*); I. heart, epicardial septic foci, a large number of cells, cell debris (*) and neutrophils in the abscess (↓); J. spleen , hemorrhage (*), splenic artery epithelial cell damage, thrombosis (↓); K. stomach, gastric lamina propria inflammation, vascular congestion (*), a large number of eosinophil infiltration in the inflammation area (↓); L. kidney, kidney tubulous degeneration (↓), renal interstitial hemorrhage (*)![]()
图 5 自然感染无乳链球菌罗非鱼稚鱼组织病理学A. 脑，脑炎，小胶质细胞聚集，血管充血；B. 脑，A图
Figure 5. Histopathology of juvenile tilapia naturally infected with S. agalactiaeA. brain, encephalitis, microglia accumulation, vascular congestion; B. brain, magnified micrograph of the zone in the black frame in A, massive proliferation of microglia (*) and vascular congestion (↓); C. liver, liver hemorrhage (*), blood vessels a large number of eosinophil infiltration around; D. liver, magnified micrograph of the zone in the black frame in C, large proliferation of S. agalactiae (*) and hyperplastic eosinophils (↓); E. intestinal, intestinal villi shortened (↓), epithelial cell shedding (*); F. gill, gill silk epithelial cell shedding is "sticky"(↓), sinus congestion (*); G. heart; H. spleen, lymphocyte area shrinkage, vascular area bleeding (*); I. stomach, Inflammatory reaction in the lamina propria of the stomach; J. stomach, magnified micrograph of the zone in the black frame in I, a large number of eosinophils (↓) and neutrophil accumulation (*); K. kidney, tubular degeneration, necrosis; L. kidney, magnified micrograph of the zone in the black frame in K, renal tubular epithelial cells degeneration, shedding (*)![]()
图 6 自然携带无乳链球菌的罗非鱼组织病理学A. 脑；B. 肝脏，肝细胞轻微肿胀；C. 肠道；D. 鳃；E. 心脏；F. 脾脏，脾血窦充血；G. 胃，固有层轻微水肿；H. 肾脏，肾小管上皮轻微变性Figure 6. Histopathology of tilapia carrying S. agalactiaeA. brain; B. liver, liver cells slightly swollen; C. intestine; D. gill; E. heart; F. spleen, spleen sinus congestion; G. stomach, lamina propria edema; H. kidney, the epithelium of kidney tubules is slightly degenerated.2.5.2 肝脏
罗非鱼成鱼肝细胞水肿，排列紊乱，边缘界限模糊，肝静脉血管周围有大量的炎症细胞浸润，呈现典型的血管周围炎病变(图4-D)；罗非鱼稚鱼肝组织淤血、静脉内大量红细胞淤积(图5-C)，肝细胞轻微肿胀，有大量的炎症细胞浸润，以嗜酸性粒细胞增生为主，并伴有大量增殖的无乳链球菌(图5-D)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼肝细胞边缘界限清晰、为不规则多边形，肝细胞轻微肿胀(图6-B)。
2.5.3 肠道
罗非鱼成鱼肠道固有层充血，上皮细胞轻微脱落(图4-E)；罗非鱼稚鱼肠绒毛上皮细胞脱落更严重，肠绒毛变短(图5-E)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼肠道正常(图6-C)。
2.5.4 鳃
罗非鱼成鱼鳃丝上皮细胞增生、融合，鳃血窦充血(图4-F)；罗非鱼稚鱼鳃丝上皮细胞坏死、脱落、呈“棒状”，鳃血窦大量红细胞淤积(图5-F)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼鳃组织正常(图6-D)。
2.5.5 心脏
罗非鱼成鱼心外膜增厚，大量炎症细胞浸润(图4-G)，血管周围伴有大量增殖的无乳链球菌(图4-H)，心外膜出现化脓灶，其内有大量菌体、细胞碎片及中性粒细胞(图4-I)；罗非鱼稚鱼心脏组织无明显的病理学变化(图5-G)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼心脏组织正常(图6-E)。
2.5.6 脾脏
罗非鱼成鱼脾血窦内大量的血细胞聚集，脾动脉血管壁变性，脾脏出血，脾动脉上皮细胞损伤，形成血栓(图4-J)；罗非鱼稚鱼脾脏淋巴细胞区缩小，血管区出血(图5-H)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼脾血窦充血(图6-F)。
2.5.7 胃
罗非鱼成鱼胃固有层内有炎症反应，血管充血，炎区内大量的嗜酸性粒细胞浸润(图4-K)；罗非鱼稚鱼胃固有层内有大量的嗜酸性粒细胞和中性粒细胞聚集，呈现出炎症反应(图5-I~J)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼胃固有层轻微水肿(图6-G)。
2.5.8 肾脏
罗非鱼成鱼肾小管内上皮细胞内有大量的嗜酸性颗粒，肾小球肿胀，球囊变窄，肾间质出血，肾小管玻璃样变性(图4-L)；罗非鱼稚鱼肾小管变性、坏死，肾小管上皮细胞变性、脱落(图5-K~L)；自然携带无乳链球菌的罗非鱼肾小管上皮轻微变性(图6-H)。
2.6 无乳链球菌菌株毒力基因谱
通过PCR检测20株无乳链球菌的毒力基因，发现所有菌株均含有fbsA、cfb、dltR、ponA、hylB、cspA、sodA、sip、fbsB、iagA、bca、srr-1、bibA、psaA、spb1、bac、pavA、cppA和cylE基因，不含scpB和lmb基因(表3，图7)，所测菌株毒力基因谱完全一致。
表 3 21对毒力基因检测结果Table 3. Detection results of 21 virulence genes毒力基因
virulence gene菌株 strain 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 fbsA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cfb + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + dltR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ponA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + hylB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cspA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + sodA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + sip + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + fbsB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + iagA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + scpB – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – bca + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + srr-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + bibA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + psaA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + lmb – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – spb1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + bac + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + pavA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cppA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cylE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 注：1−2. TKP1601−TKP1602；3−6. TGZ1601−TGZ1604；7−10. TLJ1601−TLJ1604；11−12. TWC1601−TWC1602；13−20. TLC1601−
TLC1608![]()
图 7 无乳链球菌21种毒力基因PCR扩增M. DNA Marker (DL 2 000); 1. TKP1601; 2. TGZ1601Figure 7. PCR amplification of 21 virulence gene of S. agalactiae3. 讨论
近些年国内外学者对罗非鱼无乳链球菌病病理学做了一定的研究。Evans等[30]观察到无乳链球菌感染罗非鱼引起嗜睡，厌食，眼球突出(单侧或双侧)，角膜混浊发白，游泳打转，鳃盖、鳍条基部、腹部、生殖孔充血。祝璟琳等[31]发现自然感染无乳链球菌的大罗非鱼体色发黑，突眼、角膜混浊，嗜睡，食欲不振，鳃盖、胸鳍、腹部充血；脑膜疏松水肿并伴有淋巴细胞浸润，肝脏、脾脏和肾脏充血，肝脏、脾脏含铁黄素沉积，腹腔充满淡黄色液体。Abuseliana等[32]也发现无乳链球菌能引起红罗非鱼败血症和脑膜炎，肝、脾和肾出现炎性水肿、细胞变性和坏死，并导致心肌炎、心外膜炎等。本研究中，自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼剖检及组织病理学变化与文献报道的基本一致。Hernández等[11]通过组织病理学的方法观察到红罗非鱼(>150 g)脑组织巨噬细胞内有大量的无乳链球菌，本研究在感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼脑和心脏组织切片内发现增殖的无乳链球菌，而仅在感染罗非鱼稚鱼的肝脏组织观察到该病原菌，说明无乳链球菌易于在罗非鱼成鱼的脑、心脏以及罗非鱼稚鱼的肝脏中定植。目前，国内外对于自然感染无乳链球菌的罗非鱼稚鱼鲜有报道，本研究发现罗非鱼稚鱼感染无乳链球菌的体表症状不明显，除了肝、肾和脾脏等组织外，其脑和心等组织病理损伤不及成鱼严重。方伟等[15]发现携带无乳链球菌的罗非鱼肌肉组织中有多处病灶，内脏组织没有明显病理学病变，本研究也发现自然携带无乳链球菌的罗非鱼未表现出明显的临床症状，仅对个别组织造成轻微的病理损伤。值得注意的是，在自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼的胃固有层均观察到大量的嗜酸性粒细胞浸润。在通常情况下，寄生虫感染或过敏反应会伴随嗜酸性粒细胞增殖[33-34]，但在本研究中并未发现明显的寄生虫感染，这种特殊的病理学现象需要进一步研究。
本研究检测的毒力基因包括：穿孔毒素相关的β-H/C、CAMP因子；促进免疫逃避因子相关的scpB、sodA、cpsA、bac、cylE；抵抗宿主抗菌肽因子相关的dltR、ponA；黏附和侵袭宿主细胞相关的fbsA、fbsB、lmb、srr-1、bibA、bca、iagA、pavA、hylB、spb1；以及其他的毒力基因sip、ccpA等[27-29]。其中β-H/C不仅能提高无乳链球菌攻击宿主细胞屏障的能力，而且会导致心脏、肝脏等功能衰竭及神经系统混乱[35-36]。ScpB既可以阻止C5a肽酶与宿主中性粒细胞结合，抑制细菌感染时宿主吞噬细胞的杀伤作用[37]，又可以与纤维结合蛋白作用，加快无乳链球菌对上皮细胞的黏附侵袭[38]。SodA蛋白能让细胞抵御氧化应激，降低超氧自由基对细胞造成的损害并及时修复受损细胞[39]。本研究对所分离的20株无乳链球菌的21种毒力基因检测发现仅缺失scpB和lmb，与Kayansamruaj等[26]报道结果一致，表明鱼源无乳链球菌的毒力基因比较保守。斑马鱼毒力实验发现，所有菌株对斑马鱼均有致病力，说明各菌株对其均具有潜在的致病性。
虽然无乳链球菌的毒力基因谱一致，但自然感染无乳链球菌的罗非鱼成鱼、稚鱼及自然携带无乳链球菌的罗非鱼在临床症状和组织病理方面存在着显著差异。一般认为，无乳链球菌可逃脱吞噬细胞的免疫防御，部分细菌被黏附吞噬后在巨噬细胞内存活、增殖，随巨噬细胞在体内游走、释放并扩散感染其他组织，进一步穿越宿主的血-脑屏障，损坏脑-神经系统[12,40-41]。无乳链球菌也被称为高度侵入性细菌，其在受感染的动物中易引起炎症反应和败血症，在此过程中，细菌的毒力因子发挥重要作用[40]。研究表明，不同链球菌菌株间可能存在抗原多样性，与菌株中不同毒力因子的表达水平相关[6,42]。本研究中20株无乳链球菌菌株虽然含有相同的毒力基因，但各菌株毒力基因在宿主体内的表达水平上可能存在差异，这可能是导致宿主临床症状和组织病理学损伤差异的原因之一，具体的机制有待进一步证实。Abuseliana等[32]发现在腹腔注射无乳链球菌8 d和浸泡感染5 d后，红罗非鱼稚鱼的临床症状基本消失，认为与红罗非鱼稚鱼的免疫系统有关。本研究显示，无乳链球菌可对罗非鱼稚鱼内脏器官(除心脏外)造成严重的病理损伤，而其穿越血-脑屏障的能力减弱，仅引起轻微的脑组织炎症反应和体表症状，推测罗非鱼稚鱼的先天免疫系统可能在抑制无乳链球菌在其脑组织内定植中发挥重要作用。本研究发现，无乳链球菌易于突破罗非鱼成鱼的血-脑屏障，并在脑组织内大量增殖，导致剧烈的炎症反应，这可能是造成罗非鱼成鱼表现出明显临床症状和组织病理学变化的主要原因。Alharbi[43]认为高密度养殖会导致罗非鱼无乳链球菌病爆发，本研究显示高州、廉江、吴川、惠州和河源主养区罗非鱼养殖密度普遍偏高，机体长期处于应激状态下，为无乳链球菌侵染提供便利；相反，开平地区养殖密度低，鱼体体质良好，无乳链球菌难以突破机体的免疫防御体系，但似乎存在个别菌株，能躲避免疫系统的清除，并在宿主体内自然携带，但对机体并不造成病理学损伤，由于无乳链球菌也是人类的病原菌[44]，在中国南方存在食用罗非鱼生鱼片的习惯，这为食品安全带来一定隐患，需引起重视。综上，无乳链球菌可对不同大小和养殖模式下的罗非鱼造成差异显著的病理学变化，本研究可以为深入研究无乳链球菌的致病机制提供参考。
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图 1 罗非鱼脑组织PCR检测结果
M. Maker DL 2 000；阳. 阳性对照；阴. 阴性对照；1~159. 采自开平养殖场；160~166. 采自高州平养殖场；167~170. 采自廉江养殖场；171~174. 采自吴川养殖场；175~180. 采自惠州养殖场；181~188. 采自河源养殖场
Figure 1. PCR detection results of tilapia brain
positive. positive control; negative. negative control; 1−159. from Kaiping farm; 160-166. from Gaozhouping farm; 167−170. from Lianjiang farm; 171−174. from Wuchuan farm; 175−180. from Huizhou farm; 181−188. from Heyuan farm
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图 2 鱼感染无乳链球菌的眼观剖检变化
罗非鱼成鱼：A. 眼眶充血、眼球突出(↓)，肠道发炎、肠壁变薄、内容物发黄(*)；B. 脑充血、出血(↓)；C. 肝脏肿大、充血、胆囊肿大(*)，脾脏肿大、充血，肾脏肿大(↓)。罗非鱼稚鱼：体表无明显症状；D. 肝脏充血肿大(*)，脾脏肿大(*)，肠壁变薄、内容物发黄；自然携带无乳链球菌罗非鱼：E. 体表正常；内脏无明显症状。斑马鱼：F. 身体弯曲，眼球浑浊，鳍条和腹部充血、出血(↓)
Figure 2. Change in anatomy of fish infected with S. agalactiae
Adult tilapia: A. orbital congestion and exophthalmos (↓), intestinal inflammation, thinning of intestinal wall and yellowing of contents (*); B. cerebral hyperemia and hemorrhage (↓); C. liver enlargement, congestion, gallbladder enlargement (*), splenomegaly, hyperemia and kidney enlargement (↓). Juvenile tilapia: no obvious symptoms on the body surface; D. hepatic hyperemia (*), splenomegaly (*), thinning of intestinal wall and yellowing of contents; tilapia naturally carrying S. agalactiae: E. no obvious symptoms on the body surface; no visceral symptoms. Zebrafish: F. bent body, corneal opacity, and congestion of fins (↓)
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图 3 各株无乳链球菌感染斑马鱼后的累积死亡率
Figure 3. Cumulative motality rate of zebrafish infected with different S. agalactiae strains
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图 4 自然感染无乳链球菌罗非鱼成鱼组织病理学
A. 脑，脑膜炎，脑膜增厚，大量的炎症细胞浸润，脑血管充血；B. 脑，A图
Figure 4. Histopathology of adult tilapia naturally infected with S. agalactiae
A. brain, meningitis, thickening of the meninges, infiltration of a large number of inflammatory cells, cerebral vascular congestion; B. brain,magnified micrograph of the zone in the black frame in A, inflammatory cell aggregation (*), a large number of proliferating S. agalactiae around the blood vessels (↓); C. brain, intravascular microthrombus formation (↓); D. liver, focal inflammatory response, massive accumulation of inflammatory cells (*); E. intestinal, lamina propria congestion (↓), epithelial cells slightly shed; F. gill, gill filament epithelial cell hyperplasia, fusion (↓), sinus congestion (*); G. heart, epicarditis, epicardial thickening, a large number of inflammatory cell infiltration; H. heart, magnified micrograph of the zone in the black frame in G, massive proliferation around the blood vessels S. agalactiae (↓), intravascular inflammatory cell proliferation (*); I. heart, epicardial septic foci, a large number of cells, cell debris (*) and neutrophils in the abscess (↓); J. spleen , hemorrhage (*), splenic artery epithelial cell damage, thrombosis (↓); K. stomach, gastric lamina propria inflammation, vascular congestion (*), a large number of eosinophil infiltration in the inflammation area (↓); L. kidney, kidney tubulous degeneration (↓), renal interstitial hemorrhage (*)
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图 5 自然感染无乳链球菌罗非鱼稚鱼组织病理学
A. 脑，脑炎，小胶质细胞聚集，血管充血；B. 脑，A图
Figure 5. Histopathology of juvenile tilapia naturally infected with S. agalactiae
A. brain, encephalitis, microglia accumulation, vascular congestion; B. brain, magnified micrograph of the zone in the black frame in A, massive proliferation of microglia (*) and vascular congestion (↓); C. liver, liver hemorrhage (*), blood vessels a large number of eosinophil infiltration around; D. liver, magnified micrograph of the zone in the black frame in C, large proliferation of S. agalactiae (*) and hyperplastic eosinophils (↓); E. intestinal, intestinal villi shortened (↓), epithelial cell shedding (*); F. gill, gill silk epithelial cell shedding is "sticky"(↓), sinus congestion (*); G. heart; H. spleen, lymphocyte area shrinkage, vascular area bleeding (*); I. stomach, Inflammatory reaction in the lamina propria of the stomach; J. stomach, magnified micrograph of the zone in the black frame in I, a large number of eosinophils (↓) and neutrophil accumulation (*); K. kidney, tubular degeneration, necrosis; L. kidney, magnified micrograph of the zone in the black frame in K, renal tubular epithelial cells degeneration, shedding (*)
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图 6 自然携带无乳链球菌的罗非鱼组织病理学
A. 脑；B. 肝脏，肝细胞轻微肿胀；C. 肠道；D. 鳃；E. 心脏；F. 脾脏，脾血窦充血；G. 胃，固有层轻微水肿；H. 肾脏，肾小管上皮轻微变性
Figure 6. Histopathology of tilapia carrying S. agalactiae
A. brain; B. liver, liver cells slightly swollen; C. intestine; D. gill; E. heart; F. spleen, spleen sinus congestion; G. stomach, lamina propria edema; H. kidney, the epithelium of kidney tubules is slightly degenerated.
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图 7 无乳链球菌21种毒力基因PCR扩增
M. DNA Marker (DL 2 000); 1. TKP1601; 2. TGZ1601
Figure 7. PCR amplification of 21 virulence gene of S. agalactiae
表 1 样品采集和无乳链球菌菌株分离信息
Table 1 Sample collection and information of separation of S. agalactiae strain
质量/g
mass采样地
sampling city养殖密度/尾·hm–2
breeding density/ind·hm–2发病史
history of disease样品数/尾
number of samples菌株数
number of strains菌株编号
strain No.检出率/%
detection rate≈500 开平市 ≈100 无 159 2 TKP1601-02 1.26 ≈15 高州市 ≈200 爆发 7 4 TGZ1601-04 57.10 ≈500 廉江市 4 4 TLJ1601-04 63.64 吴川市 4 2 TWC1601-02 惠州市 6 0 − 河源市 8 8 TLC1601-08 
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表 2 引物列表
Table 2 Primers of this study
引物
primer上游引物序列 (5'−3')
forward primer sequence下游引物序列 (5'−3')
reverse primer sequence扩增靶标
amplification target长度/bp
length16S rDNA-F/R AGAGTTTGATCC TGGCTCAG TACGGCTACCTTGTTACGACTT 16S rDNA 1 472 sdi-F/R ATTCTCCTCCTGGCAAAGCC TGACGCTTGGTAGTTGCTGT 16S−23S rDNA 192 fbsA-F/R AGTGTTGGAAATCAAAGTCAAGGT TTCATTGCGTCTCAAACCGC 纤维蛋白结合蛋白A (fbsA) 924 cfb-F/R AACTCTAGTGGCTGGTGCAT CTCCAACAGCATGTGTGATTGC CAMP因子基因 (cfb) 650 dltR-F/R GTCTGAAGGTCCCCAAACCT TGTTACCCAAACGCTCAGGAT 调节蛋白基因 (dltR) 392 ponA-F/R ACAACTTGCTTTGCTCGCTG AGAGCCCTTCTGGCATTGTC 青霉素结合蛋白基因 (ponA) 1 337 hylB-F/R TCCACAACCCGTCACAACAC AACGCGCCCCATATCTACTA 透明质酸酶基因 (hylB) 790 cspA-F/R TGCACGTAACCAGTATCGCA GCACCGAGTTTAACGGCATC 丝氨酸蛋白酶基因 (cspA) 175 sodA-F/R TGATGCGCTTGAGCCACATA GCTTTGATGTAGTTAGGACGAACA 超氧化物歧化酶基因 (sodA) 513 sip-F/R ACAGATACGACGTGGACAGC ACCACGATCTGGCATTGCAT 表面免疫相关蛋白基因 (sip) 1 173 fbsB-F/R AGTTGCGCAAACTTCTGTCC TTTCCGCAGTTGTTACACCG 纤维蛋白结合蛋白B基因 (fbsB) 158 iagA-F/R GCATGGCCATTCCACTGAAG GCTAGCACTCATGGCACCTT 侵袭相关基因 (iagA) 493 scpB-F/R TGCGGCCTTTATCAGTCGAA AACAGTCCCATGATACCCGC C5a肽酶基因 (scpB) 273 bca-F/R TCAAGTTTGGTGCAGCTTCTG TCCGGTACTGACAATACTAACAAT αC蛋白基因 (bca) 616 srr-1-F/R ATGTTGCAGTAAAGCGCTGC GGAAGAGAGTCGTTTTCGGC 富含丝氨酸重复蛋白基因 (srr-1) 727 bibA-F/R TGCATAATATCCAGGTGTAGGCA TGAGAGATTGGGAAGTGGTGC 免疫原性细菌黏附蛋白基因 (bibA) 943 psaA-F/R AGCTGTCACCCTTTTGACCTT TAGGCTTAGGTGCCTGTGCT 肺炎球菌表面抗原A基因 (psaA) 828 lmb-F/R ATTTGTGACGCAACACACGG TCTTGTTTCCGCTTGGAGCA 层黏连蛋白结合蛋白基因 (lmb) 263 spb1-F/R GACATGGGGAGATGGTGGTG AGCTTCTGTGCCCCATTCAA 溶血素Ⅲ (spb1) 652 bac-F/R TGATTCCCTTTTGCTCTGCCA GTTCATGGGAAGCGTTGCTC βC蛋白基因 (bac) 557 pavA-F/R TCGACTTACATTGCCCCACC GGCGGCATCTGTCTTAACCT 纤维蛋白结合蛋白基因 (pavA) 996 cppA-F/R TGCAAATCTTGTCCCTGTGC TCGTACTCGTGCGGTGAATG C3降解蛋白酶基因 (cppA) 387 cylE-F/R ATTCTCCTCCTGGCAAAGCC TGACGCTTGGTAGTTGCTGT β-溶血素/溶细胞素基因 (cylE) 176
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表 3 21对毒力基因检测结果
Table 3 Detection results of 21 virulence genes
毒力基因
virulence gene菌株 strain 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 fbsA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cfb + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + dltR + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + ponA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + hylB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cspA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + sodA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + sip + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + fbsB + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + iagA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + scpB – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – bca + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + srr-1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + bibA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + psaA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + lmb – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – spb1 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + bac + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + pavA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cppA + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + cylE + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 注：1−2. TKP1601−TKP1602；3−6. TGZ1601−TGZ1604；7−10. TLJ1601−TLJ1604；11−12. TWC1601−TWC1602；13−20. TLC1601−
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