鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是水产养殖中最常见的致病菌之一^[1]。当养殖环境恶化或机体受创时，养殖水产品极易感染鳗弧菌，进而导致体表“出血”，甚至全身性组织病变，最终死亡^[2]。近年来，随着养殖技术不断提高，水产养殖向高密度、集约化发展的同时，养殖水产品弧菌病的爆发也日趋严重，给水产养殖业带来巨大损失^[3]。由于鳗弧菌可对水产养殖造成严重危害，大量抗生素被用于防治该致病菌^[4-5]，这不仅导致细菌耐药性的产生，还给水产品质量安全带来巨大风险和隐患^[6]。

丁香酚是一种天然产物，广泛存在于丁香、月桂和罗勒等植物的茎、叶和花蕾中^[7]。研究表明丁香酚具有良好的杀菌、抑菌效果^[8-12]，其不仅是一种传统口腔治疗剂，还被用于水产食品防腐以延长货架期^[13-14]。同时，丁香酚还是一种良好的渔用麻醉剂，可以缓解转运过程的应激反应，大幅提高养殖生产和流通环节鲜活水产品的成活率^[15-16]。近年来，有研究发现丁香酚对水产致病菌有一定的抑菌作用^[17-18]。由于毒性低、消除快，有学者认为丁香酚有望替代抗生素成为一种安全、绿色的新型抗菌剂，用于防治水产养殖中的细菌性疾病^[19]。

随着人民生活水平的不断提高，水产品质量安全日益受到重视。近年来水产品中的违禁药物添加屡禁不止，给水产业造成巨大冲击。因此，亟需一种安全、有效的渔用药物为水产养殖业的健康发展保驾护航。本文以鳗弧菌为研究对象，探索丁香酚对水产养殖业典型致病菌的抑菌效果，为水产养殖业中鱼类细菌性疾病的防控提供研究基础。

1.   材料与方法

1.1   仪器设备

生化培养箱(IC612C，日本Yamato)；酶标仪(VERSMAX，美国MD)；可见分光光度计(L2，上海仪电分析仪器有限公司)；生物安全柜(MSC1.8，美国Thermo)；多轨道恒温培养振荡器(ZHWY-200D，上海智诚分析仪器制造有限公司)；比浊仪(WGZ-2XJ，上海昕瑞仪器仪表有限公司)；天平(XS603S，瑞士梅特勒)；移液枪(10~100 μL，100~1 000 μL，1~10 mL)；中央纯水系统(Centra R-200/purilab classia，ELGA)。

1.2   实验材料

鳗弧菌ATCC43308 (广东环凯微生物科技有限公司)；丁香酚(纯度≥99%，上海医疗器械有限公司)；无水乙醇(广州化学试剂厂，99%)；2216E琼脂(美国BD公司)；2216液体培养基(美国BD公司)；MH肉汤(青岛高科技园海博生物技术有限公司)；游标卡尺(广陆数字测控股份有限公司)；牛津杯(Φ 6 mm×8 mm×10 mm，上海精密仪器仪表有限公司)；细菌培养板(96孔，海门市海克拉斯实验器材有限公司)；生理盐水(广东环凯微生物科技有限公司)。实验所用试剂与耗材均作灭菌处理。

1.3   实验方法

1.3.1   丁香酚储备溶液配制

称取0.64 mg丁香酚于烧杯中，以5 mL无水乙醇助溶后，转移至容量瓶中，超纯水稀释定容至100 mL，储备液质量浓度为6 400 μg·mL^–1。实验所需系列浓度均用此储备液稀释配制。

1.3.2   鳗弧菌菌液配制

挑取一环鳗弧菌接种至2216液体培养基，30 ℃振荡培养24 h增菌。测定增菌液麦氏浊度值(McFarland，MCF)，用生理盐水稀释至MCF值约为0.5 (0.5 MCF的菌液浓度相当于10⁸ CFU·mL^–1)，继续稀释至菌液浓度为10⁵ CFU·mL^–1，备用。

1.3.3   抑菌活性的测定

将牛津杯置于培养皿中央，吸取3 mL浓度为10⁵ CFU·mL^–1的菌液于90 mL的2216E培养基中混合均匀，倾注平板(约20 mL·平板^–1)，静置待平板凝固。凝固后用镊子将牛津杯轻轻拔出，吸取质量浓度为6 400 μg·mL^–1的丁香酚150 μL注入孔中。丁香酚抑菌平板实验设置9个平行。由于丁香酚溶液配制过程中用到乙醇，故于平板孔中注入150 μL体积分数为5%的乙醇为背景比较。为比较分析丁香酚与抗生素的抑菌差异性，于平板孔中注入150 μL质量浓度为200 μg·mL^–1的氯霉素溶液进行对比实验。平板孔中药物注入完成后，将平板置于培养箱中30 ℃培养24 h。培养完毕，以游标卡尺用十字交叉法测量抑菌圈直径。

1.3.4   最低抑菌浓度(minimum inhibit concentration，MIC)测定

根据微量二倍稀释法，采用96孔微孔板(8行×12列)进行抑菌实验^[17]。抑菌实验设实验组4平行(A、B、C、D行)、空白对照(E行)、阳性对照(F行)和阴性对照(G行)。预先于所有微孔中加入100 μL的MH肉汤，各组操作如下。

实验组：于第1列微孔中加入100 μL质量浓度为6 400 μg·mL^–1的丁香酚溶液，与预先添加的MH肉汤充分混合后，吸取100 μL混合液注入第2列，充分混合后再次吸取100 μL混合液注入第3列，逐级稀释至最后1列，吸取100 μL混合液弃去，最后于各微孔中添加100 μL菌液。

空白对照：第1列加入100 μL体积分数为5%的乙醇溶液，与预先添加的MH肉汤充分混合后，与实验组操作类似，逐级稀释，最后于各微孔中添加100 μL菌液。

阴性对照：第1列加入6 400 μg·mL^–1丁香酚溶液，逐级稀释后，于各微孔中添加100 μL生理盐水。

阳性对照：各微孔中添加100 μL菌液，与预先添加的MH肉汤充分混合。

最后将微孔板置于培养箱中30 ℃培养24 h。培养结束后，将微孔板置于酶标仪中于560 nm波长下读取吸光值，并根据吸光值确定丁香酚对鳗弧菌的MIC值。

1.3.5   最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)测定

吸取MIC所在列及其之前两列微孔中的培养液100 μL于预先添加2216E培养基的平板上均匀涂布，随后置于培养箱中30 ℃培养24 h。培养结束后根据细菌生长情况判定MBC值。

1.3.6   丁香酚对鳗弧菌的抑菌时效

取1 mL鳗弧菌菌液分别接种到丁香酚质量浓度为0 μg·mL^–1(空白对照组)、400 μg·mL^–1(MIC组)和800 μg·mL^–1(MBC组)的2216培养液中，每组双平行。30 ℃振荡培养36 h。在培养过程中，每隔2 h于波长为560 nm处测定培养液的吸光值。

2.   结果

2.1   丁香酚对鳗弧菌的抑菌活性

抑菌圈直径≥20 mm为极敏，15~20 mm为高敏；10~15 mm为中敏；小于10 mm为低敏^[20]。结果显示，丁香酚质量浓度为6 400 μg·mL^–1时，抑菌圈直径为 (21.13±0.74) mm，相对标准偏差为3.50% (表1)。表明鳗弧菌对丁香酚极敏，此浓度丁香酚具有良好的抑菌活性。5%的乙醇溶液抑菌圈直径为8 mm，即鳗弧菌对其不敏感，证明丁香酚溶液助溶剂背景对其抑菌敏感性几乎没有影响。从氯霉素的抑菌圈直径 [(44.38±0.75) mm] 看，鳗弧菌对其极敏，相对标准偏差为1.69%，抑菌效果明显强于丁香酚，这也可能是氯霉素禁而不绝的原因之一。

表  1  丁香酚对鳗弧菌的抑菌圈直径

Table  1.  Inhibition zone diameter of eugenol on V. anguillarum mm

	直径 diameter									平均 mean	标准差 tandard deviation	相对标准偏差/% relative standard deviation
丁香酚 eugenol	21.06	22.24	20.86	20.64	20.56	21.63	20.05	20.94	22.16	21.13	0.74	3.50
氯霉素 (200 μg·mL–1) chloramphenicol	44.32	45.23	43.26	43.34	44.64	45.28	43.86	44.88	44.62	44.38	0.75	1.69
5%乙醇 ethanol	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	8.00	0.00	0.00

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2.2   丁香酚对鳗弧菌的MIC

丁香酚对鳗弧菌的MIC实验结果显示(图1)，当丁香酚质量浓度≥400 μg·mL^–1时，30 ℃条件下培养24 h实验组吸光值与阴性对照基本一致，表明鳗弧菌没有生长；当丁香酚质量浓度<400 μg·mL^–1时，实验组吸光值与阳性对照基本一致，表明鳗弧菌的生长没有受到抑制。因此，丁香酚对鳗弧菌的MIC值为400 μg·mL^–1。从空白对照组结果来看，丁香酚溶液助溶剂背景对鳗弧菌生长基本没有影响。

图  1  丁香酚对鳗弧菌的MIC

Figure  1.  Minimum inhibitory concentration of eugenol against V. anguillarum

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2.3   丁香酚对鳗弧菌的MBC

丁香酚对鳗弧菌的MBC实验结果显示(图2)，涂抹丁香酚质量浓度为400 μg·mL^–1的菌液的平板上，鳗弧菌生长良好，而涂抹丁香酚质量浓度为800 μg·mL^–1和1 600 μg·mL^–1的菌液的平板上，无鳗弧菌生长。根据《食品中抗菌药物残留的化学分析》^[21]，以无菌生长的最低浓度为丁香酚对鳗弧菌的MBC值。即该实验条件下丁香酚对鳗弧菌的MBC为800 μg·mL^–1。

图  2  30 ℃培养24 h平板上鳗弧菌的生长状况

Figure  2.  Growth of V. anguillarum on plate incubated at 30 ℃ for 24 h

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2.4   丁香酚对鳗弧菌的抑菌时效

丁香酚对鳗弧菌的抑菌时效实验结果显示(图3)，与空白对照相比，MIC组中鳗弧菌的生长状况存在较大差异。4~18 h鳗弧菌基本没有生长(OD_{560 nm}为0.05~0.06)，18~32 h鳗弧菌开始缓慢生长(OD_{560 nm}为0.06~0.39)，32 h后处于稳定生长(OD_{560 nm}为0.37~0.39)。各阶段相应时间MIC组中培养液的吸光值远小于空白对照组。MIC组中鳗弧菌在18 h后开始生长，但是与空白对照相比十分缓慢，32~36 h的吸光值仅为空白对照组的1/5。即使鳗弧菌开始生长，但是丁香酚对其生长依然存在较大的抑制作用。相对于空白对照组和MIC组，MBC组培养液所测吸光值极小(0.003~0.01)，表明鳗弧菌基本没有生长。

图  3  丁香酚对鳗弧菌的抑菌时效

Figure  3.  Antibacterial aging effect of eugenol on V. anguillarum

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3.   讨论

随着养殖池塘的老化以及种质资源的退化，水产养殖病害日趋严重^[22-23]。因此，大量抗生素类药物被用于鱼病防治^[24]。然而，随着研究的不断深入，抗生素的危害也逐渐被人们认识。研究表明，一些抗生素如氯霉素、呋喃西林等对人体产生“三致”作用，严重危害人体健康^[25]。抗生素能持久存在于养殖环境中，使得细菌产生耐药性，不仅使得药物对鱼病的治疗效力降低，也使得人体的抗病能力下降^[19,26]。为确保水产品质量安全，保护人体健康，近年来多种抗生素药物已被禁止用于水产养殖业。研究发现多种中草药具有抑菌作用^[27-28]，但从中草药抑菌效果来看，难以在水产养殖业中广泛应用^[29]。丁香酚作为一种天然的植物提取物，因其具有良好的抑菌效果，且毒副作用小、不易产生耐药性且价格低廉受到研究者的广泛关注。

目前，在食品领域丁香酚已被广泛用于食品贮藏保鲜，以延长货架期^[13]。并且在水产领域十分重视丁香酚对鲜活水产品的麻醉效果，但是关于丁香酚对养殖和流通环节鲜活水产品致病菌的抑菌作用的研究甚少^[15-16]。本研究显示丁香酚对鳗弧菌的MIC和MBC分别为400 μg·mL^–1和800 μg·mL^–1，表明其对水产养殖环境中广泛存在的主要致病菌鳗弧菌具有良好的抑菌效果。且抑菌时效实验表明(图3)，400 μg·mL^–1的丁香酚在18 h内基本抑制了鳗弧菌的生长。即使在18 h后鳗弧菌开始缓慢生长，但是与空白对照组相比，对应时间(32~36 h)的吸光值仅为空白对照组的1/5，表明丁香酚依然对鳗弧菌的生长存在较大的抑制作用。

与食源性致病菌研究结果相比(表2)，鳗弧菌对丁香酚的敏感性与金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)、沙门氏菌(Salmonella anatum)、李斯特菌(Listeria monocytogenes)、大肠杆菌(Escherichia coli)相似，表明丁香酚不仅可以应用于食品领域贮藏保鲜，也可应用于水产行业细菌性疾病防控。与水产致病菌研究结果相比(表2)，鳗弧菌对丁香酚的敏感性高于嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、维氏气单胞菌(A. veronii)、弗氏柠檬酸杆菌(Citrobacter freundii)，低于格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)，由此可见鳗弧菌对丁香酚的敏感性相对较高，具有较高的研究价值。

表  2  丁香酚对不同细菌MIC和MBC

Table  2.  Minimum inhibitory concentration and minimum bactericidal concentration of eugenol against different bacteria

细菌种类 bacterial species	最低抑菌浓度/μg·mL–1 MIC	最小杀菌浓度/μg·mL–1 MBC	文献 Reference
金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus	600	700	[30]
	128~512	–	[31]
	400	600	[32]
李斯特菌 Listeria monocytogenes	500	800	[33]
弯曲空肠杆菌 Campylobacter jejunni	1.25	–	[34]
沙门氏菌 Salmonella anatum	400	600	[32]
大肠杆菌 Escherichia coli	400	600	[32]
嗜水气单胞菌 Aeromonas hydrophila	800	1 600	[18]
	800~3 200	1 600~3 200	[17]
维氏气单胞菌 Aeromonas veronii	800	1 600	[18]
格氏乳球菌 Lactococcus garvieae	30	–	[35]
弗氏柠檬酸杆菌 Citrobacter freundii	1 600	1 600	[18]
鳗弧菌 Vibrio anguillarum	400	800	本研究

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从本研究结果与相关研究结果的差异性来看(表2)，不同水产致病菌对丁香酚的敏感性差异明显，这可能与丁香酚的抑菌机理有关。目前关于丁香酚抑菌机制的说法尚不统一。有研究认为丁香酚通过作用于细菌细胞内酶系统或功能蛋白，进而抑制细胞新陈代谢，从而起到抑菌作用^[30]；还有研究认为丁香酚通过改变细菌毒力达到抑菌效果^[31]；然而普遍接受的理论是丁香酚通过破坏细菌细胞膜产生抑菌作用^[10-11,36]。因此，深入了解丁香酚对鳗弧菌的抑菌机理，对其未来应用于水产养殖业细菌性疾病防控和在鲜活水产品流通环节中如何起到麻醉和抑菌双重作用至关重要。

由于丁香酚具有广泛的药理和生物学特性^[37]，用丁香酚防控水产养殖细菌性疾病已成为新兴的研究热点。但在实验室得出的体外抑菌实验结果应用于实际生产时，要考虑到水产动物对该药的承受能力，正确的用药范围应是既能防控细菌性疾病又不超过水产动物对该药的耐受力。本研究进行了丁香酚对鳗弧菌的体外抑菌实验，其结果可作为防控水产养殖和鲜活水产品流通过程中鳗弧菌感染的依据，但在实际生产中的应用效果有待进一步验证。

4.   结论

作为一种高效、安全的渔用麻醉剂，丁香酚已在许多国家和地区广泛应用，在中国也已用于鲜活水产品的转移和运输环节^[38-39]。本研究表明丁香酚对水产养殖业典型致病菌鳗弧菌具有抑菌和杀菌效果，存在防止活体感染和降低违禁药物使用的潜力。但如何充分发挥丁香酚的麻醉效果，深入发掘丁香酚对水产致病菌的抑菌潜力，还有待进一步的研究。