近年来，大规模的梯级水电开发、过度捕捞、环境污染等问题对长江上游鱼类种类组成、资源量及遗传多样性均产生了不利影响^[1]，引起了众多研究者的关注^[2-3]。四川华鳊 (Sinibrama taeniatus)隶属鲤形目、鲤科、鲌亚科、华鳊属，为长江上游珍稀特有的小型经济鱼类，因鱼体侧面具一黑线，又称“墨线鱼”。四川华鳊分布区域狭窄，仅在长江上游岷江、青衣江、嘉陵江以及大渡河等水域有分布^[4]，而成库后的静水环境很难满足其繁殖对流速的需要，栖息地进一步被压缩，同时岷江眉山段种群由于不合理的捕捞方式已出现小型化趋势^[5]，因此亟需开展四川华鳊种质资源保护的相关工作。人工增殖放流作为鱼类种质资源保护的有效手段^[6]，对水域生态环境改善、渔业资源恢复和生物多样性保护具有重要意义^[7]。四川华鳊亲鱼室内养殖驯养已取得初步成功，其温度耐受范围广，抗病性强，易于养殖，可作为长江上游特有鱼类种群恢复的物种之一。而目前关于四川华鳊的研究报道甚少，仅有少量关于资源调查^[8]、系统发育^[9]、物种鉴定^[10]、年龄生长^[5]及繁殖时间^[11]等的研究资料，而有关生殖细胞发生的研究尚未见报道。本文对四川华鳊卵子发生过程进行了显微结构观察，以期尽快掌握四川华鳊繁殖规律，实现室内繁殖完全可控，为人工增殖放流储备技术资料。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验所用四川华鳊于2016年9月采自长江上游岷江眉山段，大棚网箱 (3 m×1 m×1.5 m)养殖，实验用水为充分曝气的循环过滤水，自然光照，水温为16~25 ℃，pH为7.5±0.5，溶解氧>7 mg·L^–1，每日9:00投喂浮性颗粒饲料。

1.2   实验方法

实验选取处于不同发育时期的卵巢，Bouin氏液或10%中性甲醛固定，梯度酒精脱水，石蜡包埋，Leica RM2235切片机切片，切片厚度为5~7 μm，苏木精-伊红 (HE)染色，Nikon Eclipse 80i显微镜观察并拍照。

1.3   数据处理

使用Image-Pro Plus 6.0 图像软件对Ⅰ~Ⅳ时相卵母细胞直径进行测量，使用数显游标卡尺对成熟卵子卵径进行测量，使用Excel 2010对数据进行统计分析。

2.   结果

2.1   卵原细胞 (Ⅰ时相)

卵原细胞直径为10.28~21.30 μm，主要存在于Ⅰ期卵巢中，多成簇分布，明显大于体细胞，发育早期的卵巢中也有数量众多的卵原细胞，一般沿生殖上皮分布，在早期卵母细胞旁可以找到。卵原细胞呈圆形或卵圆形，细胞核大，胞质少，细胞界限不清晰，核膜较清晰，经HE染色后，核膜、核仁及核内染色质呈强嗜碱性，被苏木精染成蓝色，胞质及核质呈弱嗜酸性，被伊红染成极浅的紫红色。光学显微镜下观察到的卵原细胞主要有2种形态：1) 早期卵原细胞 (图版Ⅰ-1)，有中央大核仁；2) 有丝分裂过程中的卵原细胞 (图版Ⅰ-2)，中央大核仁消失，核内染色质散乱分布，显微镜下为蓝色线状物质。

  图版Ⅰ  四川华鳊卵子发生的显微结构 (HE染色)

og. 卵原细胞； nm. 核膜；nu. 核仁； n. 细胞核； chr. 染色质；po. 初级卵母细胞；yn. 卵黄核；fc. 滤泡细胞；zr. 放射带；tc. 鞘膜细胞；yg. 卵黄泡；yp. 卵黄小板；ca. 皮层泡；ol. 卵膜；1. 早期卵原细胞，示核仁、核膜；2. 有丝分裂中的卵原细胞，示细胞核、核膜、染色质；3. 单层滤泡时相早期，示核仁、染色质；4~6. 单层滤泡时相中期，示核仁、卵黄核、滤泡细胞；7~8. 单层滤泡时相晚期，示卵黄核、放射带、滤泡细胞；9~10. 卵黄泡出现时相早期，示卵黄泡、核仁、细胞核、鞘膜细胞、滤泡细胞、放射带；11~12. 卵黄泡出现时相中期，示细胞核、核膜、核仁、卵黄泡；13~14. 卵黄泡出现时相晚期，示核仁、卵黄颗粒、鞘膜细胞、滤泡细胞、外层放射带、内层放射带；15~16. 卵黄充满时相早期，示细胞核、核仁、鞘膜细胞、滤泡细胞、外层放射带、内层放射带；17~18. 卵黄充满时相中期，示卵黄颗粒、鞘膜细胞、滤泡细胞、外层放射带、内层放射带；19~20. 卵黄充满时相晚期，示皮层小泡、卵黄小板、细胞核、鞘膜细胞、滤泡细胞、外层放射带、内层放射带；21. 成熟卵子，示卵膜

  图版Ⅰ.  Microstructure of S. taeniatus oogenesis (HE staining)

og. oogonium; nm. nuclear membrane; nu. nucleolus; n. nuclear; chr. chromatin; po. primary oocyte; yn. yolk nucleus; fc. follicle cell; zr. zone radiate; tc. thecal cell; yg. yolk granule; yp. yolk platelet; ca. cortical alveoli; ol. oolemma; 1. early oogonium, showing the nucleous, nuclear membrane; 2. oogonium in mitosis, showing the nucleus, nuclear membrane, chromatin; 3. early phase of single-layer follicular cell, showing the nucleous, chromatin; 4−6. medium phase of single-layer follicular cell, showing the nucleous, yolk nucleus, follicle cell; 7−8. late phase of single-layer follicular cell, showing the yolk nucleus, zone radiate, follicular cell; 9−10. early phase of yolk vesicle, showing the yolk vesicle, nucleolus, nucleus, thecal cell, follicle cell, zone radiate; 11−12. medium phase of yolk vesicle, showing the nucleus, nuclear membrane, nucleolus, yolk vesicle; 13−14. late phase of yolk vesicle, showing the nucleolus, yolk granule, thecal cell, follicle cell, outro zone radiate, intro zone radiate; 15−16. early phase of yolk filled, showing the nucleus, nucleolus, thecal cell, follicle cell, outro zone radiate, intro zone radiate; 17−18. medium phase of yolk filled, showing the yolk granule, thecal cell, follicle cell, outro zone radiate, intro zone radiate; 19−20. late phase of yolk filled, showing the cortical vesicle, yolk platelet, nucleus, thecal cell, follicle cell, outro zone radiate, intro zone radiate; 21. mature oocyte, showing the oolemma

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2.2   单层滤泡时相 (Ⅱ时相卵母细胞)

单层滤泡时相包括了从初级卵母细胞形成到胞外单层滤泡细胞层完全形成的整个过程，这一阶段为卵母细胞小生长期，此时相卵母细胞较卵原细胞体积明显增大，直径为28.12~269.86 μm。在发育过程中细胞嗜碱性先增强后逐渐减弱，胞质着色从浅蓝到深蓝，后着色逐渐变为蓝紫色。

早期的Ⅱ时相卵母细胞 (图版Ⅰ-3)由卵原细胞通过多次有丝分裂生长形成，其体积较卵原细胞稍大，形状不规则，此阶段的细胞还未正式进入小生长期，胞质嗜碱性也较弱，核内没有中央大核仁，核膜边缘内侧开始出现多个小核仁，均嗜碱性，HE染色呈蓝色，细胞核内仍有蓝色絮状的染色质，散乱分布于核质内。

中期的Ⅱ时相卵母细胞 (图版Ⅰ-4)一般位于由非生殖细胞围成的腔中，切面多呈不规则多边形，部分切面棱角分明，其胞质嗜碱性极强，HE染色呈深蓝色，部分细胞胞质内可观察到有一深色无膜包裹的团块状物质，为卵黄核 (图版Ⅰ-5)，核质较均一，弱嗜酸性，染色呈浅紫红色，核膜内侧边缘有多个大小不一的嗜碱性核仁，核质中也有少量核仁分布，呈深蓝色，部分细胞的核膜与核质之间开始出现不着色的空隙。细胞外围滤泡细胞 (图版Ⅰ-6)开始形成，形状扁平，从切片平面观察到部分滤泡细胞紧贴卵母细胞。

晚期的Ⅱ时相卵母细胞 (图版Ⅰ-7)体积增大明显，核质比减小，卵母细胞变得相对饱满，切片平面逐渐趋于圆形或卵圆形，嗜碱性减弱，卵黄核移向胞质外围 (图版Ⅰ-7)，核膜边缘核仁数量增多，核膜与核质之间的不着色空隙逐渐增加，变为环状或核质偏向一侧。此阶段卵母细胞外单层扁平滤泡细胞已完全形成 (图版Ⅰ-8)，紧贴卵母细胞，滤泡细胞与卵母细胞之间出现放射带，强嗜酸性，呈火红色。

2.3   卵黄泡出现时相 (Ⅲ时相卵母细胞)

卵母细胞在此时相进入大生长期，体积进一步增大，直径为258.99~471.75 μm。细胞质迅速增加，细胞核占比逐渐减小。这一时相开始的标志为卵黄泡出现，细胞质由嗜碱性转变为嗜酸性，鞘膜细胞开始形成。

早期的Ⅲ时相卵母细胞胞质外围开始出现卵黄泡 (图版Ⅰ-9)，不着色，光镜下观察认为其内无物质积累，细胞质嗜酸性较前一时期稍有增强，由蓝紫色逐渐变为紫红色，胞质内卵黄核消失，核质着色与Ⅱ时相没有明显区别，仍为紫红色，核膜波曲但不明显，核膜与核质之间仍有大面积空白不着色区域，核质内与核膜边缘均有多个小核仁分布，滤泡细胞外围开始出现零散分布的鞘膜细胞，放射带仍为单层，火红色 (图版Ⅰ-10)。

中期的Ⅲ时相卵母细胞胞质中卵黄泡数量增多 (图版Ⅰ-11)，部分卵黄泡中有嗜酸性物质积累，胞质嗜酸性增强，呈紫红色，核膜波曲，核质着色不变，核膜与核质之间的空白不着色区域缩小并逐渐消失，大小不一的核仁沿核膜分布，核质中的核仁较少。细胞外的鞘膜细胞层完全形成，鞘膜细胞扁平或圆形，滤泡细胞体积增大，逐渐变为圆形或卵圆形。此阶段卵母细胞放射带分为明显的内外2层 (图版Ⅰ-12)，将靠近卵母细胞一侧的放射带称内层放射带，靠近滤泡细胞一侧的放射带称外层放射带，二者着色深浅相似但界限明显。

晚期的Ⅲ时相卵母细胞中卵黄泡增多，3~5层卵黄泡处于胞质外围，其内含大量嗜酸性卵黄物质 (图版Ⅰ-13)，卵黄泡间隙及向内的胞质中还含有许多细小的卵黄颗粒，游离或存在于较小的泡状结构中，并向细胞中央移动，胞质中未被卵黄物质充满的区域仍着紫红色，核膜边缘及核质中仍有大量核仁分布。此时相的卵母细胞外围鞘膜细胞扁平，滤泡细胞体积明显增大，由圆形或卵圆形逐渐变为立方形，内外两层放射带均呈火红色，内层放射带明显较外层宽 (图版Ⅰ-14)。

2.4   卵黄充满时相 (Ⅳ时相卵母细胞)

卵黄充满时相卵母细胞直径为473.64~1 135.02 μm，此阶段卵黄物质逐渐充满胞质并板结形成卵黄小板，细胞核受到挤压，体积逐渐缩小，胞质嗜酸性进一步增强。

早期的Ⅳ时相卵母细胞 (图版Ⅰ-15)中卵黄泡开始减少，仍处于胞质外围，向内为细小卵黄颗粒，多为泡内卵黄，卵黄物质逐渐充满胞质，部分开始板结，胞质着红色。细胞核中核仁物质集中分布于核质中，少量沿核膜分布，核质着紫红色。卵母细胞外围滤泡细胞完全变为立方形，放射带与Ⅲ时相晚期无明显区别 (图版Ⅰ-16)。

中期的Ⅳ时相卵母细胞 (图版Ⅰ-17)卵黄物质积累到达核周，细胞核受到挤压，形状不规则，胞质内卵黄泡大量减少，被挤压至细胞边缘，多数卵黄物质板结形成卵黄小板，着红色，但仍有卵黄颗粒存在于泡状结构中，胞外滤泡细胞仍为立方形，与前期无明显差异，内层放射带明显加宽，着深红色，外层放射带着橘红色 (图版Ⅰ-18)。

晚期的Ⅳ时相卵母细胞卵黄泡逐渐消失，卵黄物质完全板结，在胞质外围可观察到具有一定厚度的皮层小泡，不着色。细胞核开始向一侧偏移，核质浓缩，嗜碱性，着蓝紫色，部分细胞核内仍可见多个细小核仁 (图版Ⅰ-19)。胞外鞘膜层极薄，滤泡细胞体积明显减小，呈扁平或卵圆形，放射带增至最厚，内外两层放射带几乎等宽 (图版Ⅰ-20)。

2.5   成熟卵子 (Ⅴ时相)

成熟卵子直径为1 220.00~1 450.00 μm，此阶段细胞游离，跌入卵巢腔中，切片平面为椭圆形，细胞外围无鞘膜细胞和滤泡细胞包裹，同时，放射带及绒毛膜消失，卵膜凹凸不平，卵周皮质部分着橘红色，与胞内卵黄物质着色明显不同。细胞内卵黄物质形成更大的块状结构，细胞核偏位，核膜破裂。此过程中卵母细胞经第1次减数分裂形成次级卵母细胞，并发育至第2次分裂中期 (图版Ⅰ-21~22)。

3.   讨论

3.1   四川华鳊卵子发生的时相划分

关于鱼类卵子发生的时相划分，已有研究^[12-15]提出了不同的划分标准。由于卵子发生过程是动态连续的，且不同物种卵细胞组织结构有所不同，对于卵细胞的时相划分因研究者的关注点不同而有所差异。本研究参照张耀光等^[16]对长吻 (Leiocassis longirostris)卵母细胞发育的时相划分，以初级卵母细胞形成、胞外滤泡细胞及鞘膜细胞的形成与变化、卵黄核的形成与消失、放射带的形成与变化、卵黄物质积累程度等作为四川华鳊卵子发生时相划分的重要依据，将其分为卵原细胞时相、单层滤泡时相、卵黄泡出现时相、卵黄充满时相和卵母细胞成熟时相，并进一步将中间3个时相细分为早、中、晚3个阶段。与长吻不同的是，四川华鳊在卵原细胞与嗜碱性最强的Ⅱ时相卵母细胞之间还存在一个过渡阶段，为早期的初级卵母细胞，其细胞体积较卵原细胞大，中央大核仁消失并出现多个小核仁，细胞呈弱嗜碱性，因此将其划分为Ⅱ时相早期，并将其作为卵母细胞小生长期开始的标志。本研究还发现，四川华鳊卵巢内卵母细胞的不同步发育，繁殖期间同一雌鱼卵细胞在短时间内能分批多次成熟。显微结果显示，四川华鳊卵子发生过程中当卵黄泡积累至3~5层时，即嗜酸性卵黄物质大量积累于卵黄泡中，此后卵黄泡逐渐减少，卵黄物质向内聚集至核周并充满胞质。其他同步产卵型鱼类如犬首^[17] (Siberian gudgeon)、云南盘^[18] (Disocogobio yunnanensis)、长鳍吻^[19] (Rhinogobio ventralis)等，卵径与四川华鳊相似或稍大，它们的Ⅲ时相卵母细胞内卵黄泡均增加并充满胞质，进入Ⅳ时相后卵黄物质才开始大量积累。稀有鲫^[20] (Gobiocypris rarus)的卵细胞也能在短期内相继成熟，但因其卵径小，约为四川华鳊的1/2，卵黄泡也是先充满胞质后卵黄物质才开始大量积累。值得注意的是，卵胎生鱼类如孔雀鱼^[21] (Poecilia reticulata)、剑尾鱼^[22] (Xiphophorus helleri)等也能在短期内多次繁殖，但其卵黄物质同样是在进入Ⅳ时相后才开始大量积累，经对比发现，这2种鱼的卵黄积累过程中均出现了油滴或油球，并与卵黄颗粒互相融合迅速充满胞质。根据张耀光等^[23]的研究，卵母细胞内分泌泡的形成为细胞体积增大及卵黄物质形成提供了物质基础。笔者认为，四川华鳊卵子发生过程中，Ⅲ时相中后期卵黄泡携带大量嗜酸性卵黄物质，将其运送到细胞中央，进入Ⅳ时相后，细胞内卵黄积累达到一定程度，卵黄泡开始减少并用于细胞生长，随着卵黄物质增多，前期积累的卵黄受到挤压板结并移向核周，卵黄物质的提前积累则使得卵母细胞在快速生长的同时卵黄物质也迅速充满胞质，这在一定程度上为成熟卵子的形成节约了时间，也提示在四川华鳊人工繁殖过程中，当卵巢中有大量卵母细胞进入Ⅲ时相后，需更加关注其发育进程，以免错过最佳催产时间。此外，掌握各时相卵细胞组织特征及发育规律有利于研究过程中的观察描述，对于人工繁殖过程中判断亲鱼是否符合催产条件、卵细胞质量好坏等同样具有重要意义。

3.2   卵黄核

卵黄核 (yolk nucleus)又被称为巴尔比尼氏体 (Balbiani body)或核仁样体 (nucleolus-like body)，一般出现在卵母细胞发育早期^[23-24]。四川华鳊卵黄核在具强嗜碱性的Ⅱ时相中期卵母细胞中出现，进入Ⅲ时相后消失，即卵黄核出现于卵母细胞小生长期，消失于卵黄物质积累之前，这与绝大多数硬骨鱼类^[19-21,25]相同。大量研究表明，卵黄核的主要成分为线粒体，此外还含有高尔基体、滑面内质网、脂滴、多泡体、环形片层等^[23]。王爱民^[26]对莫桑比克罗非鱼 (Oreochromis mossambicus) 的研究表明，线粒体对于卵黄物质的积累有重要作用，大量增殖的线粒体除为卵黄物质积累提供能量外，其外凸形成的同心多层膜结构还为卵黄物质的积累提供了确定场所；张耀光和杨桂枝^[23]也提到，卵黄核中的线粒体大多退化形成具多层同心膜的髓样小体，并成为卵黄物质的积累场所，后期逐渐形成卵黄小板，但仍有一部分线粒体保持正常的结构与功能；刘晓蕾^[27]还观察到，除线粒体外，高尔基体和内质网等也参与了卵黄小板的形成。四川华鳊卵黄核最早出现在核膜外侧，后逐渐迁移至胞质外围并消失，进入Ⅲ时相后，卵黄泡形成，部分卵黄物质开始积累，卵黄物质的跨膜运输需消耗大量能量，并需要膜结构运输卵黄物质，卵黄核中的线粒体、高尔基体等为行使这一功能提供了物质支持。目前关于卵黄核结构与功能的研究较多，而关于其形成与迁移机制的研究甚少，卵黄核的组成成分存在于细胞质中，作用场所在胞质外围，却形成于核膜附近再迁移至外围解体，Dutt等^[28]认为核仁排出物也是卵黄核的组分之一；张贤芳^[29]也发现圆口铜鱼 (Coreius guichenoti)卵子发生过程中，多个线粒体聚集在核仁样体周围形成卵黄核，这提示来自核内的物质可能参与并指导了卵黄核的形成与迁移过程，甚至与线粒体等细胞器的增殖及退化有关。但也有研究^[24,30]显示，核仁排出物的出现时间要晚于卵黄核，仅与卵黄形成有关，卵黄核的形成与迁移是否与核仁排出物有关尚待进一步研究。

3.3   皮层小泡的形成

四川华鳊卵子发生过程中，皮层小泡出现于卵黄积累即将结束、卵黄泡消失的节点。卵黄物质随着卵黄泡的出现开始积累，到Ⅲ时相晚期，卵黄物质即开始大量沉积，细胞核周围逐渐被较小卵黄颗粒充满；Ⅳ时相中期，卵黄泡被挤压至细胞边缘仅剩一层，多数卵黄颗粒以卵黄小板的形式存在于细胞中；Ⅳ时相末卵黄物质积累基本结束，卵黄泡内嗜酸性的卵黄颗粒逐渐减少，密集排列的皮层小泡取代卵黄泡占据胞质外围皮质区，HE染色不着色，成熟卵子中不再有多层小泡排列，光镜下仅可见卵膜凹凸不平，卵周皮质着橘红色。关于皮层小泡的形成，多数研究者认为其来源于卵黄泡。Sleman等^[31]证实，卵黄泡与皮层小泡的结构及内含物在某种程度上均具有一致性；严云勤和徐立滨^[32]在对鲫 (Carassius auratus)卵子发生的研究中没有区分卵黄泡与皮层小泡，统一称为皮层小泡；Bazzoli和Godinho^[33]也认为，随着卵黄物质的沉积，卵黄泡被挤压至卵周皮质并形成皮层小泡，其释放的物质与阻止多精入卵有关^[34]。还有研究者认为，皮层小泡不仅仅是卵黄泡被挤压形成的，还有胞内其他细胞器如高尔基体的膜泡融合形成，其内含卵子发育过程中排出的代谢废物^[35]。四川华鳊皮层小泡仅在Ⅳ时相中期至末期较为明显，而成熟卵子中胞质外围未见明显不着色的皮层小泡。张耀光和杨桂枝^[23]对南方鲇 (Silurus meridionalis)卵子发生的超微结构研究显示，卵成熟时皮层泡演变形成皮层颗粒，笔者推测出现这种情况的可能原因是卵子成熟后，胞内大量细胞器退化，膜泡结构急剧减少，而代谢废物不断堆积，使得皮层小泡内电子致密度不断增大，形成皮层颗粒。