Response surface methodology for optimization of sterilization effect on tilapia fillet with slightly acidic electrolyzed water
-
摘要:
为研究微酸性电解水对新鲜罗非鱼片的杀菌效果，以杀菌对数值为指标，进行单因素和响应面实验，建立各因素与响应值之间的数学模型，确定最佳杀菌条件。结果表明，最佳杀菌条件为有效氯质量浓度35.00 mg·L–1，浸泡时间22 min，料液质量体积比1∶6，在此处理条件下，杀菌对数值为(0.735±0.001) lg (CFU·g–1)，杀菌率为(81.59±0.04)%。
Abstract:In order to study the sterilization effect of fresh tilapia fillets with slightly acidic electrolyzed water, the single factor and response surface experiment were adopted to establish the mathematical model between the factors and response values, and the best sterilization conditions were determined. The results show that the best bactericidal condition was 35.00 mg·L–1 of available chlorine concentration, 22 min for soaking time and 1∶6 (m∶V ). Under this condition, the killing logarithm value of bacterial colony was (0.735±0.001) lg (CFU·g–1), and the bactericidal rate was (81.59±0.04)%.
-
鲮(Cirrhinus molitorella)，属鲤科(Cyprinidae)、野鲮亚科(Labeoninae)，是两广地区的四大家鱼(鳙、草、鲢、鲮)之一，在广东省的淡水养殖业中占有重要的地位。四大家鱼繁殖成功以来，普遍存在的近亲繁殖使得亲鱼性成熟提前、个体越变越小、鱼苗病害增多、生长减慢等问题出现[1]，养殖群体遗传多样性下降。因此，收集保存野生原种，了解其遗传多样性状况并从中筛选出具有优良性状的个体或群体进行苗种生产对于水产养殖业的持续稳定发展具有重要意义。
AFLP技术首先由荷兰科学家ZABEAU和VOS提出[2-3]，此项技术兼具了RAPD和RFLP的优点，既有前者的简便灵敏和高效性也有后者的可靠性，是迄今为止最有效的分子标记之一。广东鲮鱼原种场2000和2003年先后2次从西江流域肇庆段采捞野生鲮鱼苗，作为鲮原种保存。饲养过程中发现该批鲮原种存在体色及生长速率差异。为了比较该批原种2个不同体色的子群体间的遗传差异，我们采用AFLP方法对其进行了研究。
1. 材料
1.1 实验用鱼
2005年7月，从广东鲮鱼原种场取保种样品，对体色不同的2个子群体(体色青，q; 体色淡黄，h)各取29尾，共58尾，分别编号为q1~29、h1~29。剪尾鳍保存于95%的乙醇中，4 h后更换1次95%的乙醇，保存用于总DNA抽提。
1.2 AFLP分析中使用的接头及引物序列
参照VOS等[3]方法并稍作修改进行AFLP分析，研究中使用的接头及引物序列见表 1。
表 1 AFLP分析的寡核苷酸接头和引物序列Table 1. The oligo nucleotide adaptors and primers used for the AFLP analysis接头或引物
adaptor or Primer序列(5′→3′)
sequence(5′→3′)adaptor EcoRI-1 CTC GTA GAC TGC GTA CC EcoRI-2 AAT TGG TAC GCA GTC TAC MseI-1 GAC GAT GAG TCC TGA G MseI-2 TAC TCA GGA CTC AT primers of pre-amplication EcoRI+1 GTA GAC TGC GTA CCA ATT CA MseI+1 GAC GAT GAG TCC TGA GTA AC primers of selective amplification E-NNN GAC TGC GTA CCA ATT C NNN NNN AAG，AGC，AGT，ATC，ACG M-NN(N) GAT GAG TCC TGA GTA A NN(N) NN(N) CAA，ACG，CTC，CAG，CGT 注: ‘E-NNN’和‘M-NN(N)’各自代表一条引物序列，其中的一个‘N’代表一个选择性碱基。‘NNN’为引物‘E-NNN’的选择性碱基，而‘NN(N)’为引物‘M-NN(N)’的选择性碱基
Note: ‘E-NNN’ and ‘M-NN(N)’ represented a primer sequence respectively，and an ‘N’ represented one selective nucleotide in the primer.‘NNN’was the selective nucleotides for the primer‘E-NNN’，whereas‘NN(N)’for the primer‘M-NN(N)’.2. 方法
2.1 鲮总DNA的提取及定量
采用本实验室改进的Tris-饱和酚法进行鲮总DNA抽提[4]。在德国Biometra核酸定量仪上测定基因组DNA的吸光值，测定核酸浓度。选取光密度OD260/OD280比值在1.8~2.0之间的基因组DNA，将其浓度稀释至50 ng · μL-1，-20℃保存备用。
2.2 总DNA的消化、连接、扩增
实验方法及操作过程参照夏军红[5]博士论文并稍做修改进行。所做修改如下，在DNA样品限制性消化中，DNA用量为250 ng，+1/+1 PCR预扩增中，+1引物用量为100 ng，+3/+3 PCR选择性扩增中，+3引物用量为150 ng。
2.3 PAGE电泳
+3/+3循环结束后，1.5% Agrose胶检测扩增结果。等体积2×上样缓冲液终止反应，点样，6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法显色(Premega银染试剂盒操作说明书)，数码相机拍照记录。
2.4 数据分析
银染之后得到的谱带应用软件Labimage(Ver 2.6，by Kapelan)分析，相对于分子量标记100 bp DNA ladder确定等位基因大小。数据统计所有清晰可见的条带，有带记为1，无带记为0，获得0~1矩阵。利用Popgene(Ver.3.1)进行数据分析[6]。
3. 结果与分析
3.1 AFLP引物筛选及扩增图谱
从25对AFLP引物组合(表 1)中选取6对扩增条带丰富、带型清晰、有差异性条带的AFLP引物用于进一步分析。引物组合为E1M3、E1M4、E2M4、E4M3、E5M1、E5M2。以上6对AFLP引物对子群体h和子群体q共58个个体进行PCR扩增，共产生173条扩增条带，分子量范围在50~400 bp之间，平均每对引物产生29条扩增条带，其中多态性条带数为72条，多态位点比例为41.5%。子群体q、h的多态位点数分别为61和70，多态性片段的比例分别为35.11%、40.43%。在6对引物产生的173条扩增条带中，有1条编号为E2M4-1的条带在子群体h中的频率远远高于在子群体q中的出现频率，该条带在2个子群体间的出现频率差别很大，子群体h中的出现频率为72.4%，而子群体q中的出现频率仅为20.6%。图 1为引物E2M4扩增的AFLP图谱，从图谱中可以看出鲮个体间的差异。标注位点为子群体h的高频位点。
![]()
图 1 引物组合E2M4对原种群体的扩增图谱q1~29. 子群体q; h1~29. 子群体h; M. 100 bp分子量标准Figure 1. AFLP-PCR pattern of primer pair E2M4 on original populationq1~29. sub-stock q; h1~29. sub-stock h; M. 100 bp DNA ladder3.2 鲮原种群体的遗传多样性分析
对所取鲮原种群体进行遗传多样性分析结果，鲮原种群体的遗传多样性指数为0.1254，其子群体h与子群体q的遗传多样性指数分别为0.1367和0.0998，子群体h的遗传多样性指数远高于子群体q。
4. 讨论
本研究采用AFLP方法对广东鲮鱼原种场的鲮原种群体进行了遗传多样性分析。对鲮原种群体2个子群体遗传多样性分析表明，子群体h的遗传多样性水平高于子群体q(0.1367>0.0998)，2个子群体间的遗传分化较为明显。这一结果与笔者此前采用RAPD方法研究的结果[4]一致。广东鲮鱼原种场在对该批鲮原种的饲养观察中已发现，子群体h的生长性能优于子群体q，因而获得子群体h相对于子群体q的特异性分子标记对于培育具有生长优势的鲮优良品系具有重要意义。AFLP标记能够提供大量且高密度的信息位点，因此，有可能在表型不同的2个鲮原种子群体间筛选出具有群体特异性的分子标记。夏军红等[5]采用AFLP方法从36对引物组合中筛选到一对长江江豚性连锁分子标记的引物组合，找到一个与性别相关的标记性位点。本研究从25对引物组合中选取了6对扩增中显示出有差异条带的引物组合对该批鲮原种的2个子群体进行扩增，获得了1条在子群体h中的出现频率绝对高于子群体q的条带E2M4-1(72.4%>20.6%)。体色是由多基因控制的性状，条带E2M4-1有可能与控制体色的某基因位点呈不完全连锁。进一步扩大筛选范围，采用更多引物组合做进一步研究有希望获得2个子群体间的特异性分子标记。
-
![]()
图 1 微酸性电解水有效氯浓度对杀菌效果的影响
Figure 1. Effect of slightly acidic electrolyzed water available chlorine concentration on sterilization
![]()
图 2 微酸性电解水浸泡时间对杀菌效果的影响
Figure 2. Effect of slightly acidic electrolyzed water dipping time on sterilization
![]()
图 3 罗非鱼片与酸性电解水料液比对杀菌效果的影响
Figure 3. Effect of tilapia fillet and slightly acidic electrolyzed water's solid-liquid ratio on sterilization
表 1 微酸性电解水的理化特性
Table 1 Physico-chemical properties of slightly acidic electrolyzed water
有效氯质量浓度/mg·L–1
ACCpH 氧化还原电位值/mV
ORP12.48±0.47 6.39±0.06 882.93±9 19.85±1.71 6.16±0.09 898.54±19.03 31.39±1.48 6.053 3±0.19 900.63±14.3 35.22±0.98 5.912±0.07 906.43±12.12 40.270 4±1.36 5.895±0.09 910.23±15.83 49.24±1.24 5.33±0.08 950.43±13.23 
下载: 导出CSV
表 2 响应面实验设计因素与水平
Table 2 Factors and levels used in response surface experiments
水平
level因素 factor 有效氯质量浓度/mg·L–1
available chlorine concentration浸泡时间/min
dipping time料液质量体积比
solid-liquid ratio–1 20 15 1∶4 0 30 20 1∶6 1 40 25 1∶8
下载: 导出CSV
表 3 Box-Behnken实验方案及结果
Table 3 Box-Behnken design and results
实验号
test No.有效氯浓度
available chlorine concentration浸泡时间
dipping time料液比
solid-liquid ratio杀菌对数值
lg colony killing value1 –1 –1 0 0.52 2 1 –1 0 0.66 3 –1 1 0 0.64 4 1 1 0 0.7 5 –1 0 –1 0.56 6 1 0 –1 0.67 7 –1 0 1 0.6 8 1 0 1 0.69 9 0 –1 –1 0.59 10 0 1 –1 0.65 11 0 –1 1 0.61 12 0 1 1 0.68 13 0 0 0 0.73 14 0 0 0 0.71 15 0 0 0 0.69 16 0 0 0 0.72 17 0 0 0 0.74
下载: 导出CSV
表 4 回归方程方差分析
Table 4 Analysis of variances for developed regression equation
方差来源
source平方和
SS自由度
df均方
MSF P 显著性
significance模型 model 0.061 9 0.006 29.36 <0.000 1 ** A-有效氯浓度 A-available chlorine concentration 0.02 1 0.02 87.23 <0.000 1 ** B-浸泡时间 B-dipping time 0.011 1 0.011 45.85 0.000 3 ** C-料液比 C-solid-liquid ratio 0.001 1 0.001 5 6.6 0.037 1 * AB 0.001 1 0.001 6 6.98 0.033 3 * AC 0.000 1 1 0.000 1 0.44 0.530 1 BC 0.000 025 1 0.000 02 0.11 0.750 9 A2 0.008 1 0.008 6 37.6 0.000 5 ** B2 0.007 1 0.007 6 33.56 0.000 7 ** C2 0.007 1 0.007 6 33.56 0.000 7 ** 残差 residual 0.001 7 0.000 2 失拟项 lack of fit 0.000 1 3 0.000 04 0.11 0.948 2 误差项 pure error 0.001 4 0.000 3 总和 cor total 0.062 16 R2=0.974 1 RAdj=0.941 0 注：*. P<0.05表示差异显著；**. P<0.01表示差异极显著 Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01)
下载: 导出CSV
-
[1] 李娜, 赵永强, 李来好, 等. 冰藏过程中罗非鱼鱼片肌肉蛋白质变化[J]. 南方水产科学, 2016, 12(2): 88-94. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.013 [2] 于福田, 岑剑伟, 杨贤庆, 等. 罗非鱼片发色新技术研究进展[J]. 食品工业科技, 2018, 39(6): 322-326. [3] 赵良, 岑剑伟, 李来好, 等. 高压静电场结合冰温气调保鲜技术对罗非鱼鱼片品质的影响[J]. 南方水产科学, 2016, 12(3): 91-97. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.03.012 [4] DEWI F R, STANLEY R, POWELL S M, et al. Application of electrolysed oxidising water as a sanitiser to extend the shelf-life of seafood products: a review[J]. J Food Sci Tech Mys, 2017, 54(5): 1321-1332. doi: 10.1007/s13197-017-2577-9
[5] 中村悌一. 微酸性电解水在食品厂卫生管理方面的应用[J]. 中国洗涤用品工业, 2017(1): 14-19. [6] 堀田国元. 酸性电解水的基础、应用及发展动向[J]. 中国护理管理, 2008, 8(4): 7-11. doi: 10.3969/j.issn.1672-1756.2008.04.002 [7] ISSA-ZACHARIA A, KAMITANI Y, MIWA N A, et al. Application of slightly acidic electrolyzed water as a potential non-thermal food sanitizer for decontamination of fresh ready-to-eat vegetables and sprouts[J]. Food Control, 2011, 22(3/4): 601-607.
[8] LIAO X Y, XUAN X T, LI J, et al. Bactericidal action of slightly acidic electrolyzed water against Escherichia coli and Staphylococcus aureus via multiple cell targets[J]. Food Control, 2017, 79: 380-385. doi: 10.1016/j.foodcont.2017.03.050
[9] MANSUR A R, OH D H. Combined effects of thermosonication and slightly acidic electrolyzed water on the microbial quality and shelf life extension of fresh-cut kale during refrigeration storage[J]. Food Microbiol, 2015, 51: 154-162. doi: 10.1016/j.fm.2015.05.008
[10] TANGO C N, MANSUR A R, KIM G H, et al. Synergetic effect of combined fumaric acid and slightly acidic electrolysed water on the inactivation of food-borne pathogens and extending the shelf life of fresh beef[J]. J Appl Microbiol, 2014, 117(6): 1709-1720. doi: 10.1111/jam.2014.117.issue-6
[11] HUANG Y R, HUNG Y C, HSU S Y, et al. Application of electrolyzed water in the food industry[J]. Food Control, 2008, 19(4): 329-345. doi: 10.1016/j.foodcont.2007.08.012
[12] JO H Y, TANGO C N, OH D H. Influence of different organic materials on chlorine concentration and sanitization of slightly acidic electrolyzed water[J]. LWT, 2018, 92: 187-194. doi: 10.1016/j.lwt.2018.02.028
[13] WALKER S P, DEMIRCI A, GRAVES R E, et al. Response surface modelling for cleaning and disinfecting materials used in milking systems with electrolysed oxidizing water[J]. Int J Dairy Technol, 2005, 58(2): 65-73. doi: 10.1111/idt.2005.58.issue-2
[14] TOMÁS-CALLEJAS A, LÓPEZ-GÁLVEZ F, SBODIO A, et al. Chlorine dioxide and chlorine effectiveness to prevent Escherichia coli O157:H7 and Salmonella cross-contamination on fresh-cut Red Chard[J]. Food Control, 2012, 23(2): 325-332. doi: 10.1016/j.foodcont.2011.07.022
[15] ALEXANDRE E M, BRANDAO T R, SILVA C L. Assessment of the impact of hydrogen peroxide solutions on microbial loads and quality factors of red bell peppers, strawberries and watercress[J]. Food Control, 2012, 27(2): 362-368. doi: 10.1016/j.foodcont.2012.04.012
[16] ALEXANDRE E M, SANTOS-PEDRO D M, BRANDAO T R, et al. Influence of aqueous ozone, blanching and combined treatments on microbial load of red bell peppers, strawberries and watercress[J]. J Food Eng, 2011, 105(2): 277-282. doi: 10.1016/j.jfoodeng.2011.02.032
[17] HUANG Y X, CHEN H Q. Effect of organic acids, hydrogen peroxide and mild heat on inactivation of Escherichia coli O157:H7 on baby spinach[J]. Food Control, 2011, 22(8): 1178-1183. doi: 10.1016/j.foodcont.2011.01.012
[18] YE Z Y, WANG S, CHEN T, et al. Inactivation mechanism of Escherichia coli induced by slightly acidic electrolyzed water[J]. Sci Rep, 2017, 7: 6279. doi: 10.1038/s41598-017-06716-9
[19] 李国威, 傅润泽, 沈建, 等. 微酸性电解水对活品虾夷扇贝存活率的影响及杀菌效果[J]. 渔业现代化, 2016, 43(1): 68-74. doi: 10.3969/j.issn.1007-9580.2016.01.013 [20] 唐鸟林. 电解水处理水产品及其加工环境中致病菌的研究[D]. 上海: 华东理工大学, 2010: 9-10. [21] 赵德锟, 李凌飞, 谭雷姝, 等. 微酸性电解水对鲜切云南红梨贮藏品质影响研究[J]. 食品安全质量检测学报, 2017, 8(1): 243-251. [22] 叶章颖, 祁凡雨, 裴洛伟, 等. 微酸性电解水对虾仁的杀菌效果及其动力学[J]. 农业工程学报, 2014, 30(3): 223-230. [23] 王潇, 吴佳佳, 张鹤, 等. 响应面法优化中华管鞭虾酸性电解水杀菌工艺[J]. 中国食品学报, 2015(12): 107-114. [24] 周小双, 王锦旭, 杨贤庆, 等. 响应面法优化合浦珠母贝糖胺聚糖提取工艺[J]. 食品与发酵工业, 2016, 42(1): 238-243. [25] 赵中辉. 加工鱼块氯残留量检测及风险分析[J]. 检验检疫学刊, 2012, 22(5): 44-65. doi: 10.3969/j.issn.1674-5354.2012.05.014
计量
- 文章访问数:
- HTML全文浏览量:
- PDF下载量:
粤公网安备 44010502001741号
