Optimization of enzymatic hydrolysis of protein in abandoned Porphyra haitanensis by response surface methodology and study on antioxidant activity of its hydrolysate
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摘要:
为实现末水坛紫菜(Porphyra haitanensis)的高值化利用，研究了末水坛紫菜的蛋白酶解工艺及其酶解液的抗氧化活性。以酶解产物水解度和还原力为指标，分别采用单因素和响应面优化实验筛选出最适蛋白酶和最佳酶解工艺参数；通过测定酶解液还原力对1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(
\begin{document}${\rm{O}}_2^- $\end{document} ·)的清除作用，研究了最高水解度下的酶解液的抗氧化性活性。结果表明，中性蛋白酶是6种蛋白酶中的最适用酶；最佳酶解条件为：底物质量浓度35 g·L−1、加酶量31 200 U·g−1、温度45 ℃、pH 7.6、酶解时间5 h，在此条件下坛紫菜水解度达31.37%；酶解液还原力为2.2，对DPPH、·OH和
${\rm{O}}_2^-$ ·自由基清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%。结果表明，中性蛋白酶可以有效水解末水坛紫菜，水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能力和应用前景。
Abstract:In order to achieve high-value utilization of abandoned Porphyra haitanensis, we studied the enzymatic hydrolysis technique and antioxidant activity of P. haitanensis protein. Single factor test and response surface optimization test were used to screen the optimum protease and enzymolysis parameters based on the indices of hydrolysis degree and reducing power. The antioxidant activity of the hydrolysate was studied by determining the reducing power of hydrolysate and scavenging ability of hydrolysate on the free radicals DPPH, ·OH and
${\rm{O}}_2^- $ ·. The results show that neutral protease was the optimal enzyme among the six enzymes. The optimal conditions for the hydrolysis of P. haitanensis proteins were as follows: substrate concentration 35 g·L–1, enzyme dosage 31 200 U·g–1, hydrolysis temperature 45 ℃, pH 7.6, hydrolysis time 5 h. Under these conditions, the hydrolysis degree was 31.37% and the reductive power was 2.2. The scavenging rates for DPPH, ·OH and
${\rm{O}}_2^- $ ·were 56.26%, 85.84% and 72.74%, respectively, which indicates that P. haitanensis can be hydrolyzed by neutral protease effectively, and its hydrolysate has good antioxidant activity and application prospects.
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近江牡蛎(Crassostrea rivulari)和波纹巴非蛤(Paphia undulate)是2种主要的养殖经济贝类，因其具有营养丰富、味道鲜美和食用方便等特点，深受消费者欢迎。它们能为人体提供丰富的蛋白质和氨基酸，尤其牡蛎还享有“海中牛奶”的美称[1]，作为高灰分、低脂肪的食物[2]，对不同年龄段的人、特别是老年人具有营养与保健功能[3]。同时近江牡蛎和波纹巴非蛤还富含人体必需的微量元素铁(Fe)、铜(Cu)等，常作为治疗缺乏微量元素(如Fe)辅助治疗的食疗材料[4]。
贝类作为食物进入人体消化道后，只有部分营养物质会被消化吸收，同时贝类不同的食用方式也会对其消化吸收[5]有影响，为更好地评估摄入量，体外仿生模型被引入到贝类中微量金属的分析研究中，通过模拟人体胃肠消化过程，考察贝类中微量金属在人体消化过程中的生物可接受性[6-9]。目前采用体外仿生模型研究食品、药品的生物可接受性已被广泛应用和认可[10-12]。近江牡蛎和波纹巴非蛤微量金属元素分析主要集中在总量[13-17]，关于生物可接受性研究、特别是食用方式影响的研究甚少。该研究采用体外全仿生消化方法对近江牡蛎和波纹巴非蛤进行处理，模拟2种贝类在人体消化道环境中的消化过程，对胃、肠消化过程中转运至仿生消化液中的微量金属进行测定，考察生、熟2种状态下贝类微量金属在提取液中提取量、生物可接受性的变化规律及特征，并进行微量元素摄入评估，以期为近江牡蛎和波纹巴非蛤的食用药用价值提供基础数据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
1.1.1 样品制备
2013年在广东省石栏洲海域、博贺湾、独湾海域、桂山岛海域4个主要贝类养殖区采集近江牡蛎106个，在柘林湾青屿、浮屿海域采集波纹巴非蛤贝类样品40个，采集的样品在现场用海水将外壳洗净后，冰冻保存带回实验室。在实验室取出贝类样品的软组织和体液，冻干至恒质量，用玛瑙研钵研磨后装于食品塑料袋内待用。
1.1.2 试验试剂
牛血清白蛋白(分析纯，广州威佳科技有限公司出品)，黏液素(分析纯，广州鼎国公司出品)，氯化钾、硫氰化钾、磷酸二氢钠、磷酸钠、氯化钠、氢氧化钠、尿素、a-淀粉酶、尿酸、氯化钙、氯化铵、氯化镁、碳酸氢钠、磷酸二氢钾、葡萄糖、葡萄糖醛酸、氨基葡萄糖盐酸盐、胃蛋白酶、胰液素、脂肪酶、胆汁(分析纯，上海晶纯生化科技股份有限公司出品)。
1.2 仪器与设备
试验过程使用的仪器设备主要有Milestone微波消解萃取系统(Ethos1)、智诚气浴恒温振荡器(ZHWY-2000)、Crist真空冷冻干燥机(ALPHA 1-4/Ldplue)、HITCH原子吸收分光光度计Z-2000。
1.3 方法
1.3.1 全仿生消化液的制备方法
试验所用唾液、胃液、肠液、胆汁等消化液的组成见表 1。参照LAIRD和CHAN[18]的方法，分别加入相应的无机物、有机物、消化酶，调节pH与4 ℃下保存备用。
表 1 唾液、胃液、十二指肠液、胆汁组成成分Table 1. Main components of saliva, gastric juice, duodenal juice and bile无机物inorganic matter 有机物organic matter 消化酶digestive enzyme pH 唾液sailiva 10 mL 189.6 g·L-1 KCl
10 mL 20 g·L-1 KSCN 10 mL 88.80 g·L-1 NaH2PO4
10 mL 57 g·L-1 Na3PO4
1.7 mL 175.3 g·L-1 NaCl
1.8 mL 40 g·L-1 NaOH8 mL 25 g·L-1尿素 145 mg α-淀粉酶
15 mg尿酸
50 mg粘液素6.5±0.2 胃液gastric juice 15.7mL 175.3 g·L-1 NaCl
3.0 mL 88.8 g·L-1 NaH2PO4
9.2 mL 89.6 g·L-1 KCl
18 mL 22.2 g·L-1 CaCl2
8.3 mL 37% HCl10 mL 65 g·L-1葡萄糖
10 mL 2 g·L-1葡萄糖醛酸
3.4 mL 25 g·L-1尿素
10 mL 33 g·L-1 氨基葡萄糖盐酸盐1 g牛血清蛋白
1 g胃蛋白酶
3 g脂肪酶1.07±0.07 十二指肠液
duodenal juice40 mL 175.3 g·L-1 NaCl
40 mL 84.7 g·L-1 NaHCO3
10 mL 8 g·L-1 KH2PO4
6.3 mL 89.6 g·L-1 KCl
10 mL 5 g·L-1 MgCl2
9 mL 22.2 g·L-1 CaCl2
0.18 mL 37% HCl4 mL 25 g·L-1尿素 1 g牛血清蛋白
3 g胰液素
0.5 g脂肪酶7.8±0.2 胆汁bile 30 mL 175.3 g·L-1 NaCl
68.3 mL 4.7 g·L-1 NaHCO3
4.2 mL 89.6 g·L-1 KCl
0.2 mL 37% HCl
10 mL 2.2 g·L-1 CaCl21 g牛血清蛋白
6 g胆汁8.0±0.2 注：用盐酸或碳酸氢钠溶液调pH，用超纯水定容至500 mL，在4 ℃下保存
Note: The pH values of all solutions were adjusted using HCl or NaHCO3 and the total volume of each digestion solution was diluted to 500 mL with ultrapure water before storage at 4 ℃.1.3.2 贝类全仿生消化方法
样品仿生消化具体步骤[18]为：称取贝类样品(生食样品)1.00 g，加入10 mL仿生唾液，在37 ℃恒温振荡5 min后加入150 mL仿生胃液，再于37 ℃恒温振荡2 h后取100 mL胃仿生消化食糜离心，得胃提取液待测；余下部分加入200 mL仿生十二指肠和80 mL仿生胆汁，恒温振荡8 h后取100 mL肠道仿生食糜离心，得肠提取液待测。熟食样品为制备好的贝类样品(生食样品)加入15 mL高纯水加热，沸腾10 min所得，仿生消化步骤同上。
1.3.3 贝类样品和提取液中重金属测定方法
取0.5 g贝类样品或30 mL仿生提取液(1.3.1制得)，加入8 mL浓硝酸、1 mL双氧水微波消解后转移至烧杯加热，最终定容到10 mL的容量瓶，用原子吸收分光光度计分别测定贝类样品和仿生提取液中的Fe、Cu。样品平行双份，测定结果以平均值表示。
1.3.4 数据处理
$$ \;\;\;\;\;\;生物可接受性 (\%)=\\\frac{\text { 贝类消化液中金属质量分数 }\left(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{kg}^{-1}\right)}{\text { 贝类样品中金属质量分数 }\left(\mathrm{mg} \cdot \mathrm{kg}^{-1}\right)} \times 100 $$ 居民日微量元素摄入量(mg · d-1)=每日膳食贝类摄入量(g)×贝类金属元素质量分数(mg · g－1)×生物可接受性；式中每日膳食贝类摄入量：男为19.4 g、女为17.7 g[19]。
2. 结果
2.1 贝类样品Fe、Cu总量
分析结果表明近江牡蛎和波纹巴非蛤均富含Fe元素，贝类样品近江牡蛎w(Fe)变化范围为0.97~1.83 mg · g-1，波纹巴非蛤w(Fe)的变化范围为0.96~1.24 mg · g-1，近江牡蛎w(Fe)平均值略大于波纹巴非蛤；与w(Fe)相比w(Cu)较低，2种贝类w(Cu)相差较大，近江牡蛎w(Cu)平均值为0.31 mg · g-1，而波纹巴非蛤w(Cu)平均值不及近江牡蛎的十分之一。
2.2 消化阶段提取液中Fe、Cu的变化
胃、肠仿生消化过程中(图 1-a，图 1-b)，熟近江牡蛎仿生消化液中Fe的提取量比生的大。在胃仿生消化阶段，熟牡蛎提取液中Fe的提取量为547 mg · kg-1，而生牡蛎的只有503.5 mg ·kg-1。在肠仿生消化阶段，熟牡蛎提取液中Fe的提取量也比生牡蛎略高，是生牡蛎的1.05倍。熟牡蛎中Cu在胃肠消化阶段变化不一致，在胃消化阶段Cu的提取量比生牡蛎高，但是在肠消化阶段则比生牡蛎低，纵观整个仿生消化过程，熟牡蛎被仿生消化液提取出来的Cu比生牡蛎的高。
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图 1 食用方式对近江牡蛎和波纹巴非蛤消化过程铁、铜提取量的影响Figure 1. Influence of edible way of digestion process on solubility of Fe, Cu in C.rivulari and P.undulate熟的波纹巴非蛤仿生消化过程中，Fe、Cu元素变化规律相同。胃仿生消化阶段(图 1-a，图 1-c)，熟的波纹巴非蛤提取液中Fe、Cu提取量均比生波纹巴非蛤高；而在肠仿生消化阶段，熟波纹巴非蛤Fe、Cu提取量均比生波纹巴非蛤低，分别是生波纹巴非蛤提取量的88%和97%(图 1-b，图 1-d)，Fe提取量降低幅度大于Cu。
胃是人类消化系统中主要消化场所，此试验也印证了这一点。不管是煮熟还是生食，近江牡蛎和波纹巴非蛤中的Fe、Cu在胃仿生消化中释放的量比肠消化阶段多，胃和肠提取液中Cu差别比较大。有研究表明生牡蛎中经胃消化阶段被提取的Cu可高达80%[20]。
2.3 生物可接受性
经过仿生消化后，熟近江牡蛎中的Fe、Cu生物可接受性比生近江牡蛎高，加热后近江牡蛎的Fe生物可接受性平均值增加7.3%，Cu生物可接受性平均值增加4.6%(表 2)，消化液Fe、Cu提取量均比总量低，近江牡蛎组织中有超过13.8%~74.6%的Fe和3.3%~22.3%的Cu留在食物残渣中未进入人体消化循环。AMIARD等[21]研究发现生牡蛎经过胃肠仿生消化后，3%~39%的Cu留在食物残渣中。食用方式对波纹巴非蛤中2种元素的生物可接受性影响不一致，熟波纹巴非蛤中Fe的生物可接受性平均比生的高11.5%，Cu则低了11.5%，可见熟食方式提高了波纹巴非蛤Fe生物可接受性同时降低了Cu的生物可接受性。
表 2 近江牡蛎和波纹巴非蛤中铁、铜的生物可接受性Table 2. Bioaccessibility of Fe and Cu in C.rivulari and P.undulate% 元素
element近江牡蛎C.rivulari 波纹巴非蛤P.undulate 生牡蛎raw 熟牡蛎cooked 生蛤raw 熟蛤cooked 铁Fe 52.0±32.7 55.8±30.4 40.7±13.2 45.4±11.2 铜Cu 83.4±11.6 87.2±9.5 87.8±10.3 77.7±12.7 无论是那种食用方式，近江牡蛎和波纹巴非蛤Cu的生物可接受性都比Fe高，但是2种贝类的Fe总量均比Cu高，可见2种贝类中Fe、Cu生物可接受性与其总量高低并没有明显关系。JORGE等[22]对5种贝类的Fe、Cu生物可接受性进行测定，结果显示Cu生物可接受性均比Fe高。
2.4 评价
食用方式变化会改变人体消化系统对贝类Fe、Cu的利用率，文章采用近江牡蛎和波纹巴非蛤Fe、Cu仿生消化结果进行评价，考察2种贝类对人体Fe、Cu摄入量的贡献(表 3)。参照唐洪磊等[19]估算贝类摄入量，食用近江牡蛎和波纹巴非蛤所摄入的Fe和Cu均未超过中国居民DRIs委员会[23]推荐的每日适宜摄入量，食用近江牡蛎每日可为人体提供1.97~2.32 mg的Fe，占适宜摄入量的9.9%~15.5%，同时提供人体所需Cu的22.6%~25.9%，熟近江牡蛎提供Fe、Cu均比生牡蛎高。食用波纹巴非蛤摄入的Fe、Cu均比近江牡蛎少，每日可为人体提供1.27~1.56 mg的Fe和0.06~0.08 mg的Cu，最高可提供10.4% Fe(熟蛤)和3.9%(生蛤)摄入量。PAWELPOH等[24]研究多种蜂蜜对人体微量元素摄入贡献，发现日食用100 g蜂蜜最高可为人体提供11.1%~19.2%的Fe和6.0%~7.5%的Cu[适宜摄入量(AI，mg ·d-1)为Fe：11~14、Cu：2.0~2.5]，近江牡蛎和波纹巴非蛤为人体提供Fe、Cu元素摄入量不同，食用方式不同也略有影响，但总体而言所提供的Fe、Cu相对比较高。
表 3 居民日微量元素摄入量Table 3. Daily consumption of Fe and Cu in shellfishmg · d-1 元素
element适宜摄入量
AI可耐受摄入量
UI近江牡蛎C.rivulari 波纹巴非蛤P.undulate 生牡蛎raw 熟牡蛎cooked 生蛤raw 熟蛤cooked 男 女 男 女 男 女 男 女 男 女 男 女 铁Fe 15 20 50 50 2.16 1.97 2.32 2.12 1.39 1.27 1.56 1.47 铜Cu 2.0 2.0 8.0 8.0 0.50 0.45 0.52 0.47 0.08 0.07 0.07 0.06 注：适宜摄入量和可耐受摄入量采用成年居民(≥18岁)推荐值
Note：Values of Al an Ul using adult (age≥18) recommended values of DRIs.3. 讨论
此试验模拟人体胃肠消化过程，加入全仿生消化液对样品进行处理，考察近江牡蛎和波纹巴非蛤中金属元素Fe、Cu转移进入消化液的情况。结果表明，近江牡蛎和波纹巴非蛤样品中Fe、Cu进入到消化液中的量均小于其总量，其中Fe仅约50%转运到消化液中。FANNY等[25]研究智利贻贝(Mytilus chilensis)表明，无论是生贝还是熟贝，仿生消化液中镉(Cd)的提取量都比样品本身Cd总量低，同为金属元素的Fe、Cu也有相同表现。食物在消化道中的消化方式影响其金属元素被人体吸收利用的程度，消化是金属元素伴随营养物质进入人体、被吸收利用的重要途径，选用适宜、科学的消化方法是合理评估的基础。
煮熟的近江牡蛎中Fe、Cu的生物可接受性均有提高，而煮熟的波纹巴非蛤中Fe的生物可接受性提高的同时，Cu的生物可接受性却降低。METIAN等[26]研究紫贻贝(M.galloprovincialis)仿生消化也发现，煮熟后紫贻贝锰(Mn)、镅(Am)的生物可接受性提高，但Cd、钴(Co)、锌(Zn)等的生物可接受性却降低。贝类的不同食用方式可能引起其食糜在人体消化环境中消化过程的改变，不同元素受到的影响不一致，Fe、Cu生物可利用性发生不同程度改变，这种改变可能影响到近江牡蛎和波纹巴非蛤中Fe、Cu在人体中的吸收和利用，改变可能进入人体循环系统Fe、Cu的量。总体看2种试验贝类熟食比生食能为人体提供更多的Fe摄入量。
贝类品种的差异影响金属配合物的配体组成，近江牡蛎和波纹巴非蛤经过仿生消化后，形成了不同的仿生食糜成分，且仿生食糜基体成分复杂，食糜提取液中金属元素结合态、形态、结构态等存在差异，相同金属元素的不同形态分布可能影响其生物可接受性，而不同金属元素也可能由配位能力的因素，导致生物可接受性的不同。
近江牡蛎和波纹巴非蛤中Fe、Cu生物可接受性大小与其总量高低并没有明显的关系，且消化液提取量均比总量低。以往评估贝类样品为人体提供的微量元素摄入时，多数采用总量进行评估，结果可能导致摄入量被高估或是低估，考虑到实际食物进入人体消化系统并不是完全被消化吸收，此试验选择更加符合人体消化方式的全仿生消化方法处理样品，在进行评估的时候加入生物可接受性参数，结果可能更为科学有效。
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图 1 不同酶酶解时间对水解度 (a) 和还原力 (b) 的影响
Figure 1. Effect of enzymolysis time of different enzymes on degree of hydrolysis (a) and reducing power (b)
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图 2 pH (a)、酶解温度 (b)、底物质量浓度 (c)、酶解时间 (d) 和加酶量 (e) 对水解度和还原力的影响
Figure 2. Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), substrate mass concentration (c), hydrolysis time (d) and enzyme dosage (e) on degree of hydrolysis and reducing power
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图 3 Y=(A，B)的响应面与等高线
固定因素C=0
Figure 3. Response surface and contour plots under Y=(A, B)
fixed factor C=0
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图 4 Y=(B，C)的响应面与等高线
固定因素A=0
Figure 4. Response surface and contour plots under Y=(B, C)
fixed factor A=0
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图 5 Y=(A，C)的响应面与等高线
固定因素B=0
Figure 5. Response surface and contour plots under Y=(A, C)
fixed factor B=0
表 1 不同蛋白酶的酶解条件
Table 1 Hydrolysis condition of different proteases
蛋白酶种类
kinds of protease酶活性/U·mg−1
enzyme activitypH 温度/℃
temperature中性蛋白酶 neutral protease 100 7 50 胰蛋白酶 trypsin 250 8 50 复合蛋白酶 compound protease 120 7 50 木瓜蛋白酶 papain 6 000 7 50 风味蛋白酶 flavored proteinase 40 7 50 菠萝蛋白酶 bromelain 100 7 50 
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表 2 响应面实验因素水平表
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平 level 因素 factor 温度 (A) /℃
temperaturepH (B) 加酶量 (C) /U·g−1
enzyme dosage−1 40 6 24 960 0 45 7 28 800 1 50 8 32 640
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表 3 响应面实验设计及结果
Table 3 Experimental results of Box-Behnken design
序号 No. 温度 (A)
temperaturepH (B) 加酶量 (C)
enzyme dosageY/% 1 1 −1 0 23.43 2 −1 0 −1 22.03 3 0 −1 −1 22.57 4 0 0 0 29.94 5 0 0 0 30.33 6 0 −1 1 25.51 7 1 1 0 28.45 8 0 1 −1 24.50 9 0 1 1 29.99 10 1 0 1 27.97 11 0 0 0 29.53 12 1 0 −1 23.80 13 −1 0 1 27.31 14 0 0 0 28.57 15 0 0 0 29.41 16 −1 −1 0 23.70 17 −1 1 0 26.58
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表 4 回归与方差分析结果
Table 4 Analysis of variance for fitted regression model
方差来源
source of variation平方和
SS自由度
df均方
MSF P
prob>F显著性
significance模型 model 129.33 9 14.37 44.69 <0.000 1 *** A 2.04 1 2.04 6.35 0.039 8 * B 25.60 1 25.60 79.63 <0.000 1 *** C 39.91 1 39.91 124.14 <0.000 1 *** AB 1.14 1 1.14 3.55 0.101 4 AC 0.31 1 0.31 0.96 0.360 7 BC 1.63 1 1.63 5.07 0.059 0 A2 20.18 1 20.18 62.76 <0.000 1 *** B2 14.04 1 14.04 43.66 0.000 3 *** C2 18.34 1 18.34 57.05 0.000 1 *** 残差 residual 2.25 7 0.32 失拟项 lack of fit 0.50 3 0.17 0.38 0.772 3 纯误差 pure error 1.75 4 0.44 总和 sum 131.58 16 R2 0.982 9 注：***. P<0.001；*. P<0.05
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表 5 坛紫菜酶解前后抗氧化能力的比较
Table 5 Comparison of antioxidant activity of P. haitanensis before and after hydrolysis
抗氧化指标
antioxidant index酶解前
before hydrolysis酶解后
after hydrolysis还原力 reducing power 0.7±0.01 2.2±0.006 DPPH·清除率/%
scavenging activity11.64±0.02 56.26±0.01 ·OH清除率/%
scavenging activity63.47±0.05 85.84±0.02 ${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率/%
scavenging activity58.36±0.07 72.73±0.03
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1. 旷泽行，汪慧娟，谷阳光，齐占会，黄洪辉. 海南岛昌化江河口海域生物体重金属富集特征与概率健康风险评价. 海洋环境科学. 2021(05): 699-706 . 
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