Effects of inoculant of photosynthetic bacteria and Rhodopseudomonas palustris on nitrogen and phosphorus nutrients and microbial community in experimental water
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摘要:
为比较光合细菌菌剂与沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)的生理生态特性,分析了不同初始菌量的菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体氨氮(
\begin{document}${\rm NH}^+_4{\text -}{\rm N}$\end{document} )、亚硝氮(
$\small {\rm NO}^-_2{\text -}{\rm N}$ )、硝氮(
$\small {{\rm NO}^{-}_{3}}{\text -}{\rm N}$ )和活性磷(
${\rm PO}^{3-}_4$ -P)的降解效果,通过高通量测序分析了菌剂PG的优势菌组成及实验结束时水体细菌数量和微生物群落组成。结果显示,菌剂PG组对实验水体的
${\rm PO}^{3-}_4$ -P、
$ {\rm NO}^-_3$ -N和
$ {\rm NO}^-_2$ -N有一定的降解作用,其最大降解率分别为40.98%、28.28%和20.12%。菌株PSB-1组仅对实验水体的
${\rm NO}^-_2{\text -}{\rm N}$ 和
${\rm PO}^{3-}_4{\text -}{\rm P}$ 有一定的降解效果,其最大降解率分别为14.19%和9.88%。菌剂PG的主要优势菌为红假单胞菌属(Rhodopseudomonas sp.)。实验7 d后实验组水体细菌数量和微生物群落结构发生变化,水体细菌数量增长,形成以异养细菌为优势菌的菌群结构。结果表明光合细菌菌剂PG对水质因子的降解效果优于沼泽红假单胞菌PSB-1,但与报道的高效光合细菌菌株的降解能力存在一定差距。
Abstract:To compare the physiological and ecological characteristics of inoculant of photosynthetic bacteria and Rhodopseudomonas palustri, we analyzed the degradation effects of the inoculant PG and the strain PSB-1 with different initial amounts of bacteria on ammonia nitrogen (
\begin{document}${\rm NH}^+_4$\end{document} -N), nitrite nitrogen (
${\rm NO}^-_2$ -N), nitrate nitrogen (
${\rm NO}_3^-$ -N) and phosphate (
${\rm PO}_4^{3-}$ -P) in experimental water. Then we studied the dominant bacteria composition of inoculant of photosynthetic bacteria PG, as well as the number of bacteria and microbial community composition in experimental water at the end of the experiment by high-throughput sequencing. The results show that the inoculant PG group had certain degradation effects on
${\rm PO}_4^{3-}$ -P,
${\rm NO}_3^-$ -N and
${\rm NO}_2^-$ -N in experimental water. The maximum degradation rates of PG for
${\rm PO}_4^{3-}$ -P,
${\rm NO}_3^-$ -N and
${\rm NO}_2^-$ -N were 40.98%, 28.28% and 20.12%, respectively. Moreover, the strain PSB-1 group only had certain degradation effect on
${\rm NO}_2^-$ -N and
${\rm PO}_4^{3-}$ -P. The maximum degradation rates of PSB-1 were 14.19% and 9.88%, respectively. The dominant bacteria of the inoculant PG belonged to Rhodopseudomonas sp.. After 7 d of experiment, the number of bacteria and microbial community structure in the experimental group changed, and the number of bacteria in the water increased, forming a microbial structure with heterotrophic bacteria as the dominant bacteria. It is indicated that the inoculant of photosynthetic bacteria PG has better effect on the degradation of water quality factors than R. palustris PSB-1. However, there is a certain gap between both things and the reported degradation efficiency of photosynthetic bacterial strains.
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光合细菌菌剂是以培养基为原料、活性光合细菌为菌种,经现代生物工程技术研制而成的一种微生物制剂[1-2]。因具有降解养殖环境中的有害氮素、硫化氢等有毒有害物质等功能[3-6],从20世纪80年代起光合细菌就被广泛应用于水产养殖业[7]。随着水产养殖业的快速发展,渔用光合细菌成为水产微生物制剂的研究热点之一。然而,虽经多年发展,渔用光合细菌菌剂却呈现出产品质量良莠不齐,作用效果难以保证;光合细菌种类多[8-10],加之使用环境条件复杂,评估光合细菌菌剂产品在实际应用中的效果存在一定难度[11]等诸多问题。已有的研究更多地关注高效光合细菌菌株的分离筛选[12-13]、作用效果[14-15]等方面,而目前对光合细菌菌剂的组成及其在降解水质因子的同时对水体微生物群落的影响研究报道尚少。
沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris),属于红螺菌目、红螺菌科、红假单胞菌属[16],是最常用的渔用光合细菌菌剂的细菌种类之一[17-18],其通过体内的脱氮酶系、亚硝酸盐还原酶的作用降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质[19-20]。雷爱莹等[21]从高产对虾养殖池塘底泥中分离得到了一株活性较高的沼泽红假单胞菌,研究发现其具有降解凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)养殖池塘水体中氨氮、亚硝氮的功能。然而,仅关注沼泽红假单胞菌特定菌株自身的生理生态特征和功能特性还显不足,从其对水体微生物群落影响的角度分析其作用原理可能会得到更多新的阐释。
因此,本研究选择市场上购买的知名品牌渔用光合细菌菌剂(该菌剂标签所标注的主要成分为红螺菌(Rhodospirillum sp.),标明其具有降解氨氮、亚硝氮的功能)和从菌种保藏中心购买的沼泽红假单胞菌菌株,比较分析其对实验水体氮磷营养盐的作用效果,并采用高通量测序技术分析了实验结束时水体的微生物群落组成。通过针对性地对比分析光合细菌菌剂产品与沼泽红假单胞菌的生理生态特性,从其对水体微生物群落结构影响的角度,研究菌剂产品和特定菌株对水质的作用效果,以为光合细菌菌剂产品质量评价、作用机理解析等提供数据支持与理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌种来源
光合细菌菌剂PG,生产批号为17041012,购自广东省中山市某水产养殖物质产品经销商。该产品为渔用微生态制剂市场的知名品牌产品,其标签主要成分为红螺菌、微量元素、活性酶及促生长因子。沼泽红假单胞菌PSB-1购自广东省微生物菌种保藏中心(菌种编号为GIM1.167)。
1.1.2 菌株的培养
菌株PSB-1采用液体培养基在30 ℃条件下厌氧光照培养。培养基配方为磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.0 g·L–1,硫酸镁(MgSO4) 0.5 g·L–1,酵母膏10.0 g·L–1,pH 7.0~7.2。
1.2 实验体系的构建
饲料浸出液的制备[22-23]。将市售的凡纳滨对虾配合饲料 [广东粤海饲料集团,主要营养成分(质量分数)为粗蛋白41%,粗脂肪5%,灰分16%] 烘干、粉碎,取100 g粉碎的饲料,加入1 L纯净水,室温浸泡24 h,制成饲料浸出液原液。
实验水体的制备。取饲料浸出原液,以体积比1∶100加入盐度为10的养殖池塘水中,并加入适量的氯化铵、亚硝酸钠,调节实验水体主要水质指标的初始浓度。经调节后实验水体的初始COD值为10~15 mg·L–1,氨氮(
${\rm NH}_4^+$ -N)和亚硝氮(${\rm NO}_2^-$ -N)质量浓度为1~3 mg·L–1,活性磷(${\rm PO}_4^{3-}$ -P)为1~2 mg·L–1,以上指标均在养殖池塘水质指标的变动范围内[24-25],且易于反映其作用效果。实验水体配制好后,分装600 mL至1 L三角烧瓶,121 ℃ 灭菌15~20 min。灭菌后的实验水体备用。1.3 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用
1.3.1 菌剂PG对实验水体氮磷营养盐的作用效果
实验设置PG-4组、PG-6组和对照组。PG-4组和PG-6组分别以初始菌量104 个·mL–1和106 个·mL–1将菌剂PG添加到实验水体中;对照组不加菌,加入相同体积的生理盐水。每组各设置3个平行。
1.3.2 菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用效果
实验设置PSB-1-4组、PSB-1-6组和对照组。PSB-1-4组和PSB-1-6组分别以初始菌量104 个·mL–1和106 个·mL–1将菌株PSB-1添加到实验水体中;对照组不加菌,加入相同体积的生理盐水。每组各设置3个平行。
1.3.3 水质指标的测定
将各组28 ℃振荡培养7 d,于实验的第0、第3、第7天取样检测水体中氨氮、亚硝氮、硝氮和活性磷的含量,分析菌剂PG和菌株PSB-1对水质因子的作用效果。实验水体中
${\rm NH}_4^+$ -N、${\rm NO}_2^-$ -N、${\rm NO}_3^-$ -N和${\rm PO}_4^{3-}$ -P的检测依照国家标准GB17378.4—2007,分别采用靛酚蓝分光光度法、盐酸萘乙二胺分光光度法、锌镉还原法和磷钼蓝分光光度法进行测定。1.4 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体微生物群落的影响
1.4.1 菌剂PG优势菌组成分析
取菌剂PG的菌液100 mL,将菌液摇匀经0.2 μm滤膜(Millipore,美国)过滤。采用水体微生物DNA提取试剂盒(OMEGA,美国)提取菌剂样品的细菌总DNA,待DNA样品检测合格后,送至深圳华大基因科技服务有限公司,以引物515F (5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')特异性扩增16S V4可变区,构建扩增文库,通过比对Sliva数据库,分析菌剂PG的优势菌组成。
1.4.2 实验结束时水体细菌数量和微生物群落结构分析
1)水体细菌数量分析。实验结束时(第7天),用无菌的吸管吸取合适稀释度摇匀的菌液,使用血球计数板计数水体的细菌数量,采用营养琼脂培养基平板涂布计数法测定水体异养细菌数量,30 ℃恒温培养48 h后计数。
2)水体微生物群落结构分析。实验结束时(第7天),取各实验组(PG-4组、PG-6组、PSB-1-4组和PSB-1-6组)的水体样品100 mL,经0.2 μm的滤膜(Millipore,美国)过滤。采用水体微生物DNA提取试剂盒(OMEGA,美国)提取水体样品的细菌总DNA,待DNA样品检测合格后,送至深圳华大基因科技服务有限公司,以引物515F(5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3')和806R (5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')特异性扩增16S V4可变区,构建扩增文库,通过比对Sliva数据库,分析各实验组水体的微生物群落组成。每组各检测3个平行样品,其编号分别为PG-4-1、PG-4-2、PG-4-3、PG-6-1、PG-6-2、PG-6-3、PSB-1-4-1、PSB-1-4-2、PSB-1-4-3、PSB-1-6-1、PSB-1-6-2、PSB-1-6-3,共计12个样品。
1.5 数据分析
各水质指标降解率的计算公式为:降解率R=(初始浓度C0–实验后的浓度Ct)/初始浓度C0×100%。利用SPSS 20.0软件以单因素方差分析法(One-Way ANOVA)比较各组数据的差异显著性,显著水平设定为P<0.05。
2. 结果
2.1 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用
2.1.1 菌剂PG对实验水体氮磷营养盐的作用分析
不同初始浓度的菌剂组在实验第3和第7天的水体
${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 质量浓度呈现先降低后升高的趋势(图1-a)。PG-4和PG-6组在实验第3天对实验水体的NH3-N表现出降解作用,但其降解率与对照组无显著差异(P>0.05,表1)。表 1 菌剂PG各组对水质因子的降解率 (平均值±标准差)Table 1. Degradation rate of various water quality indicators in each PG group ($ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}} \pm {\bf SD}$ )被测物
analyte时间
time组别 group 对照 control PG-4 PG-6 氨氮 ${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 第3天 24.07±9.51a 20.96±4.33a 29.90±4.57a 第7天 15.22±3.09a –18.35±5.94b 7.01±1.52c 亚硝氮 ${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –1.40±0.62a 8.64±1.67b 7.86±4.88b 第7天 2.54±0.95a 20.12±1.25b 15.92±11.39b 硝氮 ${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –15.41±0.78a – 67.41±24.95b –17.98±15.67a 第7天 –10.46±9.34a 28.28±4.80b 15.27±18.81b 活性磷 ${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 第3天 –17.57±3.55a 6.64±0.00b 40.98±1.36c 第7天 –18.46±3.33a 25.48±9.14b 22.18±7.50b 注:同行数据不同上标字母表示差异显著(P<0.05),表2同此
Note: The data within the same row with different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Tab.2.不同初始浓度的菌剂组水体
${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 质量浓度在实验第3和第7天均有所降低(图1-b)。第7天,PG-4和PG-6组对${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 的降解作用较明显,其降解率分别为20.12%和15.92%,显著高于对照组(P<0.05),两组间无显著性差异(P>0.05,表1)。在实验第3和第7天的水体
${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 质量浓度呈先升高后降低的趋势(图1-c)。第7天,PG-4和PG-6组对${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 的降解率分别为28.28%和15.27%,显著高于对照组(P<0.05),两组间无显著性差异(P>0.05,表1)。PG-4组水体中
${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 质量浓度在实验第3和第7天均有所降低(图1-d)。第3天,PG-6组对${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 的降解率达40.98%,显著高于PG-4组和对照组(P<0.05);第7天,PG-4和PG-6组对${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 的降解率分别为25.48%和22.18%,显著高于对照组(P<0.05),两组间无显著性差异(P>0.05,表1)。2.1.2 菌株PSB-1对实验水体氮磷营养盐的作用分析
PSB-1组对水体
${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 未表现出降解效果(图2-a)。PSB-1-4组水体中${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 质量浓度上升;PSB-1-6组水体中${\rm NH}_4^+{\text -}{\rm N}$ 质量浓度呈现先上升后下降的趋势。不同初始浓度的PSB-1组对水体
${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 呈现一定的降解效果(图2-b)。第7天,PSB-1-4和PSB-1-6组对${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 的降解率分别为14.19%和13.79%,显著高于对照组(P<0.05),两组间无显著性差异(P>0.05,表2)。表 2 菌株PSB-1各组对各水质指标的降解率 (平均值±标准差)Table 2. Degradation rate of various water quality indicators in each strain PSB-1 group ($ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}} \pm {\bf SD}$ )被测物
analyte时间
time组别 group 对照 control PSB-1-4 PSB-1-6 氨氮 ${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 第3天 24.07±9.51a –53.43±13.24b –87.00±16.33c 第7天 15.22±3.09a –78.22±25.20b –30.65±2.65c 亚硝氮 ${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –1.40±0.62a 4.14±2.71b 6.99±1.04b 第7天 2.54±0.95a 14.19±4.18b 13.79±1.38b 硝氮 ${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –15.41±0.78a –30.70±4.00b –41.63±6.21c 第7天 –10.46±9.34a –26.14±5.28b –7.11±1.77a 活性磷 ${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 第3天 –17.57±3.55a 9.88±0.50b 1.59±0.48c 第7天 –18.46±3.33a 5.69±1.61b –0.28±2.17c 水体
${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 质量浓度在实验第3和第7天呈现先升高后降低的趋势,PSB-1组对水体${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 未表现出降解效果(图2-c)。不同初始浓度的PSB-1组在实验第3和第7天的水体
${\rm PO}_4^{3-}{\text -}{\rm P}$ 质量浓度呈现先降低后升高的趋势(图2-d)。PSB-1-4组在第3天对${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的降解率为9.88%,第7天为5.69%,均显著高于对照组(P<0.05),而PSB-1-6组对${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 未表现出降解作用(表2)。2.2 菌剂PG和菌株PSB-1对实验水体微生物群落的影响
2.2.1 光合细菌菌剂优势菌组成分析
通过高通量测序分析,得到了菌剂PG在门、纲、目、科、属5个分类阶层的优势菌组成(图3)。结果发现,该光合细菌菌剂为包含多菌种的复合菌剂,其主要优势菌为变形菌门、α-变形菌纲、根瘤菌目、慢生根瘤菌科的红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)菌株[26],在属水平上其相对丰度达50.58%;其次为变形菌门、δ-变形菌纲、脱硫弧菌目、脱硫弧菌科的脱硫弧菌属(Desulfovibrio),该菌株在属水平的相对丰度为10.45%。
2.2.2 实验结束时水体细菌数量和微生物群落结构分析
1)水体细菌数量分析。通过显微镜计数法得到了实验第7天PG-4、PG-6、PSB-1-4和PSB-1-6组的实验水体总菌量分别为1.46×108个·mL–1、1.53×108个·mL–1、1.74×107个·mL–1和7.03×107个·mL–1,通过营养琼脂平板计数得到其实验水体异养细菌数量分别为1.44×108 CFU·mL–1、1.45×108 CFU·mL–1、1.69×107 CFU·mL–1和6.58×107 CFU·mL–1(图4)。
图 5 实验水体中微生物群落门 (a)、纲 (b)、目 (c)、科 (d)、属 (e) 水平上的相对丰度每个实验组3个平行:PG-4-1为PG-4组平行1;PG-6-1为PG-6组平行1;PSB-1-4-1为PSB-1-4组平行1;PSB-1-6-1为PSB-1-6组平行1,以此类推Figure 5. Relative abundance of microbial community in experimental water in terms of Phylum (a), Class (b), Order (c), Family (d) and Genus (e)Three parallels in each experimental group: PG-4-1 is parallel 1 to PG-4 group; PG-6-1 is parallel 1 to PG-6 group; PSB-1-4-1 is parallel 1 to PSB-1-4 group 1; PSB-1-6-1 is parallel 1 to PSB-1-6 group, and so on.2)水体微生物群落结构分析。利用高通量测序分析得到了实验第7天PG-4、PG-6、PSB-1-4和PSB-1-6组的水体微生物群落在门、纲、目、科、属5个分类阶层优势菌的结构组成(图5)。结果显示,PG-4 (PG-4-1、PG-4-2、PG-4-3)和PG-6组(PG-6-1、PG-6-2、PG-6-3)在实验结束时水体中菌群结构较为相似,其主要优势菌为变形菌门、γ-变型菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属(Pseudomonas)菌株,其在属水平上的平均相对丰度分别为53.46%和61.84%;PSB-1-4 (PSB-1-4-1、PSB-1-4-2、PSB-1-4-3)和PSB-1-6组(PSB-1-6-1、PSB-1-6-2、PSB-1-6-3)在实验结束时水体微生物群落在门、纲、目分类水平下的菌群结构较为相似,该分类水平下主要优势菌分别为厚壁菌门、芽孢杆菌纲、芽孢杆菌目,但在科和属的分类水平下PSB-1-4组的优势菌为芽孢杆菌科的芽孢杆菌属(Bacillus),在属水平上的平均相对丰度为46.95%,而PSB-1-6组在科和属分类水平下的优势菌分别为类芽孢杆菌科、短芽孢杆菌属(Brevibacillus),在属水平上的平均相对丰度为66.19% (图5)。
3. 讨论
在集约化养殖生产中,由于养殖生物排泄物、浮游生物尸体残骸的累积,加之大量投喂高蛋白的人工饲料、有机肥料等使养殖水体中富含有机质,有机质经分解后形成氨氮、亚硝氮、硝氮、磷酸盐和硫化氢等。光合细菌能在厌氧条件下利用体内的胞外蛋白酶和亚硝酸盐还原酶分解水体中的氨氮、亚硝氮等物质,从而改善和净化水质[27]。从本研究的结果来看,光合细菌菌剂PG组在实验第3天对水体
$ {\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的最大降解率为40.98%,而在实验第7天对水体${\rm NO}_3^-{\text -}{\rm N}$ 和${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 最大降解率分别为28.28%和20.12%。菌剂PG的降解效果与刘洋等[28]所报道光合细菌菌株对$ {\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 和${\rm NO}_2^-{\text -}{\rm N}$ 的降解能力相似。刘洋等[28]从市售的光合细菌菌液中分离出2株光合细菌GHJ-1和GHJ-2,用5 g·L–1菌株投放量在非灭菌状态下处理养殖污水。2个菌株从第6天开始对${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 、${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 和${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 表现出较明显的降解效果,对${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 的降解率分别为35.1%和45.7%,对${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 的降解率分别为13.5%和18.7%,对$ {\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 的降解率为25.8%和33.3%。本研究中PG-6组除第3天对${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的降解率显著高于PG-4组外(P<0.05),两实验组的降解效果无显著差异。秦宇胜等[29]研究认为影响菌株对氮磷的降解能力的因素很多,菌剂的投加量主要影响细菌进入分裂期的时间,可能对菌剂利用氮磷的速率影响不大。菌剂PG与董艳珍等[30]所报道的光合细菌菌株的降解能力存在一定差距。董艳珍等[30]从养殖池塘底泥中分离获得的光合细菌在非灭菌状态下处理养殖池塘肥水,实验第8天对${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 和${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 的降解率可达74.8%和57.3%。菌剂PG组对实验水体水质因子的降解效果与已有报道存在差别的原因之一,是不同研究在采用的作用效果评价体系、施用菌量等方面存在差别,刘洋等[28]和董艳珍等[30]的研究是在非灭菌状态、高初始菌量的光照系统中进行,而本研究是以配制的养殖水在有氧自然光照条件下对菌剂产品和菌株的自身特性予以评价。从本研究细菌数量和高通量测序的结果来看,实验7 d后水体细菌数量增长至108 个·mL–1,且主要为异养细菌,水体微生物群落变为以变形菌门、γ-变型菌纲、假单胞菌目、假单胞菌科的假单胞菌属菌株为主要优势菌,其在属水平上的相对丰度为53.46%~61.84%。由此可见,该系统下菌剂产品PG对水质因子的作用效果在实验前期为以红假单胞菌属为主要优势菌的复合菌群共同作用所致,而随着实验的进行,水体形成以异养细菌为主的菌群结构。这可能是本研究结果与已有报道存在差别的另一原因。渔用光合细菌菌剂的细菌种类主要有红假单胞菌属[31-32]、红螺菌属[33]、外硫红螺菌属(Ectothiorhodospira)等[34],其中最常用的为沼泽红假单胞菌[17-18]。本研究从菌株保藏中心购买的菌株沼泽红假单胞菌PSB-1组在实验第7天对水体的
${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 最大降解率为14.19%,而在实验第3天对水体$ {\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的最大降解率仅为9.88%。该菌株对主要水质因子的降解效果与Zhang等[35]和杨莺莺等[36]所报道的沼泽红假单胞菌的降解能力也存在差距。Zhang等[35]认为沼泽红假单胞菌能降低养殖水中${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N} $ 和${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 的质量浓度,实验第15天实验组的${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 质量浓度较对照组降低了94.90%,第12天实验组的$ {\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 质量浓度较对照组降低了29.81%。杨莺莺等[36]研究发现沼泽红假单胞菌PS1具有降解养殖废水中${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 、${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 和${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 的功能,当温度为26 ℃时实验第4天PS1对其降解率分别为96.48%、73.84%和64.10%。由此可见,不同菌株之间的作用效果及起效时间等均存在差距。从本研究细菌数量和高通量测序的结果来看,实验7 d后水体细菌数量增长至107 个·mL–1,且主要为异养细菌,PSB-1-4组实验水体优势菌变为芽孢杆菌属,PSB-1-6组实验水体优势菌变为短芽孢杆菌属。水体微生物群落的改变导致其对水质因子作用效果的差异。沼泽红假单胞菌可通过体内的脱氮酶系、亚硝酸盐还原酶的作用降解氨氮、亚硝酸盐等有害物质[19-20],从而实现净化水质的作用。而不同光照、氧气、pH、盐度、温度和初始施菌量等都会对沼泽红假单胞菌的生长及其对有害氮素的去除效果产生影响[20,36]。此外,即使有研究报道证实沼泽红假单胞菌具有较强的水质净化功能,由于其在不同株系间的功能存在差别,也可能致使水质净化效果存在差异[37-38]。此外,还值得注意的是沼泽红假单胞菌的分类地位问题。根据《伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)》,基于菌株自身的生理生态特征,沼泽红假单胞菌属于光能自养细菌中红螺菌目、红螺菌科的红假单胞菌属[16];而基于分子生态的高通量测序比对结果,沼泽红假单胞菌属于变形菌门、α-变形菌纲、根瘤菌目、慢生根瘤菌科的红假单胞菌属[26]。笔者认为在水产微生物制剂的功能菌株筛选及其产品研发方面,应更多关注菌株自身生理生态特性和功能。
综上,为保证菌剂产品的功能特性,应分离筛选适用于养殖池塘环境的高效光合细菌菌株,并定期更新用于菌剂生产的菌株,确保菌种种质资源的丰富和稳定;在后续对渔用光合细菌菌剂和光合细菌菌株的分析和评价中,不仅应分析菌剂和菌株对水质因子的作用效果,还应关注光合细菌菌株的生长特性及其对养殖水体中微生物群落、浮游植物的影响,以期通过系列研究,为建立健全光合细菌菌剂的产品评价体系提供科学依据。
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图 5 实验水体中微生物群落门 (a)、纲 (b)、目 (c)、科 (d)、属 (e) 水平上的相对丰度
每个实验组3个平行:PG-4-1为PG-4组平行1;PG-6-1为PG-6组平行1;PSB-1-4-1为PSB-1-4组平行1;PSB-1-6-1为PSB-1-6组平行1,以此类推
Figure 5. Relative abundance of microbial community in experimental water in terms of Phylum (a), Class (b), Order (c), Family (d) and Genus (e)
Three parallels in each experimental group: PG-4-1 is parallel 1 to PG-4 group; PG-6-1 is parallel 1 to PG-6 group; PSB-1-4-1 is parallel 1 to PSB-1-4 group 1; PSB-1-6-1 is parallel 1 to PSB-1-6 group, and so on.
表 1 菌剂PG各组对水质因子的降解率 (平均值±标准差)
Table 1 Degradation rate of various water quality indicators in each PG group (
$ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}} \pm {\bf SD}$ )被测物
analyte时间
time组别 group 对照 control PG-4 PG-6 氨氮 ${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 第3天 24.07±9.51a 20.96±4.33a 29.90±4.57a 第7天 15.22±3.09a –18.35±5.94b 7.01±1.52c 亚硝氮 ${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –1.40±0.62a 8.64±1.67b 7.86±4.88b 第7天 2.54±0.95a 20.12±1.25b 15.92±11.39b 硝氮 ${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –15.41±0.78a – 67.41±24.95b –17.98±15.67a 第7天 –10.46±9.34a 28.28±4.80b 15.27±18.81b 活性磷 ${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 第3天 –17.57±3.55a 6.64±0.00b 40.98±1.36c 第7天 –18.46±3.33a 25.48±9.14b 22.18±7.50b 注:同行数据不同上标字母表示差异显著(P<0.05),表2同此
Note: The data within the same row with different letters indicate significant difference (P<0.05). The same case in Tab.2.表 2 菌株PSB-1各组对各水质指标的降解率 (平均值±标准差)
Table 2 Degradation rate of various water quality indicators in each strain PSB-1 group (
$ {\overline {\mathit{\boldsymbol{X}}}} \pm {\bf SD}$ )被测物
analyte时间
time组别 group 对照 control PSB-1-4 PSB-1-6 氨氮 ${\rm NH}_4^+{\text-}{\rm N}$ 第3天 24.07±9.51a –53.43±13.24b –87.00±16.33c 第7天 15.22±3.09a –78.22±25.20b –30.65±2.65c 亚硝氮 ${\rm NO}_2^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –1.40±0.62a 4.14±2.71b 6.99±1.04b 第7天 2.54±0.95a 14.19±4.18b 13.79±1.38b 硝氮 ${\rm NO}_3^-{\text-}{\rm N}$ 第3天 –15.41±0.78a –30.70±4.00b –41.63±6.21c 第7天 –10.46±9.34a –26.14±5.28b –7.11±1.77a 活性磷 ${\rm PO}_4^{3-}{\text-}{\rm P}$ 第3天 –17.57±3.55a 9.88±0.50b 1.59±0.48c 第7天 –18.46±3.33a 5.69±1.61b –0.28±2.17c -
[1] 李军, 张辉, 李建文, 等. 光合细菌菌剂在提高板蓝根品质中的应用研究[J]. 中国医药导报, 2011, 8(13): 58-59. doi: 10.3969/j.issn.1673-7210.2011.13.024 [2] 彭智平, 李文英, 徐培智, 等. 光合菌剂对菜心产量和品质的效应评价[J]. 广东农业科学, 2012, 39(1): 11-13. doi: 10.3969/j.issn.1004-874X.2012.01.004 [3] BANEEJEE G, RAY A K. The advancement of probiotics research and its application in fish farming industries[J]. Rese Vet Sci, 2017, 115: 66-77. doi: 10.1016/j.rvsc.2017.01.016
[4] FARZANFAR A. The use of probiotics in shrimp aquaculture[J]. Fems Immuno Med Microbiol, 2006, 48(2): 149-158. doi: 10.1111/j.1574-695X.2006.00116.x
[5] JEONG S K, CHO J S, KONG I S, et al. Purification of aquarium water by PVA gel-immobilized photosynthetic bacteria during goldfish rearing[J]. Biotechnol Bioproc Engin, 2009, 14(2): 238-247. doi: 10.1007/s12257-008-0195-0
[6] SHIUNG L L, CHANG M J, CHANG Y T, et al. Photosynthetic purple sulfur bacterium Marichromatium RuA2 induces changes in water quality parameters, the occurrence of sulfonamide resistance gene and microbial community structure of marine aquaculture[J]. Aquaculture, 2018, 493: 68-78. doi: 10.1016/j.aquaculture.2018.04.055
[7] 丁雷, 赵德炳. 光合细菌在水产养殖上的应用研究与进展[J]. 水利渔业, 2001, 21(1): 23-25. doi: 10.3969/j.issn.1003-1278.2001.01.011 [8] KIM J K, LEE B K. Mass production of Rhodopseudomonas palustris as diet for aquaculture[J]. Aquacult Engin, 2000, 23(4): 281-293. doi: 10.1016/S0144-8609(00)00057-1
[9] SHAPLEIGH J P. Dissimilatory and assimilatory nitrate reduction in the purple photosynthetic bacteria[M]. Dordrecht, Netherlands: Springer, 2009: 623-642.
[10] 王树香, 吴玉华, 杨炳武, 等. 淡水养殖净化菌株的筛选及其对水质的改善效果[J]. 贵州农业科学, 2014(3): 98-101. doi: 10.3969/j.issn.1001-3601.2014.03.024 [11] 杨官娥, 张肇铭, 赵利华, 等. 神奇的光合细菌菌剂[J]. 农产品加工, 2010(3): 8-9. doi: 10.3969/j.issn.1671-9646-C.2010.03.004 [12] MUKHOPADHYAY M, CHAKRAVARTY D. Application of phototrophic purple non sulfur bacteria as fish feed for aquarium fishes[J]. J Environ Sociobiol, 2015(1): 21-21.
[13] 黄雪娇, 杨冲, 倪九派, 等. 1株高效去除氨氮的红假单胞菌的分离鉴定及特性[J]. 环境科学, 2016, 37(6): 2276-2283. [14] JIN H, ZHAO Y, LEI X C, et al. Treat shrimp wastewater with compound photosynthetic bacteria[C]//International Conference on Computer Distributed Control and Intelligent Environmental Monitoring (CDCIEM). Changsha: IEEE, 2011: 2352-2355.
[15] 冯亚丽. 海洋光合细菌在水产养殖中的应用基础研究[D]. 哈尔滨: 哈尔滨工业大学, 2017: 40-46. [16] 布坎南 R E, 吉本斯N E. 伯杰氏细菌鉴定手册[M]. 8版. 北京: 科学出版社, 1984: 1-22. [17] 郑卉. 一株光合细菌对养殖水水质调控及其在水体中的动态变化研究[D]. 宁波: 宁波大学, 2012: 15. [18] 张晓波, 朱笔通, 熊慧, 等. 沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris) CQV97对无机三态氮共存水体中氮素的去除效率及其影响因素[J]. 氨基酸和生物资源, 2015, 37(4): 38-45. [19] 文刚, 汪彬, 刘标, 等. 沼泽红假单胞菌R-3去除水体中氨氮的特性研究[J]. 湖南农业科学, 2017(6): 49-51. [20] 陈燕红, 杨紫红, 喻国辉, 等. 光照、氧气、pH和盐度对沼泽红假单胞菌2-8菌株生长和亚硝酸盐消除的影响[J]. 南方水产, 2010, 6(4): 1-5. doi: 10.3969/j.issn.1673-2227.2010.04.001 [21] 雷爱莹, 彭敏, 曾地刚, 等. 高效净水沼泽红假单胞菌的分离和鉴定[J]. 广西农业科学, 2005, 36(1): 57-58. doi: 10.3969/j.issn.2095-1191.2005.01.025 [22] 袁翠霖. 罗非鱼养殖系统微生物群落生态研究及潜在有益菌的筛选[D]. 广州: 暨南大学, 2011: 50. [23] 胡晓娟, 曹煜成, 文国樑, 等. 罗非鱼养殖系统潜在有机物降解菌的筛选及其降解能力测定[J]. 农业环境科学学报, 2014, 33(6): 1233-1239. [24] 徐之文. 水质指标测定与分析及在水产养殖中的应用[J]. 吉林畜牧兽医, 2014, 35(5): 18-20. doi: 10.3969/j.issn.1672-2078.2014.05.004 [25] 李卓佳, 李奕雯, 曹煜成, 等. 凡纳滨对虾海水高位池养殖水体理化因子变化与营养状况分析[J]. 农业环境科学学报, 2010, 29(10): 2025-2032. [26] BRENNER D J, KRIEG N R, STALEY J T. Bergey's manual of systematic bacteriology[M]. 2th ed. New York: Springer, 2005: 1-474.
[27] 黄雪娇, 杨冲, 罗雅雪, 等. 光合细菌在水污染治理中的研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2014, 34(11): 119-124. [28] 刘洋, 舒巧玉, 楼春燕, 等. 两株光合细菌的分离鉴定及其水质净化效果研究[J]. 淡水渔业, 2013, 43(5): 57-61. doi: 10.3969/j.issn.1000-6907.2013.05.010 [29] 秦宇胜, 张君枝, 马文林, 等. 北京地表水体光合细菌生长及脱氮除磷特性研究[J]. 环境工程, 2015(s1): 291-294. [30] 董艳珍, 亓东明. 一株光合细菌的净水能力分析[J]. 西昌学院学报(自然科学版), 2013(3): 13-15. doi: 10.3969/j.issn.1673-1891.2013.03.006 [31] ZHANG J, ZHANG W X, LI S Z, et al. A two-step fermentation of distillers' grains using Trichoderma viride and Rhodopseudomonas palustris for fish feed[J]. Bioprocess Biosyst Eng, 2013, 36(10): 1435-1443. doi: 10.1007/s00449-013-0887-5
[32] ZHOU X X, PAN Y J, WANG Y B, et al. In vitro assessment of gastrointestinal viability of two photosynthetic bacteria, Rhodopseudomonas palustris and Rhodobacter sphaeroides[J]. J Zhejiang Univ Sci B, 2007, 8(9): 686-692. doi: 10.1631/jzus.2007.B0686
[33] QI Z Z, ZHANG X H, BOON N, et al. Probiotics in aquaculture of China: current state, problems and prospect[J]. Aquaculture, 2009, 290(1/2): 15-21.
[34] 林启存, 朱丽敏, 沈小红, 等. 一株光合细菌的分离与鉴定[J]. 浙江农业科学, 2017, 58(8): 1444-1446. [35] ZHANG X, SHU M, WANG Y, et al. Effect of photosynthetic bacteria on water quality and microbiota in grass carp culture[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2014, 30(9): 2523-2531. doi: 10.1007/s11274-014-1677-1
[36] 杨莺莺, 曹煜成, 李卓佳, 等. PS1沼泽红假单胞菌对集约化对虾养殖废水的净化作用[J]. 中国微生态学杂志, 2009, 21(1): 4-6. [37] 李莎莎, 曹煜成, 胡晓娟, 等. 响应面法优化芽孢杆菌(Bacillus sp.) A4的培养参数[J]. 南方水产科学, 2017, 13(5): 85-93. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.05.012 [38] 张修建. 光合细菌制剂在水产养殖应用中需注意的问题[J]. 河北渔业, 2008(11): 8-9. doi: 10.3969/j.issn.1004-6755.2008.11.003 -
期刊类型引用(15)
1. 郑杰秋,邢东旭,李庆荣,黎尔纳,符兵,廖森泰,邹宇晓,周东来. 沼泽红假单胞菌的生物学功能及其在水产养殖中的研究进展. 中国畜牧兽医. 2025(02): 707-717 . 百度学术
2. 陈凯,魏巍,周瑶. 异养硝化细菌筛分及菌群修复黑臭水体的机制研究. 供水技术. 2024(05): 6-10 . 百度学术
3. 徐煜,胡晓娟,张淞,徐武杰,苏浩昌,文国樑,曹煜成. 5种因子对赤红球菌HDRR2Y去除氨氮和亚硝酸盐效应的影响. 南方水产科学. 2023(01): 67-74 . 本站查看
4. 景学武,乔之怡,柏静,许叶伟,张玟萱. 微生物菌剂净化鱼塘养殖污水的研究进展. 河北渔业. 2023(10): 36-40 . 百度学术
5. 胡晓娟,李秋芬,张洪玉,孙承文,杨移斌,陈凯,罗亮,谢国驷,曹煜成. 中国养殖主产区渔业微生物菌剂市场现状、问题及建议. 中国渔业质量与标准. 2023(06): 32-39 . 百度学术
6. 张淞,胡晓娟,徐煜,徐创文,杨铿,苏浩昌,徐武杰,文国樑,张建设,曹煜成. 响应面法优化赤红球菌HDRR2Y发酵培养参数. 微生物学杂志. 2022(05): 50-57 . 百度学术
7. 阳龙江,韩璐璐,杨成年,翟旭亮,梅会清,朱成科. 一株内循环流水养殖池塘光合细菌的分离鉴定及氮磷去除能力的研究. 渔业现代化. 2021(01): 33-40 . 百度学术
8. 王雨婷,周荣翔,李霁虹,张瑶,周婷婷,陈文才,彭云,汤曼利,马桂珍,许建和. 抗弧菌光合细菌的分离鉴定及对氨氮和亚硝态氮的降解特性. 南方水产科学. 2021(05): 26-33 . 本站查看
9. 叶欣,易春龙,李泰来,杨琳,庄旭超. 水环境微生物制剂的应用研究现状. 四川环境. 2021(06): 240-245 . 百度学术
10. 张瀚艺,张玉蕾,李长玲,朱春华,吴佳玲,卢家政,黄翔鹄. 环境因子对波吉卵囊藻-沼泽红假单胞菌藻菌体系氨氮吸收的影响. 广东海洋大学学报. 2021(06): 1-8 . 百度学术
11. 钟文武,吴敬东,赵树海,符世伟,周睿,杨光清,李志洪,严燕群,刘跃天. 组合型植物浮床对池塘水质的调控作用. 江苏农业科学. 2020(07): 255-259 . 百度学术
12. 张秀霞,张泽龙,孙敬锋,李军涛,王冬梅,郑佩华,鲁耀鹏,冼健安. 不同絮凝剂对光合细菌沉降与净水能力的影响. 水产养殖. 2020(06): 29-35 . 百度学术
13. 刘悦畅,李保珍,王涛,王兰. 2种菌联合修复农田土壤镉污染的研究. 水土保持学报. 2020(04): 364-369 . 百度学术
14. 阿热爱·巴合提,武瑞赟,肖梦圆,李平兰,谭春明. 益生菌的生理功能及作用机理研究进展. 食品与发酵工业. 2020(22): 270-275 . 百度学术
15. 胡晓娟,文国樑,田雅洁,苏浩昌,徐武杰,徐煜,许云娜,曹煜成. 不同培养条件下菌株NB5对氨氮的去除效果研究. 南方水产科学. 2020(06): 89-96 . 本站查看
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