Effects of dietary fishmeal replacement with protein mixtures on growth performance, physiological metabolism and biochemical composition of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis)
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摘要:
文章研究了复合蛋白源替代饲料中不同水平(0%、16.67%、33.33%、50%和66.67%，分别记为饲料1#~5#)的鱼粉对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹成活、生长、生理代谢和生化组成的影响。结果显示：1)随着鱼粉替代水平增加，幼蟹终末体质量、增重率、特定生长率和肝胰腺指数均呈先升后降的趋势，2#组最高(P<0.05)；2)肝胰腺中的谷草转氨酶、谷丙转氨酶活力和丙二醛含量均为4#组最高，而超氧化物歧化酶活力在1#组最高(P<0.05)；血清中的谷丙转氨酶活力在5#组最高，甘油三酯含量和超氧化物歧化酶活力则以4#组最高，而丙二醛含量在2#组最高(P<0.05)；3) 1#组躯体的粗蛋白和粗脂肪含量均显著高于其他组，而总碳水化合物含量在2#组最高(P<0.05)。躯体半胱氨酸含量在4#组最高，而其他氨基酸与总氨基酸含量均在2#组最高(P<0.05)。结果表明，饲料中过高的鱼粉替代水平(33%~67%)会降低中华绒螯蟹幼蟹生长性能和躯体营养物质的积累，对生理代谢产生不良影响，建议中华绒螯蟹幼蟹饲料中复合蛋白源替代鱼粉的比例为16.67%。
Abstract:We investigated the effects of different levels (0%, 16.67%, 33.33%, 50% and 66.67%, represented as Diet 1# to 5# treatments) of fishmeal replacement by protein mixtures on the survival, growth, physiological metabolism and body biochemical composition of juvenile Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). The results show that: 1) the final body mass, weight gain rate, specific growth rate and hepatosomatic index firstly increased and then decreased with increasing dietary fish meal replacement level, and the highest values were detected in Diet 2# treatment (P<0.05). 2) The highest levels of glutamic-oxalacetic transaminase (GOT), glutamic-pyruvic transaminase (GPT) and malondialdehyde in hepatopancreas were detected in Diet 4# treatment, while Diet 1# treatment had the highest activity of superoxide dismutase (SOD) in hepatopancreas (P<0.05). The highest activity of GPT in the serum was detected in Diet 5# treatment, and the highest triglyceride (TG) content and SOD activity were detected in Diet 4# treatment (P<0.05), while the highest malondialdehyde (MDA) content was detected in Diet 2# treatment. 3) The contents of crude protein and crude lipid in the juvenile crab's body in Diet 1# treatment were significantly higher than those in the other treatments, while the highest total carbohydrate content was detected in Diet 2# (P<0.05). For the body amino acids, the highest cysteine (Cys) content was detected in Diet 4# treatment, and the highest contents of other amino acids and total amino acids (TAA) were detected in Diet 2# (P<0.05). In conclusion, excessive dietary fishmeal replacement (33%−67%) can reduce the growth performance and accumulation of nutrients in juvenile crab's body, having a negative effect on physiological metabolism. The appropriate dietary fishmeal replacement level is suggested to be about 20%.
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鱼粉因其氨基酸组成合理、适口性好等诸多优点，被广泛应用于水产饲料的生产。但由于过度捕捞和全球气候变暖等因素导致野生渔业资源减少，全球鱼粉产量不能满足水产养殖业快速发展的需要[1-2]，因此寻找鱼粉蛋白替代源已成为水产动物营养学研究的热点之一[3-4]。目前水产饲料的鱼粉替代源主要包括陆生动物蛋白[5-6]和植物蛋白源[7-8]。陆生动物蛋白源通常存在灰分高、供应不稳定和价格相对较高等问题，植物蛋白源则存在氨基酸组成不平衡、含有抗营养因子和适口性差等缺点，而采用多种混合蛋白源具有营养成分互补、成本低廉和原料来源广泛等优点，因此采用复合蛋白源替代鱼粉能够提高替代效果、减轻对鱼粉的过度依赖，具有良好的应用前景[4]。
发酵豆粕是经微生物发酵后的豆粕，不仅使抗营养因子大大降低，而且将大分子蛋白等分解成更易吸收的小分子肽，大大提高了适口性，但是缺乏赖氨酸和多不饱和脂肪酸，目前已有学者采用发酵豆粕替代凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹饲料中的部分鱼粉[9-10]。猪肉粉和鸡肉粉来源广泛，其粗蛋白含量较高，略高于鱼粉，除蛋氨酸和赖氨酸含量较低外，其他必需氨基酸含量相对平衡[11]。血球蛋白粉的蛋白质含量较高(超过85%)赖氨酸含量较高，但异亮氨酸、胱氨酸和蛋氨酸等较缺乏，适口性差[12]。虾粉的粗蛋白含量、氨基酸及脂肪酸组成与国产鱼粉接近，富含蛋氨酸、赖氨酸等必需氨基酸及二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等必需脂肪酸，且具有较好的诱食性[13]。此外，目前发酵豆粕的价格通常为4 000~6 000元·t–1，猪肉粉、鸡肉粉、喷雾干燥猪血球蛋白粉和虾粉的价格为5 000~7 000元·t–1，而鱼粉价格通常为10 000~12 000元·t–1。因此采用发酵豆粕、猪肉粉、鸡肉粉、喷雾干燥猪血球蛋白粉和虾粉搭配替代鱼粉不仅可以提高氨基酸的平衡性，还可降低饲料成本，对水产养殖业的可持续发展具有重要的现实意义。
中华绒螯蟹俗称河蟹，是我国重要的经济养殖蟹类之一，2016年全国养殖总产量高达81.2×104 t[14]。采用配合饲料养殖中华绒螯蟹具有营养平衡、投喂方便和水体污染小等优点，随着中华绒螯蟹池塘养殖的推广和配合饲料的逐渐普及[15]，国内中华绒螯蟹配合饲料产量逐年上升；鱼粉供给不足已经成为优质河蟹配合饲料生产和推广的重要瓶颈之一，因此开展中华绒螯蟹配合饲料中的鱼粉替代势在必行。目前，已有部分采用单一植物蛋白源替代中华绒螯蟹配合饲料中鱼粉的报道[16-18]，但尚未见采用复合蛋白源替代鱼粉的研究。鉴于此，本文采用复合蛋白源(发酵豆粕、猪肉粉、鸡肉粉、喷雾干燥血球蛋白粉和虾粉)替代饲料中的鱼粉，探究饲料中鱼粉的替代水平对中华绒螯蟹幼蟹生长、生理代谢和生化组成的影响，以期为幼蟹饲料配制和鱼粉替代源的开发等提供一定的理论依据和实践参考。
1. 材料与方法
1.1 实验设计与饲料
采用发酵豆粕、猪肉粉、鸡肉粉、喷雾干燥猪血球蛋白粉和虾粉配制成复合蛋白源，使其粗蛋白和粗脂肪含量与鱼粉接近。采用豆粕、菜籽粕、鱼粉和复合蛋白源等作为蛋白源，鱼油、猪油和豆油等作为脂肪源配制5种等氮等脂饲料(分别记为饲料1#~5#)，使饲料中复合蛋白源替代鱼粉的比例分别为0%、16.67%、33.33%、50%和66.67%。饲料配制之前，所有原料粉碎后过80目筛，按照饲料配方(表1)中各原料的比例混匀后制成粒径2 mm，长度4~5 mm的沉性膨化饲料。在室温条件下风干后，置于–20 ℃冰箱密封保存备用。实验饲料的常规营养成分和氨基酸组成见表2。
表 1 实验饲料配方Table 1. Formulations of five experimental diets% 原料
ingredient饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#豆粕 soybean meal 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 菜粕 rapeseed meal 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 鱼粉 fish meal 24.00 20.00 16.00 12.00 8.00 复合蛋白源 protein mixtures 0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 乌贼膏 squid meal 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 鱼溶浆 fish slurry 5.30 5.30 5.30 5.30 5.30 啤酒酵母粉 brewer's yeast 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 螺旋藻粉 spirulina powder 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 面粉 wheat flour 17.48 17.48 17.48 17.48 17.48 维生素预混料1 vitamin premix 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 矿物质预混料2 mineral premix 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 氯化胆碱 (50%) choline chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 甜菜碱 betaine 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 维生素C (35%) vitamin C 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 斑螯黄 (10%) canthaxanthin 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 大豆磷脂油 soy lecithin 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 鱼油 fish oil 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 猪油 pork lard 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 豆油 soybean oil 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 注：1. 维生素预混料(mg·kg–1 饲料)：维生素A 125；维生素D3 30；维生素E 1 050；维生素K3 35.4；维生素B1 100；维生素B2 150；维生素B6 150；维生素B12 0.2；维生素C 700；生物素 4；D - 泛酸钙 250；叶酸 25；烟酰胺 300。2. 矿物质预混料(mg·kg–1 饲料)：一水硫酸亚铁 200；五水硫酸铜 96；一水硫酸锌 360；一水硫酸锰 120；一水硫酸镁 240；磷酸二氢钾 4 200；磷酸二氢钠 500；碘化钾 5.4；六水氯化钴 2.1；亚硒酸钠 3 Note: 1. vitamin mixture (mg·kg–1 diet): VA125; ${{\rm{V}}_{\rm{D}}}_{_{\rm{3}}}$ 30; VE 1 050; $ {{\rm{V}}_{\rm{K}}}_{_{\rm{3}}}$ 35.4; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{1}}}$ 100; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{2}}}$ 150; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{6}}}$ 150; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{12}}}$ 0.2; VC 700; biotin 4; D-calcium pantothenate 250; folic acid 25; nicotinamide 300; 2. mineral mixture (mg·kg–1 diet): FeSO4·H2O 200; CuSO4·5H2O 96; ZnSO4·H2O 360; MnSO4·H2O 120; MgSO4·H2O 240; KH2PO4 4 200; NaH2PO4 500; KI 5.4; CoCl2·6H2O 2.1; Na2SeO3 3 表 2 实验饲料常规营养成分与氨基酸组成Table 2. Proximate composition and amino acid composition of five experimental diets项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#常规营养成分 (干质量)/% proximate
composition (dry mass)水分 moisture 8.71 9.38 9.08 9.17 9.35 粗蛋白 crude protein 37.47 37.02 37.11 37.46 37.26 粗脂肪 crude lipid 10.99 11.01 11.22 11.24 11.60 灰分 ash 8.77 8.63 8.49 8.19 7.94 总碳水化合物 total carbohydrate 22.18 22.23 22.40 22.56 22.72 氨基酸组成 (干质量)/mg·g–1 amino acid
composition (dry mass)苏氨酸 Thr 16.85 15.95 15.95 15.45 15.25 缬氨酸 Val 18.35 18.25 18.75 18.83 19.7 异亮氨酸 Ile 16.25 15.25 15.35 14.82 14.5 亮氨酸 Leu 29.80 28.95 29.95 29.26 30.15 苯丙氨酸 Phe 17.60 17.95 16.65 16.92 17.15 赖氨酸 Lys 27.30 25.40 25.75 24.57 24.10 色氨酸 Trp 7.35 7.14 6.64 6.80 6.92 蛋氨酸 Met 7.60 6.60 6.95 6.23 6.35 组氨酸 His 14.70 13.95 14.40 13.91 14.20 精氨酸 Arg 24.00 23.05 23.70 22.87 23.00 总必需氨基酸 ∑EAA 179.80 172.49 174.09 169.66 171.32 酪氨酸 Tyr 13.00 12.90 12.10 11.91 11.70 半胱氨酸 Cys 6.70 6.75 6.90 6.84 6.75 天门冬氨酸 Asp 37.30 35.95 36.55 35.57 35.95 丝氨酸 Ser 18.50 18.00 18.40 17.99 18.60 谷氨酸 Glu 67.45 63.15 64.75 62.79 62.60 脯氨酸 Pro 17.95 16.50 18.35 18.63 19.45 丙氨酸 Ala 20.15 20.35 21.45 20.91 22.55 甘氨酸 Gly 22.15 23.35 21.55 20.98 21.55 总非必需氨基酸 ∑NEAA 203.20 196.95 200.05 195.62 199.15 总氨基酸 TAA 383.00 369.44 374.14 365.28 370.47 必需氨基酸/非必需氨基酸 EAA/NEAA 0.88 0.88 0.87 0.87 0.86 1.2 实验蟹的养殖管理
实验用蟹均取自上海海洋大学崇明基地，挑选附肢健全、活力较好，处于蜕壳间期，初始体质量为(1.59±0.02) g的幼蟹用于养殖实验。在室内循环水的聚氯乙烯(PVC)水槽(长×宽×高=18 m×0.8 m×0.3 m)中放180个四周和底部有小孔的盒子(长×宽×高为28 cm×21 cm×17.5 cm，水深12 cm)，将180只蟹随机放入盒中单独养殖，在盒底放置瓦片作为隐蔽物，分为5个饲料组，每个饲料组重复36只蟹。暂养时间为5 d，暂养期间投喂商业饲料。养殖期间，每日16:00投喂实验饲料，投喂量约占总体质量的2%~3%，隔日用虹吸法吸出粪便和残饵。期间，24 h充氧，采用40 W日光灯作为光源(12 h光照+12 h黑暗)，水温>20 ℃；pH 7.0~9.0；平均溶解氧质量浓度>4 mg·L–1；氨氮质量浓度<0.5 mg·L–1；亚硝酸盐质量浓度<0.15 mg·L–1。实验过程中测量并记录每只蟹蜕壳后3~5 d的体质量，待80%以上个体完成第2次蜕壳后即停止实验。
1.3 样品和数据采集
实验过程中，将完成2次蜕壳后3~7 d左右处于蜕壳间期的幼蟹取出。用吸水纸擦干体表水分后用电子天平(精确度=0.01 g)称质量。将幼蟹放在冰上麻醉后，用1.0 mL无菌注射器从第3支步足基部抽取0.5 mL血淋巴样品装于1.5 mL离心管中，于– 40 ℃保存；沿蟹壳侧面将蟹壳与躯体分离，然后直接解剖取出肝胰腺并准确称质量。将肝胰腺和去除附肢的躯体分别装入自封袋中于– 40 ℃中保存备用。各组幼蟹的成活率(survival rate, SR)、增重率(weight gain rate, WGR)、特定生长率(specific growth rate, SGR)、蜕皮间隔 [intermolt duration, ID，为第二次蜕壳日期与第一次蜕壳日期的间隔(d)] 和肝胰腺指数(hepatosomatic index, HSI)按以下列公式进行计算：
$$ \begin{array}{c} {\rm{SR}} = {N_2} \times N_1^{ - 1} \times 100\% \\ {\rm{WGR}} = ({M_2} - {M_1}) \times M_1^{ - 1} \times 100\% \\ {\rm{SGR}}\left( {\% \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}} \right) = 100 \times (\ln {M_2} - \ln {M_1}){\rm{ }} \times {T^{ - 1}}\\ {\rm{HSI}} = {M_{\rm{H}}} \times M_{\rm{C}}^{ - 1} \times 100\% \end{array} $$ 其中N2为实验结束时各组幼蟹成活数量；N1为各组幼蟹初始数量；M2为实验结束时各组幼蟹的体质量；M1为幼蟹初始体质量；T为养殖时间；MH为肝胰腺质量；MC为幼蟹体质量。
1.4 样品前处理和生理代谢指标测定
由于幼蟹肝胰腺和血淋巴样品量较少，为了满足分析测试需求，每组随机取16只蟹的肝胰腺和血淋巴样品，每4只蟹的样品合为一个样本，每组分别各有4个肝胰腺和血淋巴样本，用于后续生理代谢指标的测定。参考赵磊等[19]的方法制备肝胰腺匀浆液和血清，于– 40 ℃保存备用。采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和甘油三酯(TG)。
1.5 生化组成分析
生化组成测定前，从每组随机取16只幼蟹的躯体，每4只蟹的躯体随机合为1个样本。采用105 ℃烘干法[20]测定饲料的水分含量，幼蟹躯体的水分含量采用冷冻干燥法进行测定。根据AOAC[20]的标准方法测定饲料和幼蟹躯体中的粗蛋白和粗灰分含量。按照Folch等[21]的方法提取饲料和幼蟹躯体中的总脂并测定其含量。饲料和幼蟹躯体的总碳水化合物含量采用苯酚-硫酸法进行测定[22]。按照Chen等[23]的方法测定饲料和幼蟹躯体中的总氨基酸和色氨酸含量，其中总氨基酸采用酸水解法测定，而色氨酸采用碱水解法测定。半胱氨酸含量采用过甲酸氧化水解法进行测定[24]。
1.6 数据分析及统计
采用SPSS 16.0软件对实验数据进行统计分析，所有数据均以“平均值±标准误(
$\overline X \pm {\rm SE}$ )”表示。采用Levene's法对所有数据进行方差齐性检验，当不满足齐性时对百分比数据进行反正弦或平方根处理。采用One-Way ANOVA对实验结果进行方差分析，采用Tukey's进行多重比较，取P<0.05为差异显著。2. 结果
2.1 复合蛋白源替代鱼粉对幼蟹成活率和生长性能的影响
各饲料组幼蟹的成活率均在60%左右。幼蟹终末体质量、增重率和特定生长率均为饲料2#组最高(表3)，且随着鱼粉替代水平增加均呈先上升后下降的趋势。幼蟹蜕皮间隔随鱼粉替代水平的提高呈延长趋势，但各组间无显著性差异。饲料1#和2#组幼蟹的HSI显著高于饲料3#和4#组(P<0.05)，但与饲料5#组无显著性差异。
表 3 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹生长、蜕壳和肝胰腺指数的影响Table 3. Effect of dietary fishmeal replacement with protein mixtures on growth, molt and hepatosomatic index of juvenile E. sinensis项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#初始体质量/g initial body mass 1.60±0.02 1.60±0.03 1.58±0.04 1.59±0.03 1.60±0.03 终末体质量/g final body mass 3.40±0.13ab 3.63±0.26a 3.13±0.22ab 3.07±0.12ab 2.97±0.10b 增重率/% WGR 112.72±4.70a 126.26 ±2.73a 98.03±5.64b 92.62±5.91b 85.61±3.46b 特定生长率/%·d–1 SGR 1.19±0.09ab 1.26±0.10a 1.09±0.10ab 0.96±0.09ab 0.88±0.04b 蜕皮间隔/d intermolt duration 34.43±1.72 34.10±1.77 36.00±2.06 38.38±1.12 38.80±2.05 肝胰腺指数/% hepatosomatic index 9.80±0.74a 9.99±0.60a 6.88±0.85b 6.70±0.86b 8.02±0.78ab 注：同行数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下表同此
Notes: Values with different letters within the same row are significantly different (P<0.05). The same case in the following tables.2.2 复合蛋白源替代鱼粉对幼蟹肝胰腺和血清生理代谢指标的影响
饲料4#组幼蟹肝胰腺谷草转氨酶(GOT)与饲料5#组无显著差异，但显著高于其他3组(P<0.05，图1-a)，饲料4#组幼蟹肝胰腺GPT活力和MDA含量显著高于其他组(P<0.05，图1-b，图1-d)。饲料1#组肝胰腺中的SOD活力显著高于其他组(P<0.05)，其余各组间差异不显著(图1-c)。
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图 1 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺生理代谢指标的影响柱形图数值为平均值，方柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)；后图同此Figure 1. Effect of fish meal replacement by protein mixtures on physiological indices in hepatopancreas of juvenile E. sinensisThe data are average values. Values with different letters are significantly different (P<0.05). The same case in the following figure.饲料5#组血清中的GPT活力显著高于其他组(P<0.05)，其余各组间差异不显著(图2-a)。饲料4#组血清中的TG含量显著高于饲料1#组(P<0.05)，但与其他3组差异不显著(图2-b)。饲料4#组幼蟹血清的SOD活力显著高于饲料1#和5#组(P<0.05，图2-c)，并呈先上升后下降的趋势。饲料2#组血清中的MDA含量显著高于其他组(P<0.05)，饲料5#组的MDA含量最低 (图2-d)。
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图 2 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹血清生理代谢指标的影响Figure 2. Effect of fish meal replacement by protein mixtures on physiological indices in serum of juvenile E. sinensis2.3 复合蛋白源替代鱼粉对幼蟹躯体常规生化成分和氨基酸的影响
幼蟹躯体的粗蛋白含量在饲料1#组最高，且显著高于其他组(P<0.05)，饲料3#组的粗蛋白含量最低(表4)。饲料1#组幼蟹躯体粗脂肪含量显著高于其他组(P<0.05)，并随饲料中鱼粉替代水平的提高呈显著降低趋势。饲料2#组的躯体总碳水化合物含量显著高于饲料4#和5#组(P<0.05)，但与其余两组间差异不显著。
表 4 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹躯体常规生化指标的影响 (湿质量)Table 4. Effect of fish meal replacement by protein mixtures on proximate composition in body of juvenile E. sinensis (wet mass)% 项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#水分 moisture 75.11±1.57 75.22±1.05 77.69±1.12 78.35±1.18 76.33±0.69 粗蛋白 crude protein 11.51±0.14a 11.04±0.13b 9.30±0.14d 9.77±0.10c 9.70±0.19cd 粗脂肪 crude lipid 2.03±0.20a 1.49±0.05b 1.42±0.12b 1.33±0.06bc 0.97±0.13c 总碳水化合物 total carbohydrate 0.90±0.09a 0.91±0.04a 0.74±0.00ab 0.58±0.06b 0.67±0.02b 幼蟹躯体的天门冬氨酸(Asp)、苏氨酸(Thr)、丝氨酸(Ser)、谷氨酸(Glu)、脯氨酸(Pro)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)、赖氨酸(Lys)、组氨酸(His)、精氨酸(Arg)、总必需氨基酸含量(EAA)、总非必需氨基酸(NEAA)和总氨基酸含量(TAA)均为饲料2#组最高，饲料4#组最低(表5)；饲料1#~3#组幼蟹躯体的EAA/TAA显著高于饲料4#和5#组。
表 5 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹躯体氨基酸的影响 (湿质量)Table 5. Effect of fish meal replacement by protein mixtures on amino acids in body of juvenile E. sinensis (wet mass)mg·g–1 项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#苏氨酸 Thr 4.70±0.09b 5.30±0.07a 4.69±0.03b 3.54±0.21c 3.83±0.21c 缬氨酸 Val 4.73±0.11b 5.27±0.09a 4.63±0.03b 3.49±0.22c 3.60±0.19c 异亮氨酸 Ile 4.00±0.09b 4.50±0.08a 3.97±0.03b 2.91±0.18c 2.97±0.15c 亮氨酸 Leu 6.88±0.14b 7.82±0.12a 7.05±0.05b 5.14±0.32c 5.22±0.29c 苯丙氨酸 Phe 4.33±0.08b 4.87±0.08a 4.24±0.03b 3.17±0.20c 3.34±0.18c 赖氨酸 Lys 6.90±0.14b 7.86±0.13a 7.12±0.04b 5.16±0.32c 5.37±0.29c 蛋氨酸 Met 2.28±0.04b 2.68±0.04a 2.41±0.02b 1.72±0.14c 1.72±0.09c 组氨酸 His 2.47±0.05b 2.83±0.04a 2.40±0.01b 1.75±0.11c 1.93±0.11c 精氨酸 Arg 8.34±0.16b 9.23±0.14a 7.90±0.06b 5.96±0.32c 6.43±0.36c 总必需氨基酸 ∑EAA 44.62±0.90b 50.37±0.80a 44.42±0.31b 32.85±2.07c 34.41±1.87c 酪氨酸 Tyr 4.22±0.09b 4.73±0.07a 4.14±0.03b 3.07±0.20c 3.27±0.19c 半胱氨酸 Cys 0.27±0.00ab 0.31±0.05ab 0.20±0.00bc 0.33±0.06a 0.13±0.01c 天门冬氨酸 Asp 10.23±0.19b 11.55±0.18a 10.30±0.07b 7.73±0.48c 8.35±0.45c 丝氨酸 Ser 4.60±0.08b 5.18±0.07a 4.65±0.04b 3.58±0.22c 3.84±0.22c 谷氨酸 Glu 15.27±0.30b 17.27±0.25a 15.43±0.11b 11.55±0.70c 12.39±0.67c 脯氨酸 Pro 3.95±0.10b 4.55±0.01a 3.87±0.00b 2.93±0.17c 3.07±0.15c 丙氨酸 Ala 5.93±0.12b 6.83±0.09a 5.83±0.04b 4.52±0.29c 4.67±0.26c 甘氨酸 Gly 6.37±0.12ab 6.89±0.10a 6.25±0.05ab 5.27±0.33c 5.68±0.32bc 总非必需氨基酸 ∑NEAA 50.65±0.99b 57.30±0.70a 50.69±0.33b 38.98±2.45c 41.42±2.24c 总氨基酸 TAA 95.27±1.89b 107.67±1.50a 95.11±0.64b 71.77±4.57c 75.84±4.11c 必需氨基酸/总氨基酸 EAA/TAA 0.47±0.00a 0.47±0.00a 0.47±0.00a 0.46±0.00b 0.45±0.00c 3. 讨论
3.1 复合蛋白源替代鱼粉对幼蟹成活和生长的影响
本实验中，饲料中鱼粉替代对中华绒螯蟹幼蟹的成活率无显著影响，这说明饲料中鱼粉含量对幼蟹的成活率无显著影响，与先前的研究结果[25]类似。幼蟹终末体质量、增重率和特定生长率均为饲料2#组最高，并随着鱼粉替代水平增加均呈先上升后下降的趋势，表明鱼粉替代水平高于50% (基础饲料中鱼粉含量为24%)时，幼蟹的生长受到了抑制。Pan等[26]研究表明甲壳动物的生长、蜕壳受饲料营养组成的影响，当营养物质摄入不足时，甲壳动物蜕皮间隔会延长且蜕壳后的体质量增长率明显下降[27]。本研究中，尽管各组幼蟹蜕皮间隔无显著性差异，但随饲料中鱼粉替代水平的升高呈延长趋势，这与沈城等[28]的研究结果较为相似，反映出饲料中过高的鱼粉替代水平可能会对幼蟹的蜕壳产生不良影响。分析其可能的原因为：1) 复合蛋白源中的发酵豆粕、猪肉粉、鸡肉粉和虾粉等原料中的蛋白和氨基酸消化率均低于鱼粉[29]，因此高比例的鱼粉替代水平会降低幼蟹对饲料蛋白和氨基酸的利用率，从而影响其生长和蜕壳；2) 饲料中高比例的鱼粉替代会降低饲料部分必需氨基酸的含量(表2)，从而影响饲料利用效率和幼蟹的生长，这与对凡纳滨对虾的研究结果[30]相类似；3) 复合蛋白源中的发酵豆粕可能残留一定量的单宁、植酸、皂甙、异黄酮和大豆凝集素等抗营养因子，从而影响幼蟹对营养物质的消化利用[31]。
肝胰腺是甲壳动物消化和存储营养物质的重要器官，HSI的大小在一定程度上反映了肝胰腺营养物质的积累情况[19,32]。本研究中，随着饲料替代水平的升高(饲料1#~4#组)，HSI呈下降趋势，其可能的原因是复合蛋白源中鸡肉粉、发酵豆粕和血粉等原料的蛋白质、氨基酸和脂肪消化率低于鱼粉[29,33]，影响肝胰腺中营养物质的积累，从而导致HSI降低。然而，饲料5#组幼蟹HSI相对饲料3#和4#组略微升高，其可能原因是猪肉粉和鸡肉粉的饱和脂肪酸含量比鱼粉高[34]，当猪肉粉和鸡肉粉添加比例过高时，饲料中PUFA含量明显降低，从而导致HSI略有上升[32,35]。
3.2 复合蛋白源替代鱼粉对幼蟹生理代谢的影响
GOT和GPT是水生动物体内最重要的2种转氨酶，在动物体氨基酸分解和合成中起着重要作用，其活性大小反映了氨基酸的代谢强度[36]。这2种酶主要存在于肝脏中，血清中其活性通常很低，只有当组织细胞受损时才会释放到血液中。本实验中，饲料5#组血清中的GPT活力显著高于其他组，这说明过高的鱼粉替代水平会对幼蟹的肝脏造成不良影响。血清中的脂质代谢指标可在一定程度上反映中华绒螯蟹体内的脂质代谢情况[37]。本研究中，饲料2#~5#组幼蟹血清中的TG含量明显高于饲料1#组，这可能是由于复合蛋白源中的猪肉粉和鸡肉粉中含有较多饱和脂肪酸，从而导致2#~5#组饲料中的饱和脂肪酸含量较高，饲料中较高的饱和脂肪酸容易导致血清TG含量的升高[38]，其具体原因还有待进一步研究。
SOD是生物体内重要的抗氧化酶之一，可清除机体中过多的氧自由基，从而起到保护细胞免受损伤的作用，其活力的大小反映了体内氧自由基水平的高低。本研究中，饲料1#组(对照组)幼蟹肝胰腺中的SOD活力显著高于其他组，这可能是由于饲料1#组肝胰腺总脂含量较高，更容易受到氧自由基的攻击，因此机体需提高SOD活力以清除体内过多的自由基，降低其对组织的危害[39-40]；而幼蟹血淋巴中的SOD活力则随饲料中鱼粉替代水平的增加而升高，这可能与血淋巴中逐渐上升的脂质含量(如TG)有关。MDA是细胞脂质氧化的代谢产物，其含量高低显示了脂质的过氧化程度[37]。本研究发现，当饲料中的鱼粉替代水平超过50%时(饲料4#和5#组)，幼蟹肝胰腺中的MDA含量显著高于其他组，其可能原因是鱼粉含有一定量的类胡萝卜素和硒等抗氧化成分[41]，高比例替代后则会降低机体应对氧化胁迫的能力，从而导致肝胰腺中MDA含量的升高。
3.3 复合蛋白源替代鱼粉对幼蟹常规生化成分和氨基酸组成的影响
水产动物的生化组成与其饵料的营养成分密切相关，水产动物的体成分也间接反映了其饵料质量的优劣情况[4,18]。本研究结果显示，高比例的鱼粉替代水平(饲料3#~5#组)会降低幼蟹躯体的粗蛋白含量，这与对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)[42]和杂交鳢(Channa sp.)[43]的研究结果相似，这可能是由于复合蛋白源所含的发酵豆粕、猪肉粉、鸡肉粉和虾粉等原料中蛋白质和氨基酸的消化率低于鱼粉，因此高比例鱼粉替代会降低幼蟹对蛋白质和氨基酸的利用率，从而影响机体蛋白质和氨基酸的沉积率[29]。此外，复合蛋白源中的发酵豆粕可能残余一定量的抗营养因子，从而影响幼蟹对营养物质的消化和利用[31]。在本实验中，幼蟹躯体粗脂肪含量也随鱼粉替代水平升高而下降，这与对镜鲤(Cyprinus carpio var. Specularis)的研究结果相似[4]，分析其原因为：1)随着鱼粉替代水平的升高，植物蛋白源比例逐渐升高，由于植物蛋白源中非淀粉性多糖和低聚糖含量较高，导致脂肪的消化吸收率下降，从而影响了脂肪在幼蟹躯体的积累[44-45]；2)可能是由于复合蛋白源中的鸡肉粉和猪肉粉等原料的粗脂肪消化率低于鱼粉[33]]，从而降低了幼蟹对饲料脂肪的利用率。水产动物组织中的氨基酸组成在一定程度上反映了其对饲料蛋白质的利用程度[45-46]。本研究中，饲料2#组幼蟹躯体中的大部分氨基酸与总氨基酸含量均显著高于其他组，这可能是由于饲料中适宜的鱼粉替代水平(16.7%)提高了饲料中氨基酸的平衡性，从而增强了幼蟹对氨基酸的利用率和沉积率。
综上，中华绒螯蟹幼蟹饲料中采用复合蛋白源(发酵豆粕、猪肉粉、鸡肉粉和血球蛋白粉)可以替代16.67%的鱼粉，过高比例的鱼粉替代会抑制幼蟹的生长，降低躯体蛋白质、氨基酸、脂肪和碳水化合物等营养物质的积累，对肝胰腺和血淋巴的生理代谢产生不良影响。
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图 1 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺生理代谢指标的影响
柱形图数值为平均值，方柱上不同字母表示差异显著(P<0.05)；后图同此
Figure 1. Effect of fish meal replacement by protein mixtures on physiological indices in hepatopancreas of juvenile E. sinensis
The data are average values. Values with different letters are significantly different (P<0.05). The same case in the following figure.
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图 2 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹血清生理代谢指标的影响
Figure 2. Effect of fish meal replacement by protein mixtures on physiological indices in serum of juvenile E. sinensis
表 1 实验饲料配方
Table 1 Formulations of five experimental diets
% 原料
ingredient饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#豆粕 soybean meal 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 菜粕 rapeseed meal 14.00 14.00 14.00 14.00 14.00 鱼粉 fish meal 24.00 20.00 16.00 12.00 8.00 复合蛋白源 protein mixtures 0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 乌贼膏 squid meal 4.00 4.00 4.00 4.00 4.00 鱼溶浆 fish slurry 5.30 5.30 5.30 5.30 5.30 啤酒酵母粉 brewer's yeast 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 螺旋藻粉 spirulina powder 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 面粉 wheat flour 17.48 17.48 17.48 17.48 17.48 维生素预混料1 vitamin premix 0.20 0.20 0.20 0.20 0.20 矿物质预混料2 mineral premix 0.25 0.25 0.25 0.25 0.25 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 氯化胆碱 (50%) choline chloride 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 甜菜碱 betaine 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 维生素C (35%) vitamin C 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 斑螯黄 (10%) canthaxanthin 0.02 0.02 0.02 0.02 0.02 大豆磷脂油 soy lecithin 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 鱼油 fish oil 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 猪油 pork lard 1.50 1.50 1.50 1.50 1.50 豆油 soybean oil 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 注：1. 维生素预混料(mg·kg–1 饲料)：维生素A 125；维生素D3 30；维生素E 1 050；维生素K3 35.4；维生素B1 100；维生素B2 150；维生素B6 150；维生素B12 0.2；维生素C 700；生物素 4；D - 泛酸钙 250；叶酸 25；烟酰胺 300。2. 矿物质预混料(mg·kg–1 饲料)：一水硫酸亚铁 200；五水硫酸铜 96；一水硫酸锌 360；一水硫酸锰 120；一水硫酸镁 240；磷酸二氢钾 4 200；磷酸二氢钠 500；碘化钾 5.4；六水氯化钴 2.1；亚硒酸钠 3 Note: 1. vitamin mixture (mg·kg–1 diet): VA125; ${{\rm{V}}_{\rm{D}}}_{_{\rm{3}}}$ 30; VE 1 050; $ {{\rm{V}}_{\rm{K}}}_{_{\rm{3}}}$ 35.4; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{1}}}$ 100; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{2}}}$ 150; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{6}}}$ 150; ${{\rm{V}}_{\rm{B}}}_{_{\rm{12}}}$ 0.2; VC 700; biotin 4; D-calcium pantothenate 250; folic acid 25; nicotinamide 300; 2. mineral mixture (mg·kg–1 diet): FeSO4·H2O 200; CuSO4·5H2O 96; ZnSO4·H2O 360; MnSO4·H2O 120; MgSO4·H2O 240; KH2PO4 4 200; NaH2PO4 500; KI 5.4; CoCl2·6H2O 2.1; Na2SeO3 3 
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表 2 实验饲料常规营养成分与氨基酸组成
Table 2 Proximate composition and amino acid composition of five experimental diets
项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#常规营养成分 (干质量)/% proximate
composition (dry mass)水分 moisture 8.71 9.38 9.08 9.17 9.35 粗蛋白 crude protein 37.47 37.02 37.11 37.46 37.26 粗脂肪 crude lipid 10.99 11.01 11.22 11.24 11.60 灰分 ash 8.77 8.63 8.49 8.19 7.94 总碳水化合物 total carbohydrate 22.18 22.23 22.40 22.56 22.72 氨基酸组成 (干质量)/mg·g–1 amino acid
composition (dry mass)苏氨酸 Thr 16.85 15.95 15.95 15.45 15.25 缬氨酸 Val 18.35 18.25 18.75 18.83 19.7 异亮氨酸 Ile 16.25 15.25 15.35 14.82 14.5 亮氨酸 Leu 29.80 28.95 29.95 29.26 30.15 苯丙氨酸 Phe 17.60 17.95 16.65 16.92 17.15 赖氨酸 Lys 27.30 25.40 25.75 24.57 24.10 色氨酸 Trp 7.35 7.14 6.64 6.80 6.92 蛋氨酸 Met 7.60 6.60 6.95 6.23 6.35 组氨酸 His 14.70 13.95 14.40 13.91 14.20 精氨酸 Arg 24.00 23.05 23.70 22.87 23.00 总必需氨基酸 ∑EAA 179.80 172.49 174.09 169.66 171.32 酪氨酸 Tyr 13.00 12.90 12.10 11.91 11.70 半胱氨酸 Cys 6.70 6.75 6.90 6.84 6.75 天门冬氨酸 Asp 37.30 35.95 36.55 35.57 35.95 丝氨酸 Ser 18.50 18.00 18.40 17.99 18.60 谷氨酸 Glu 67.45 63.15 64.75 62.79 62.60 脯氨酸 Pro 17.95 16.50 18.35 18.63 19.45 丙氨酸 Ala 20.15 20.35 21.45 20.91 22.55 甘氨酸 Gly 22.15 23.35 21.55 20.98 21.55 总非必需氨基酸 ∑NEAA 203.20 196.95 200.05 195.62 199.15 总氨基酸 TAA 383.00 369.44 374.14 365.28 370.47 必需氨基酸/非必需氨基酸 EAA/NEAA 0.88 0.88 0.87 0.87 0.86
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表 3 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹生长、蜕壳和肝胰腺指数的影响
Table 3 Effect of dietary fishmeal replacement with protein mixtures on growth, molt and hepatosomatic index of juvenile E. sinensis
项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#初始体质量/g initial body mass 1.60±0.02 1.60±0.03 1.58±0.04 1.59±0.03 1.60±0.03 终末体质量/g final body mass 3.40±0.13ab 3.63±0.26a 3.13±0.22ab 3.07±0.12ab 2.97±0.10b 增重率/% WGR 112.72±4.70a 126.26 ±2.73a 98.03±5.64b 92.62±5.91b 85.61±3.46b 特定生长率/%·d–1 SGR 1.19±0.09ab 1.26±0.10a 1.09±0.10ab 0.96±0.09ab 0.88±0.04b 蜕皮间隔/d intermolt duration 34.43±1.72 34.10±1.77 36.00±2.06 38.38±1.12 38.80±2.05 肝胰腺指数/% hepatosomatic index 9.80±0.74a 9.99±0.60a 6.88±0.85b 6.70±0.86b 8.02±0.78ab 注：同行数据不同小写字母表示差异显著(P<0.05)；下表同此
Notes: Values with different letters within the same row are significantly different (P<0.05). The same case in the following tables.
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表 4 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹躯体常规生化指标的影响 (湿质量)
Table 4 Effect of fish meal replacement by protein mixtures on proximate composition in body of juvenile E. sinensis (wet mass)
% 项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#水分 moisture 75.11±1.57 75.22±1.05 77.69±1.12 78.35±1.18 76.33±0.69 粗蛋白 crude protein 11.51±0.14a 11.04±0.13b 9.30±0.14d 9.77±0.10c 9.70±0.19cd 粗脂肪 crude lipid 2.03±0.20a 1.49±0.05b 1.42±0.12b 1.33±0.06bc 0.97±0.13c 总碳水化合物 total carbohydrate 0.90±0.09a 0.91±0.04a 0.74±0.00ab 0.58±0.06b 0.67±0.02b
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表 5 复合蛋白源替代鱼粉对中华绒螯蟹幼蟹躯体氨基酸的影响 (湿质量)
Table 5 Effect of fish meal replacement by protein mixtures on amino acids in body of juvenile E. sinensis (wet mass)
mg·g–1 项目
item饲料 1#
Diet 1#饲料 2#
Diet 2#饲料 3#
Diet 3#饲料 4#
Diet 4#饲料 5#
Diet 5#苏氨酸 Thr 4.70±0.09b 5.30±0.07a 4.69±0.03b 3.54±0.21c 3.83±0.21c 缬氨酸 Val 4.73±0.11b 5.27±0.09a 4.63±0.03b 3.49±0.22c 3.60±0.19c 异亮氨酸 Ile 4.00±0.09b 4.50±0.08a 3.97±0.03b 2.91±0.18c 2.97±0.15c 亮氨酸 Leu 6.88±0.14b 7.82±0.12a 7.05±0.05b 5.14±0.32c 5.22±0.29c 苯丙氨酸 Phe 4.33±0.08b 4.87±0.08a 4.24±0.03b 3.17±0.20c 3.34±0.18c 赖氨酸 Lys 6.90±0.14b 7.86±0.13a 7.12±0.04b 5.16±0.32c 5.37±0.29c 蛋氨酸 Met 2.28±0.04b 2.68±0.04a 2.41±0.02b 1.72±0.14c 1.72±0.09c 组氨酸 His 2.47±0.05b 2.83±0.04a 2.40±0.01b 1.75±0.11c 1.93±0.11c 精氨酸 Arg 8.34±0.16b 9.23±0.14a 7.90±0.06b 5.96±0.32c 6.43±0.36c 总必需氨基酸 ∑EAA 44.62±0.90b 50.37±0.80a 44.42±0.31b 32.85±2.07c 34.41±1.87c 酪氨酸 Tyr 4.22±0.09b 4.73±0.07a 4.14±0.03b 3.07±0.20c 3.27±0.19c 半胱氨酸 Cys 0.27±0.00ab 0.31±0.05ab 0.20±0.00bc 0.33±0.06a 0.13±0.01c 天门冬氨酸 Asp 10.23±0.19b 11.55±0.18a 10.30±0.07b 7.73±0.48c 8.35±0.45c 丝氨酸 Ser 4.60±0.08b 5.18±0.07a 4.65±0.04b 3.58±0.22c 3.84±0.22c 谷氨酸 Glu 15.27±0.30b 17.27±0.25a 15.43±0.11b 11.55±0.70c 12.39±0.67c 脯氨酸 Pro 3.95±0.10b 4.55±0.01a 3.87±0.00b 2.93±0.17c 3.07±0.15c 丙氨酸 Ala 5.93±0.12b 6.83±0.09a 5.83±0.04b 4.52±0.29c 4.67±0.26c 甘氨酸 Gly 6.37±0.12ab 6.89±0.10a 6.25±0.05ab 5.27±0.33c 5.68±0.32bc 总非必需氨基酸 ∑NEAA 50.65±0.99b 57.30±0.70a 50.69±0.33b 38.98±2.45c 41.42±2.24c 总氨基酸 TAA 95.27±1.89b 107.67±1.50a 95.11±0.64b 71.77±4.57c 75.84±4.11c 必需氨基酸/总氨基酸 EAA/TAA 0.47±0.00a 0.47±0.00a 0.47±0.00a 0.46±0.00b 0.45±0.00c
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