Construction of knock-out mutant of sRNA srvg17985 in Vibrio alginolyticus ZJ-T and its preliminary function analysis
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摘要:
利用同源重组技术构建了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) ZJ-T小RNA srvg17985的缺失突变株，并比较研究了野生株和srvg17985突变株在LBS中的生长特性、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收利用、对抗生素的抗性以及生长代谢等生物学特性。结果表明，小RNA srvg17985缺失后不影响溶藻弧菌在LBS中的生长、运动性、胞外蛋白酶分泌、对铁的吸收利用、对抗生素的抗性以及对测定的多数碳源、氮源的代谢；但srvg17985突变株对昆布多糖(laminarin)、果胶(pectin)以及二羟基丙酮(dihydroxyacetone)的利用增强，并转变为可利用丙氨酸-天冬氨酸(Ala-Asp)作为单一氮源。
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关键词:
- 溶藻弧菌 /
- 小RNA srvg17985 /
- 缺失突变株 /
- 功能分析
Abstract:We constructed the sRNA srvg17985 knock-out mutant in Vibrio alginolyticus ZJ-T by using homologous recombination, so as to compare the biological characteristics of growth in LBS medium, motility, extracellular protease secretion, iron utilization, antibiotic resistance and metabolism between the wild type and the mutant strains. The results show that the absence of sRNA srvg17985 did not affect the growth in LBS medium, motility, extracellular protease secretion, iron utilization, antibiotic resistance and most of the tested carbon and nitrogen sources metabolism in V. alginolyticus. However, the mutant showed better utilization of laminarin, pectin and dihydroxyaceton, and gained the ability to utilize alanine-aspartic acid (Ala-Asp) as the sole nitrogen source.
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Keywords:
- Vibrio alginolyticus /
- sRNA srvg17985 /
- knock-out mutant /
- function analysis
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长体圆鲹(Decapterus macrosoma)，又名长身圆鲹，隶属于鲈形目、鲹科、圆鲹属，主要分布于中国南海、印度尼西亚、澳洲和日本南部沿海等地[1]。长体圆鲹在中国南海分布较广，是南海灯光围网渔业的主要捕捞对象，具有较高的经济价值[2-5]。目前，国内外学者关于长体圆鲹的研究主要集中在生长繁殖[6]和资源评估[7-8]方面，与种群遗传和分子标记相关的研究报道较少。微卫星标记仅见翟云等[9]开发蓝圆鲹微卫星标记中获得5个跨物种通用标记可于用长体圆鲹，并无专门针对长体圆鲹开发的微卫星标记。种群遗传信息的匮乏，将大大影响对其资源的评估和长期有效的管理。
微卫星分子标记因是共显性标记，具有多态性高、变异性强、数据易统计等突出优点[10]，广泛应用于海洋生物遗传结构及遗传多样性分析[11-12]。但由于微卫星标记通用性较差，常常具有极强的种属特异性。鱼类微卫星标记开发中多以二核苷酸重复为主[13-15]，普遍认为它们具有较高的遗传变异[16]，但是也有部分学者研究认为三、四核苷酸重复位点较二核苷酸重复具有更高的筛选效率和多态性[17-19]。
本研究通过RAD-Seq高通量测序方法开发长体圆鲹二、三核苷酸微卫星分子标记，并对测试群体进行多样性分析，同时比较二、三核苷酸的筛选效率和多态性差异，旨在为长体圆鲹种群遗传结构及遗传多样性分析提供技术基础，并为该资源的评估和管理提供帮助。
1. 材料与方法
1.1 样品采集与基因组DNA提取
长体圆鲹样品采集于中国南海中沙群岛东部海域，共35尾。剪取部分肌肉样品加入无水乙醇保存。每个样品剪取少量肌肉组织，使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(天根，北京) 提取基因组DNA，0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，−20 ℃保存备用。
1.2 高通量测序与引物合成
使用HiSeq2000高通量测序仪(Illumina，USA) 对长体圆鲹基因组DNA进行RAD-seq (测序服务由广州基迪奥生物科技有限公司提供)，经生物信息学搜索出微卫星位点[20]。使用Premier 5.0软件在重复单元侧翼序列上选择性设计出112条引物，主要参数为：G-C含量为40%~60%，引物长度为18~25 bp，退火温度为45~60 ℃，预期产物长度180~320 bp。送上海英潍捷基贸易有限公司合成引物。
1.3 引物筛选与分型检测
选取3个样本混合成的基因组DNA为模板，优化PCR反应条件，对引物进行首轮筛选，琼脂糖电泳检测是否能扩增出稳定且均一的目的片段。之后选取8尾个体的基因组DNA作为模板，使用三引物法[21]，利用M13荧光接头引物进行PCR扩增，扩增产物送华大基因公司经毛细管电泳进行等位基因分型，检测引物是否具有多态性。PCR反应体系为15 μL，其中包括10×PCR Buffer 1.5 μL，2.5 mmol·L–1 MgCL2 1.2 μL，2 mmol·L–1 dNTPs 2 μL，M13正向引物(10 μmol·L–1) 0.2 μL，M13反向引物(10 μmol·L–1) 0.6 μL，M13通用荧光引物(10 μmol·L–1) 0.5 μL，Taq酶(5 U·μL–1) 0.15 μL，DNA模版1 μL，加双蒸水至15 μL。PCR扩增程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55~60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，35个循环；94 ℃变性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，8个循环；72 ℃延伸30 min。
1.4 长体圆鲹群体遗传学评价
使用35尾长体圆鲹个体的基因组DNA为模板，对通过筛选的微卫星标记的种群遗传学特征进行评价。PCR反应体系和条件、等位基因分型方法如上。使用软件Genepop 4.0[22]对每个标记的种群遗传学特征值进行计算，包括等位基因数(Na)、表观杂合度(Ho)和期望杂合度(He)，进行“哈迪-温伯格”平衡(HWE)检验和连锁不平衡检测，并对P值进行Bonferroni校正。使用Cervus 3.0.7[23]软件计算多态信息含量(PIC)。
2. 结果
2.1 高通量测序结果与微卫星位点分析
RAD-seq高通量测序共获得长体圆鲹基因组原始数据2.06 G，GC含量为41.43%，Q30达93.05%。说明测序结果质量较好，可用于后续分析。搜索后共获得微卫星序列58 180条，一至六核苷酸重复微卫星位点70 508个，其中二核苷酸重复微卫星位点最多(37 646个)，占总数的53.39% (表1)，说明二核苷酸重复为主要的微卫星类型。二核苷酸重复微卫星位点共有4种重复类型，4种类型重复微卫星数量相差较大，AC/GT类有29 754个，占二核苷酸重复的68.4%；AG/CT类有6 487个，占17.2%；AT/TA有1 340个，占3.6%；GC/CG仅有65个，占0.17%。
表 1 长体圆鲹基因组中不同类型SSR统计Table 1. Different types of SSR statistics in D. macrosoma genome重复单元
repeat unit微卫星数量/个
number of microsatellite占比/%
ratio一核苷酸 mono-nucleotide 8 184 11.61 二核苷酸 di-nucleotide 37 646 53.39 三核苷酸 tri-nucleotide 13 960 19.80 四核苷酸 tetra-nucleotide 7 741 10.98 五核苷酸 penta-nucleotide 2 255 3.20 六核苷酸 hexa-nucleotide 722 1.02 合计 total 70 508 100.00 2.2 PCR引物设计和筛选
选取112条二、三核苷酸重复序列设计引物，其中二核苷酸重复为81对，三核苷酸重复为31对。经过筛选后，共有27对引物通过筛选(表2)，27对引物扩增的序列中18个位点为二核苷酸重复，重复次数为9~14次；8个位点为三核苷酸重复，重复次数为6~10次。二核苷酸重复位点检出效率为22.2%，三核苷酸重复位点检出效率为25.8%。
表 2 27对长体圆鲹微卫星引物信息Table 2. Information of 27 pairs of primers in D. macrosoma位点
locus引物序列 (5'−3')
primer sequence重复单元
repeat motif退火温度/℃
annealing temperature期望长度/bp
allele sizeDma03 F:CCACGCCTATTGAGTTACAGA (CA)9 60 186 R:GAGCCAGTGGATGAACAGAGT Dma07 F:GCCCCTGTGGGTGTGTGA (CA)9 60 225 R:GGGTGGTGGGTTCGGTTT Dma12 F:GAACCAGTGCCTACAATAGA (AC)9 60 243 R:CTGCTCACGGTAAGTCCA Dma15 F:ACAGGAAGGAACAGGACAG (TG)10 55 254 R:TATTGAAGTGAAAAAGCCG Dma22 F:CGCTGTTGAAATGAAGAAGA (GT)10 60 317 R:AGTGATGTCGCCTCATAAAT Dma23 F:AAACTGAGGGCGAGATAGAGG (AC)10 55 190 R:CCACAGGCTGAGTAAACCAAC Dma26 F:ATCCCATTCACCGACATAG (TG)10 58 258 R:CTGTGGTATCGTTCCCTGT Dma28 F:TGATTGGCTTCTACTCTGC (AC)10 55 281 R:AGTGGCTTGTTTGACTCTTAT Dma36 F:GGATGTAGTGAAGAGGGGAG (GT)11 55 239 R:CACAATCAGTGTTATGGCAG Dma38 F:GCCAATAAAGGCAAACAGT (CA)11 60 227 R:ATCCGAGACAAAGACATACAA Dma39 F:AGTGTGCTGACTTTTCTCTG (CA)11 55 241 R:TTATTGTTTGTTGTCTGGGT Dma45 F:CTCCTTTTTCTTCTTCCTCT (CA)11 60 281 R:CTACCTGCTCTTCAACTCAT Dma51 F:TGACAGCCTCCACTACTCC (GA)12 55 225 R:GCTAACCAGACACGCAAA Dma54 F:AAAGCCCATCTGTCTCGT (GT)12 60 202 R:TGTTTCAGTCCGTTCCTG Dma58 F:TCAAGAGGGAGTGGGAGC (AC)12 58 279 R:TCAAATGGGTGTTTAGCG Dma64 F:GCTCAGACTGCGTGGACA (TG)13 55 314 R:GCTGGTGAACAACAGGACA Dma72 F:TTCCGCAGGCATAAAAAC (CT)13 58 301 R:CCAAGGTCCGCTACACTA Dma76 F:TTCTCGCTGACCTGCTTG (TG)14 55 253 R:GCGTCCTCGTCGTCTTTC Dma81 F:GAGACACGGTCAGAAAACA (TGC)6 60 216 R:GGAAGTAGGACTCTAGGGG Dma82 F:CTGTCACTCCATTCCTATTCC (GTT)6 58 244 R:CCTACATTTGTGCTTTTGTTC Dma83 F:CTCTAAAGCCGACCTAACC (CTT)6 58 239 R:TGTCTCAACACAGCGAAAC Dma84 F:AAACTAACTCATCACCAG (TGT)6 55 283 R:AAACGACAGGAACTCAAT Dma85 F:CTCACTTTGACCCAACCAG (AGG)6 55 256 R:CCTTTCACCGAGACACCAG Dma131 F:TGCGGATGGGTGGTAGTGT (GGT)8 55 208 R:ATTGCTGGTAGTCGGTGGC Dma132 F:CCCAGTGAGACCAGAACCA (GCT)8 55 268 R:GACCCGTAGACAGGAGAGT Dma135 F:GTTGTTGTTTTTTTCCTT (GCA)9 55 301 R:CATCAGTCTGGCTTTATA Dma145 F:ACGATACAGCAGCCGAAG (TCA)10 60 197 R:AGTGATGTCGCCTCATAAAT 2.3 微卫星标记的种群遗传学评价
使用1个采集自南海东南部海域的长体圆鲹群体对筛选合格的微卫星标记进行种群遗传学评价。所有27个标记在测试群体中共检测到285个等位基因，等位基因数为5~17，Ho为0.342 9~0.857 1，平均为0.631 7；He为0.538 3~0.911 8，平均为0.7968。PIC为0.497~0.886，平均为0.780 9 (表3)，表明开发的微卫星位点具有较高的多态性。共有19个标记等位基因频率符合“哈迪-温伯格”平衡。连锁不平衡检测表明各位点间无连锁不平衡现象。
表 3 长体圆鲹微卫星标记的种群遗传学特征Table 3. Characteristics of microsatellite loci in D. macrosoma位点
locusN Na Ho He PHWE PIC Dma03 35 8 0.857 1 0.790 9 0.042 0 0.746 0 Dma07 35 9 0.771 4 0.855 9 0.553 4 0.825 0 Dma12 34 11 0.685 7 0.816 6 0.106 4 0.809 0 Dma15* 35 14 0.542 9 0.911 8 0.000 0 0.890 0 Dma22* 32 14 0.485 7 0.813 2 0.000 0 0.864 0 Dma23 34 17 0.714 3 0.864 8 0.003 3 0.868 0 Dma26* 34 14 0.428 6 0.869 1 0.000 0 0.870 0 Dma28 35 11 0.742 9 0.837 7 0.035 3 0.803 0 Dma36 35 9 0.685 7 0.786 3 0.054 5 0.743 0 Dma38* 34 12 0.628 6 0.851 2 0.000 0 0.849 0 Dma39* 33 12 0.514 3 0.782 0 0.000 0 0.793 0 Dma45 34 12 0.771 4 0.847 8 0.139 2 0.844 0 Dma51* 31 12 0.485 7 0.784 5 0.000 0 0.859 0 Dma54 35 15 0.771 4 0.900 6 0.139 0 0.878 0 Dma58 34 12 0.771 4 0.845 6 0.449 7 0.843 0 Dma64* 31 13 0.428 6 0.788 3 0.000 0 0.865 0 Dma72 35 8 0.628 6 0.713 9 0.155 7 0.659 0 Dma76 35 12 0.685 7 0.908 1 0.003 6 0.886 0 Dma81 35 8 0.628 6 0.795 0 0.045 7 0.752 0 Dma82 35 5 0.485 7 0.538 3 0.023 6 0.497 0 Dma83* 34 8 0.342 9 0.705 8 0.000 0 0.674 0 Dma84 35 7 0.542 9 0.704 8 0.005 9 0.649 0 Dma85 35 8 0.828 6 0.747 8 0.876 9 0.704 0 Dma131 35 9 0.628 6 0.717 6 0.646 6 0.661 0 Dma132 35 8 0.657 1 0.746 6 0.365 5 0.692 0 Dma135 34 10 0.742 9 0.840 5 0.241 8 0.835 0 Dma145 34 7 0.600 0 0.749 3 0.077 4 0.725 0 注：N. 有效样品数；Na. 等位基因数；Ho. 表观杂合度；He. 期望杂合度；PHWE. “哈迪-温伯格”平衡显著性检验P值；PIC. 多态信息含量；*. 经Bonferroni校正后显著背离“哈迪-温伯格”平衡 (校正P<0.001 85) Note: N. effective number of samples; Na. number of alleles; Ho. observed heterozygosity; He. expected heterozygosity; PHWE. Hardy–Weinberg probability test; PIC. polymorphism information content; *. significant deviation from HWE after Bonferroni's correction (adjusted P-value<0.001 85) 3. 讨论
3.1 高通量测序发掘微卫星序列的技术优势
传统微卫星标记开发方法耗时长、花费高、技术难度大。以磁珠富集法为例，标记开发过程中基因组DNA浓度、接头连接效率、富集过程中的杂交温度以及洗脱条件的控制等因素都会影响微卫星筛选的效率[24-25]，且最终获得的有效微卫星序列仅几百条[26-27]。相比较而言，高通量测序技术开发微卫星标记，省略了建库、克隆、筛选等，只需提取基因组DNA测序，利用生物信息学手段可直接获取微卫星序列，通常是传统方法获得微卫星序列数目的几百倍[15,28-29]，具有高效、便捷、准确的特点，能够满足短时间内大批量微卫星位点的开发需求，比如连锁图谱构建、QTL定位等[30-31]。
本次RAD-seq高通量测序共获得长体圆鲹基因组原始数据2.06 G，GC含量为41.43%，测序质量Q30达93.05%；共获得微卫星序列58 180条，一至六核苷酸重复微卫星位点70 508个。说明测序质量稳定高效，并获得了数量庞大、类型丰富的长体圆鲹微卫星序列，可用于后续长体圆鲹微卫星标记的大规模开发和相关遗传学研究。
3.2 不同核苷酸重复微卫星位点比较
本次高通量测序结果表明在长体圆鲹微卫星位点中二核苷酸重复为主要重复类型，AC/GT类重复数量最为丰富，GC/CG重复较为少见。此结果与大量水产动物微卫星位点研究结果相一致[32-34]，差异仅在于比例多少，以及除二核苷酸重复占主要地位外其他核苷酸重复的含量差异。熊良伟等[33]对中华鳑鲏(Rhodeus sinensis)微卫星的分析中，二核苷酸占总微卫星位点的53.59%，其次为单核苷酸重复，二核苷酸重复中AC/GT类占60.63%，GC/CG仅占0.32%。在裸体异鳔鳅鮀 (Xenophysogobio nudicorpa)中[32]，二核苷酸重复占总微卫星位点比例高达83.15%，AC/GT类重复占49.36%，GC/CG重复仅有4个。
多数鱼类开发的微卫星标记以二核苷酸重复为主，但研究表明，在人类基因组中三核苷酸重复序列与遗传疾病的发生有关，并且具有较高的多态性和遗传稳定性[35]。部分学者对三、四核苷酸重复微卫星标记的研究结果存在差异。房祖业等[28]对大刺鳅 (Mastacembelus armatus) 二、三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选发现二核苷酸重复较三、四核苷酸重复具有更高的筛选效率和多态性；鲁翠云等[17]、谭照君等[18]、李文升等[19]的研究认为三、四核苷酸具有更高的多态性和分型效果。长体圆鲹二、三核苷酸的筛选效率分别为22.2%和29.0%，PIC分别为0.827 4和0.687 7 (表4)。就筛选效率而言，三核苷酸重复略高于二核苷酸重复，但二者相差不大。PIC为衡量种群遗传变异程度的重要指标[36]，二核苷酸重复多态性明显高于三核苷酸重复。本文中长体圆鲹二核苷酸重复筛选效率低于三核苷酸重复，但多态性二核苷酸重复明显高于三核苷酸重复。因此，筛选效率和多态性的差异可能由种属差异或其他多种因素导致。
表 4 长体圆鲹二、三核苷酸重复微卫星标记的比较Table 4. Comparison on di- and trinucleotide-repeated microsatellite loci in D. macrosoma序列
sequence引物数
primer number重复次数
repeat number筛选效率
efficiencyPIC 二核苷酸重复
di-nucleotide-repeated18 9~14 22.2% 0.827 4 三核苷酸重复
tri-nucleotide-repeated9 6~10 29.0% 0.687 7 通过筛选的27对引物中18个位点为二核苷酸重复，重复次数为9~14次不等；9个位点为三核苷酸重复，重复次数为6~10次不等，符合Ellegren[37]提出的真核生物微卫星位点重复大部分在30次重复以下。但Ellegren[37]认为二核苷酸重复以15~19次为主，本文中高通量测序获得的二核苷酸重复主要在6~15次。基于Weber[38]的研究结果，重复次数高的微卫星在种群中表现出的多态性较高，龚小玲等[39]对澳洲鳗鲡 (Anguilla australis) 进行标记开发时发现，微卫星重复序列的重复次数过高会影响PCR效果，应选择居中的重复次数为宜。长体圆鲹二核苷酸重复PIC为0.827 4，具有较高多态性，表明选择6~15次的二核苷酸重复是合适的。
3.3 微卫星标记的种群遗传学特征
群体杂合度的高低反映了群体在多个基因座上的遗传变异及群体遗传多样性丰富度[19]。本研究中长体圆鲹中沙群体的平均Ho为0.631 7，平均He为0.796 8，说明长体圆鲹该群体的遗传多样性较高。平均Ho和He存在差异，说明存在杂合子缺失或者纯合子过剩的情况。PIC也是衡量群体遗传多样性的重要指数，Botstein等[36]认为基因标记PIC>0.5为高度多态位点，0.25<PIC<0.5为中度多态位点，PIC<0.25为低度多态性位点，通常不作为遗传多样性分析。本文中长体圆鲹位点除1个为中度多态外，其他位点均为高度多态位点。表明开发所得的长体圆鲹微卫星标记在中沙群体中具有较好的遗传稳定性和丰富的遗传多样性。
在所有27个位点中有8个位点偏离了“哈迪-温伯格”平衡，这些位点不适合进一步的遗传分析。近亲杂交、无效等位基因、种群退化和自然选择等因素皆可能导致微卫星位点偏离HWE[15]。
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图 1 srvg17985的序列信息
下划线部分为srvg17985的序列，深灰色背景部分依次为上下游同源臂扩增的引物对
Figure 1. Sequence information of srvg17985
The underlined is the sequence of srvg17985 and the dark gray background indicates the primer pairs for the amplification of two flanking fragments.
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图 2 重组自杀质粒构建和突变株筛选
A1. 上游；A2. 下游
Figure 2. Construction of recombinant suicide vector and screening of mutant strain
A1. up stream；A2. down stream
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图 3 pSW7848 PCR线性化片段 (A)、srvg17985上下游同源臂片段 (B)、重组自杀质粒的PCR鉴定扩增片段 (C) 以及srvg17985缺失株的PCR鉴定 (D)
泳道M1. DNA Marker DL10 000；泳道1. pSW7848线性化片段；泳道M2. DNA Marker DL2 000；泳道2/3. srvg17985上/下游片段；泳道M3. DNA Marker DL10 000；泳道4. 重组子pSW7848-srvg17985检测片段；泳道M4. DNA Marker DL2 000；泳道5. 野生株ZJ-T；泳道6. srvg17985候选突变株
Figure 3. Linearized segment of pSW7848 (A), upstream and downstream homologous segments of srvg17985 (B), segment of identification of recombinant suicide vector by PCR (C) and identification of srvg17985 deletion mutant by PCR (D)
Lane M1. DNA Marker DL10 000; Lane 1. linearized segment of pSW7848; Lane M2. DNA Marker DL2 000; Lane 2/3. UP/DOWN segments of srvg17985; Lane M3. DNA Marker DL10 000; Lane 4. segment of identification of the recombinant suicide vector by PCR; Lane M4. DNA Marker DL2 000; Lane 5. wild type ZJ-T; Lane 6. deletion candidate of srvg17985
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图 4 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS培养基中的生长曲线
误差线对应于标准偏差
Figure 4. Growth curves of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 in LBS medium
Error bars correspond with standard deviations.
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图 5 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在0.3%和1.5%琼脂LBS平板上的运动性 (A) 和统计分析 (B)
Figure 5. Motility of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 on 0.3% and 1.5% LBS agar plates (A) and statistical analysis (B)
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图 6 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS+1%脱脂奶粉平板上胞外蛋白酶的分泌 (A) 和统计分析 (B)
图A内箭头指向菌斑边缘，外箭头指向蛋白酶分泌圈边缘
Figure 6. Extracellular protease activities of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 mutant on LBS agar plates containing 1% skimmed milk (A) and statistical analysis (B)
The inner arrow points to the edge of the plaque, and the outer arrow points to the edge of the proteolytic ring in Fig. A.
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图 7 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985在LBS以及LBS添加120 μmol·L–1 DIP平板上的生长情况
Figure 7. Growth ability of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985 on LBS plate and LBS plate supplemented with 120 μmol·L–1 DIP
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图 8 srvg17985缺失对昆布多糖、果胶、二羟基丙酮以及丙氨酸-天冬氨酸代谢的影响
误差线对应于标准偏差
Figure 8. Effect of srvg17985 deletion on metabolism of laminarin, pectin, dihydroxyacetoneor Ala-Asp
Error bars correspond with standard deviations.
表 1 本研究所用菌株和质粒
Table 1 Strains and plasmids used in this study
菌株、质粒
strain, plasmid相关特征
relevant characteristics来源
source菌株 strains V. alginolyticus ZJ-T 氨苄青霉素抗性，野生菌株ZJ-51的半透明/平滑变体；
从中国南部沿海的患病石斑鱼中分离参考文献[13] ZJ-T-Δsrvg17985 氨苄青霉素抗性；ZJ-T中缺失srvg17985 本研究 Escherichia coli Π3813 laclQ，thi1，supE44，endA1，recA1，hsdR17，gyrA462，zei298::Tn10[Tc]，ΔthyA::erm-pir116； 自杀质粒pSW7848的中间宿主 参考文献[14] E. coli GEB883 大肠杆菌野生株K12 ΔdapA::ermpir RP4-2 ΔrecAgyrA462，zei298::Tn10；接合作用供体菌 参考文献[15] 质粒 plasmids pSW7848 氯霉素抗性；自杀质粒，R6K起点，复制需要Pir蛋白，
具有ccdB毒性基因参考文献[16] pSW7848-Δsrvg17985 氯霉素抗性；pSW7848含有待缺失srvg17985的上下游同源臂 本研究 
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表 2 本研究所用引物
Table 2 Primers used in this study
引物
primer序列 (5'–3')
sequencepSW7848-F GTCTGATTCGTTACCAATTATGACAAC pSW7848-R GAATTCGATATCAAGCTTATCGATAC srvg17985-UP-F aagcttgatatcgaattcCGCCAAACACGCCAAACA srvg17985-UP-R acctcgttATTTAAAGCATGGTTCATTTTTCTCAAAAAAC srvg17985-DOWN-F tgctttaaatAACGAGGTAGAGGCGCAC srvg17985-DOWN-R ttggtaacgaatcagacGCAAATCAAATTGCAATGCGC Del-check-pSW7848-F TCACTGTCCCTTATTCGCACC Del-check-pSW7848-R CTGCTTTTGAGCACTACCCG Δsrvg17985-check-F CAATTCTCTCGCGTTTGGTC Δsrvg17985-check-R CATTGCTGACAACGTGTCTTG
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表 3 PM02板测试组分
Table 3 Test components of PM02 plate
孔
well (PM02)A B C D E F G H 1 空白 N-乙酰基-D-半乳糖胺 龙胆 D-棉子糖 癸酸 D-乳酸甲酯 乙酰胺 L-鸟氨酸 2 硫酸软骨素C N-乙酰-神经氨酸 L-葡萄糖 水杨甙 己酸 丙二酸 L-丙氨酰胺 L-苯丙氨酸 3 α-环糊精 β-D-阿洛糖 D-乳糖醇 景天庚酮糖酐 柠康酸 6-O-(α-D-吡喃半乳糖基)-
D-葡糖-己酸N-乙酰-L-谷氨酸 L-焦谷氨酸 4 β-环糊精 苦杏仁甙 D-松三糖 L-山梨糖 D, L-柠康酸 草酸 L-精氨酸 L-缬氨酸 5 γ-环糊精 D-阿拉伯糖 麦芽糖醇 水苏糖 D-氨基葡萄糖 草酰苹果酸 甘氨酸 D, L-肉碱 6 糊精 D-阿拉伯糖醇 a-甲基-D-葡萄糖苷 D-塔格糖 2-羟基苯甲酸 奎尼酸 L-组氨酸 仲丁胺 7 明胶 L-阿拉伯糖醇 β-甲基-D-半乳糖苷 松二糖 4-羟基苯甲酸 D-核糖酸-1, 4-内酯 L-高丝氨酸 D, L-章鱼胺 8 糖原 熊果苷 3-甲基葡萄糖 木糖醇 β-羟基丁酸 癸二酸 羟基-L-脯氨酸 腐胺 9 菊粉 2-脱氧-D-核糖 β-甲基-D-葡萄糖醛酸 N-乙酰基-D-葡糖胺醇 γ-羟基丁酸 山梨酸 L-异亮氨酸 二羟基丙酮 10 昆布多糖 i-赤藓糖醇 α-甲基-D-甘露糖苷 γ-氨基-N-丁酸 α-酮基-戊酸 琥珀酸 L-亮氨酸 2, 3-丁二醇 11 甘露聚糖 D-岩藻糖 β-甲基-D-木糖苷 δ-氨基戊酸 衣康酸 D-酒石酸 L-赖氨酸 2, 3-丁酮 12 果胶 3-0-β-D-吡喃半乳糖基-
D-阿拉伯糖帕拉金糖 丁酸 5-酮基-D-葡萄糖酸 L-酒石酸 L-蛋氨酸 3-羟基2-丁酮
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表 4 PM08板测试组分
Table 4 The test components of PM08 plate
孔
well (PM08)A B C D E F G H 1 空白 甘氨酸-天冬氨酸 赖氨酸-甘氨酸 脯氨酸-谷氨酸 苏氨酸-苯丙氨酸 缬氨酸-丝氨酸 γ-谷氨酸-甘氨酸 甘氨酸-甘氨酸-丙氨酸 2 L-谷氨酰胺 甘氨酸-异亮氨酸 赖氨酸-甲硫氨酸 脯氨酸-异亮氨酸 苏氨酸-丝氨酸 β-丙氨酸-丙氨酸 γ-D-谷氨酸-甘氨酸 甘氨酸-甘氨酸-D-亮氨酸 3 丙氨酸-天冬氨酸 组氨酸-丙氨酸 甲硫氨酸-酸苏氨酸 脯氨酸-赖氨酸 色氨酸-缬氨酸 β-丙氨酸-甘氨酸 甘氨酸-D-丙氨酸 甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸 4 丙氨酸-谷氨酰胺 组氨酸-谷氨酸 甲硫氨酸-酪氨酸 脯氨酸-丝氨酸 酪氨酸-异亮氨酸 β-丙氨酸-组氨酸 甘氨酸-D-天冬氨酸 甘氨酸-甘氨酸-异亮氨酸 5 丙氨酸-异亮氨酸 组氨酸-组氨酸 苯丙氨酸-天冬氨酸 脯氨酸-色氨酸 酪氨酸-缬氨酸 甲硫氨酸-β-丙氨酸 甘氨酸-D-丝氨酸 甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸 6 丙氨酸-甲硫氨酸 异亮氨酸-天冬酰胺 苯丙氨酸-谷氨酸 脯氨酸-缬氨酸 缬氨酸-丙氨酸 β-丙氨酸-苯丙氨酸 甘氨酸-D-苏氨酸 甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸 7 丙氨酸-缬氨酸 异亮氨酸-亮氨酸 谷氨酰胺-谷氨酸 丝氨酸-天冬酰胺 缬氨酸-谷氨酰胺 D-丙氨酸-D-丙氨酸 甘氨酸-D-缬氨酸 缬氨酸-酪氨酸-缬氨酸 8 天冬氨酸-丙氨酸 亮氨酸-天冬酰胺 苯丙氨酸-甲硫氨酸 丝氨酸-天冬氨酸 缬氨酸-谷氨酸 D-丙氨酸-甘氨酸 亮氨酸-β-丙氨酸 甘氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸 9 天冬氨酸-谷氨酰胺 亮氨酸-组氨酸 苯丙氨酸-酪氨酸 丝氨酸-谷氨酰胺 缬氨酸-赖氨酸 D-丙氨酸-亮氨酸 亮氨酸-D-亮氨酸 亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸 10 天冬氨酸-甘氨酸 亮氨酸-脯氨酸 苯丙氨酸-缬氨酸 丝氨酸-谷氨酸 缬氨酸-甲硫氨酸 D-亮氨酸-D-亮氨酸 苯丙氨酸-β-丙氨酸 亮氨酸-亮氨酸-亮氨酸 11 谷氨酸-丙氨酸 亮氨酸-酪氨酸 脯氨酸-精氨酸 苏氨酸-天冬氨酸 缬氨酸-苯丙氨酸 D-亮氨酸-甘氨酸 丙氨酸-丙氨酸-丙氨酸 苯丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸 12 甘氨酸-天冬酰胺 赖氨酸-天冬氨酸 脯氨酸-天冬酰胺 苏氨酸-谷氨酰胺 缬氨酸-脯氨酸 D-亮氨酸-酪氨酸 D-丙氨酸-甘氨酸-甘氨酸 酪氨酸-甘氨酸-甘氨酸
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表 5 溶藻弧菌ZJ-T和ZJ-T-Δsrvg17985对各抗生素抗性
Table 5 Antibiotics resistance of ZJ-T and ZJ-T-Δsrvg17985
抗生素
antibiotic浓度/μg·片−1
concentration抑菌圈直径/mm size of inhibition zone ZJ-T ZJ-T-Δsrvg17985 林可霉素 lincomycin 2 0.00/R 0.00/R 万古霉素 vancomycin 30 0.00/R 0.00/R 克林霉素 clindamycin 2 0.00/R 0.00/R 氯霉素 chloramphenicol 300 21.00±1.41/S 20.00±0.00/S 氨苄青霉素 ampicillin 10 0.00/R 0.00/R 苯唑西林 oxacillin 1 0.00/R 0.00/R 哌拉西林 piperacillin 100 0.00/R 0.00/R 卡那霉素 kanamycin 30 0.00/R 0.00/R 青霉素-G penicillin-G 10 0.00/R 0.00/R 头孢唑啉 cefazolin 30 11.00±1.41/R 11.00±1.41/R 妥布霉素 tobramycin 10 12.50±0.71/I 12.67±2.31/I 新霉素 neomycin 30 13.67±2.52/I 15.00±2.65/I 新生霉素 novobiocin 30 21.00±5.66/S 20.50±4.95/S 四环素 tetracycline 30 15.67±6.03/I 16.33±3.06/I 红霉素 erythromycin 15 12.00±2.65/R 14.00±1.41/I 麦迪霉素 medemycin 30 11.50±0.71/R 12.50±3.54/R 多粘菌素B polymyxin B 300 12.33±2.31/S 14.00±2.83/S 多西环素 doxycycline 30 19.50±3.54/S 20.00±2.83/S 乙酰螺旋霉素 acetylspiramycin 30 0.00/R 0.00/R 大观霉素 spectinomycin 100 10.33±1.53/R 11.00±1.41/R 米诺霉素 minocycline 30 24.00±5.66/S 25.50±4.95/S 头孢克肟 cefixime 5 10.67±1.53/R 12.00±4.24/R 阿莫西林 amoxicillin 10 0.00/R 0.00/R 阿奇霉素 azithromycin 15 0.00/R 0.00/R 克拉霉素 clarithromycin 15 12.33±0.58/R 11.00±1.73/R 罗红霉素 roxithromycin 15 11.00±1.41/R 10.67±0.58/R 替考拉宁 teicoplanin 30 0.00/R 0.00/R 磷霉素 fosfomycin 200 17.33±2.31/S 18.00±1.41/S 链霉素 streptomycin 300 11.33±1.53/S 11.00±1.41/S 庆大霉素 gentamicin 120 18.00±4.36/S 17.00±1.73/S 注：S. 敏感；I. 中介；R. 耐药 Note: S. susceptible; I. intermediate; R. resistance to drug
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