Optimization of enzymatic hydrolysis of protein in abandoned Porphyra haitanensis by response surface methodology and study on antioxidant activity of its hydrolysate
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摘要:
为实现末水坛紫菜(Porphyra haitanensis)的高值化利用，研究了末水坛紫菜的蛋白酶解工艺及其酶解液的抗氧化活性。以酶解产物水解度和还原力为指标，分别采用单因素和响应面优化实验筛选出最适蛋白酶和最佳酶解工艺参数；通过测定酶解液还原力对1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(
\begin{document}${\rm{O}}_2^- $\end{document} ·)的清除作用，研究了最高水解度下的酶解液的抗氧化性活性。结果表明，中性蛋白酶是6种蛋白酶中的最适用酶；最佳酶解条件为：底物质量浓度35 g·L−1、加酶量31 200 U·g−1、温度45 ℃、pH 7.6、酶解时间5 h，在此条件下坛紫菜水解度达31.37%；酶解液还原力为2.2，对DPPH、·OH和
${\rm{O}}_2^-$ ·自由基清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%。结果表明，中性蛋白酶可以有效水解末水坛紫菜，水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能力和应用前景。
Abstract:In order to achieve high-value utilization of abandoned Porphyra haitanensis, we studied the enzymatic hydrolysis technique and antioxidant activity of P. haitanensis protein. Single factor test and response surface optimization test were used to screen the optimum protease and enzymolysis parameters based on the indices of hydrolysis degree and reducing power. The antioxidant activity of the hydrolysate was studied by determining the reducing power of hydrolysate and scavenging ability of hydrolysate on the free radicals DPPH, ·OH and
${\rm{O}}_2^- $ ·. The results show that neutral protease was the optimal enzyme among the six enzymes. The optimal conditions for the hydrolysis of P. haitanensis proteins were as follows: substrate concentration 35 g·L–1, enzyme dosage 31 200 U·g–1, hydrolysis temperature 45 ℃, pH 7.6, hydrolysis time 5 h. Under these conditions, the hydrolysis degree was 31.37% and the reductive power was 2.2. The scavenging rates for DPPH, ·OH and
${\rm{O}}_2^- $ ·were 56.26%, 85.84% and 72.74%, respectively, which indicates that P. haitanensis can be hydrolyzed by neutral protease effectively, and its hydrolysate has good antioxidant activity and application prospects.
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物种共现(species co-occurrence)是对许多生态过程获得更好理解的基本模式，生态学家常通过分析两个或多个物种在一组空间位置中共同出现的频率，评估物种共现的正、负相关性和随机性。对物种共现模式的研究是许多生态研究的基本任务[1]。
传统生态位构建理论认为，物种在群落中的共现是以生态位分化为前提的，生态位相同的物种可能因竞争共同的资源而发生竞争排除，不能稳定共现[2]，同科属的种类往往表现出较接近的生态位，受空间和食物资源的影响，在时间上出现明显的错位分布[3]。而中性理论认为，物种共现与生态位分化无关，物种在扩散限制的边界内随机聚合形成群落[4-5]。虽然生态位理论和中性理论在物种共现方面存在争议，但近年来更多的生态学家倾向于生态位理论和中性理论并非对立，将生态位理论和中性理论整合可以更好地理解群落构建的机理[6-7]。近年来的研究主要集中于环境筛选和生物相互作用在群落构建中的相对重要性。群落物种特征是群落构建的直接作用对象，所以生态学家通过构建群落零模型(null model)、数据随机化(data randomization)等方法来分析实际群落中物种的分布特征与随机过程导致的特征相似和离散性的异同[8-10]。但是这种用于产生随机化矩阵的方法受随机过程本身的影响往往会产生“一类”或“二类”错误，而概率模型不依赖于数据随机化过程，“一类”或“二类”错误的发生率相对较低[11-12]。
网络分析方法(networks theory)可以获得生物过程与生物群落构建之间的关系，利用网络的属性特点可以反映群落中物种之间的相互关系，并能够通过对物种联结节点赋予不同的权重反映物种之间相互作用的强度[13-14]。该理论已经广泛应用在不同层次的群落构建机制研究中，包括对基因和蛋白质相互作用、代谢路径、共现关系以及食物网的分析[13]。另外，共现网络(co-occurrence networks)也被应用在对不同生物群落的构建模式分析中，在网络中可以通过分析种间联结数量和权重识别群落结构中的核心物种[15-17]。
长江口是我国最大的河口，大量淡水和陆源物质注入为海洋鱼类和其他海洋生物提供了良好的生存环境。受河口冲淡水以及潮汐等多种环境因素的影响，长江口生态系统具有较大的时空变化，栖息环境的差异导致了鱼类群落组成的差异[18]。本研究以长江口鱼类群落为研究对象，使用概率模型和网络分析方法，1) 探讨鱼类群落的种间共现模式；2)分析在栖息环境具明显季节差异的河口水域，鱼类种间共现模式和群落聚集程度的变化；3) 识别群落中的核心物种。进而了解长江口鱼类群落构建和生物多样性维持的机制。
1. 材料与方法
1.1 采样方法
于2012—2014年每年的2月(冬季)、5月(春季)、8月(夏季)和11月(秋季)，对长江口中华鲟自然保护区及附近海域渔业资源进行了定点采样调查，共15个站点(图1)。
调查船为沪崇渔1511号，渔具为双囊底拖网，网口宽6 m，网高2 m，网纲长6 m，囊网网目20 mm。根据GPS定位，当调查船到达站位后，放下拖网，以约2 km·h−1的航速拖曳30 min，随即收网并整理2个囊袋中的渔获物。当渔获物数量较少时，记录全部渔获物的种类、数量、质量、体长等统计量数据，渔获物数量较多时随机抽取一定比例的渔获物进行统计，最后换算成全部渔获物的数量，种类鉴定参考《长江口鱼类》[19]。
1.2 分析方法
随机共现表示2个物种之间的相对分布模式是随机的或独立的，并不表示每个物种的分布都是随机的；正关联的2个物种的分布在空间位置上重叠的可能性更高，负关联的2个物种相反。因此一对物种可能存在的潜在共现关系有3种，即随机、正关联和负关联。这种关联模式的存在可以间接的证明存在某些不确定的生态过程或影响因子导致了特定的种间共现模式[1]。本研究根据每个物种在不同月份和不同站点的渔获数据建立物种出现(1)—不出现(0)的关联矩阵，利用成对概率分析(pair-wise probabilistic analyses)方法验证物种共现的假设[12]。分析在R语言co-occur程序包中进行[20]。该方法可以获得每个种对共现关系的显著性(α>0.05)，并能够识别显著聚集和显著分离的物种。
观察到的种对共现数据用于构建不同季节的种间共现网络，以观察到的鱼类共现关系为边(edges)，以物种作为顶点(nodes)。种间共现网络的构建在R语言igraph程序包中进行[21]。分析物种权度(weighted degree)和中间中心性(betweenness centrality)，以物种权度决定顶点大小。在共现网络中，将群落中与某一物种具有显著正关联的所有物种的种数作为该物种的权度；物种对群落内信息交换的控制能力作为物种的中间中心性，它是将通过节点的二进制最短路径除以2个节点之间的二进制路径的数量来计算的，中间中心性越大，物种对群落内信息交换的控制能力越强，对维持群落结构的稳定就越关键[22]。权重和中间中心性的估算都在R语言tnet程序包中进行[23]。利用局部聚类系数 (local clustering coefficients) 分析物种权重密度，聚类系数是当前与中心节点联结的节点之间的链接数量与可能的链接总数的比例。聚类系数较高的网络具有较强的内聚性[24]。同时使用igraph程序包中的intersection.by.name代码分析每个季节的共现关系都是正相关的种对[21]。
采用相对重要性指数(relative importance index，IRI)作为鱼类优势度的指标：
$${\rm{IRI}} = \left( {N + W} \right) \times F$$ 式中N为某种鱼类占捕获鱼类个体总数的百分比(%)，W为某种鱼类占捕获鱼类总质量的百分比(%)，F为某种鱼类在调查中的出现频率(%)。IRI值大于1 000时为优势种，50~1 000为常见种，其余为偶见种，优势种和常见种为长江口的主要经济鱼类[18]。
所有分析均在R 3.4.3中进行。
2. 结果
调查共发现鱼类38种，属11目18科(表1)。以鲈形目最多(16种)，其中虾虎鱼科最多(9种)，其次是鲱形目和鲽形目各有4种。优势种和常见种共11种。
表 1 长江口鱼类组成 (2012—2014年)Table 1. Fish species composition in Yangtze River estuary (2012−2014)目
Order科
Family种
Species频次
frequency相对重要性指数
IRI鲱形目 Clupeiformes 鳀科 赤鼻棱鳀 Thrissa kammalensis 3 0.62 黄鲫 Setipinna taty 2 0.07 刀鲚 Coilia nasus 56 128.20 凤鲚 Coilia mystus 34 73.15 鲑形目 Salmoniformes 银鱼科 大银鱼 Protosalanx hyalocranius 4 0.18 灯笼鱼目 Myctophiformes 狗母鱼科 龙头鱼 Harpodon nehereus 24 77.77 鳗鲡目 Anguilliformes 海鳗科 海鳗 Muraensox cinereus 3 0.41 鲤形目 Cypriniformes 鲤科 贝氏䱗 Hemiculter bleekeri 3 0.27 长蛇 Saurogobio dumerili 3 0.21 鲇形目 Siluriformes 鲿科 光泽黄颡鱼 Pelteobagrus nitidus 31 58.81 长吻 Leiocassis longirostris 4 0.48 鲻形目 Mugiliformes 鲻科 鲻 Mugil cephalus 2 0.13 鮻 Liza haematocheila 5 0.32 鲈形目 Perciformes 马鲅科 多鳞四指马鲅 Eleutheronema rhadinum 5 0.35 鮨科 中国花鲈 Lateolabrax maculatus 6 1.23 石首鱼科 黄姑鱼 Nibea albifora 16 30.26 白姑鱼 Argyrosomus argentatus 30 47.78 鮸 Miichthys miiuy 8 3.12 棘头梅童鱼 Collichthys lucidus 48 1 340.92 虾虎鱼科 髭缟虾虎鱼 Triaenopogon barbatus 11 7.10 纹缟虾虎鱼 Tridentiger trigonocephalus 1 0.04 波氏吻虾虎鱼 Ctenogobius cliffordpopei 1 0.01 狼牙鳗虾虎鱼 Taenioides anguillaris 54 185.98 拉氏狼牙虾虎鱼 Odontamblyopus lacepedii 5 1.81 睛尾蝌蚪虾虎鱼 Lophiogobius ocellicauda 53 262.44 矛尾虾虎鱼 Chaeturichthys stigmatias 31 198.59 斑尾刺虾虎鱼 Synechogobius ommaturus 11 6.72 孔虾虎鱼 Trypauchen vagina 38 120.72 鲳科 银鲳 Pampus argenteus 8 1.50 䲗科 香斜棘䲗 Repomucenus olidus 2 0.04 鲉形目 Scorpaeniformes 鲂鮄科 小眼绿鳍鱼 Chelidonichthys spinosus 1 0.88 鲬科 鲬 Platycephalus indicus 1 0.01 鲽形目 Pleuronectiformes 舌鳎科 日本须鳎 Paraplagusia japonica 1 0.03 短吻红舌鳎 Cynoglossus joyneri 23 109.89 窄体舌鳎 Cynoglossus gracilis 75 705.37 鳎科 带纹条鳎 Zebrias zebra 1 0.21 鲀形目 Tetraodontiformes 鲀科 暗纹东方鲀 Takifugu obscurus 1 0.02 黄鳍东方鲀 Takifugu xanthopterus 1 0.37 调查期间，38个物种703个种对中，有76个种对呈显著正关联，12个种对为显著负关联，大部分种对(615对，87.5%)为随机关联，且随机关联种对中587对(95.4%)与偶见种有关。与棘头梅童鱼(Collichthys lucidus)有显著正关联的鱼类有13种，与龙头鱼(Harpodon nehereus)、矛尾虾虎鱼(Chaeturichthys stigmatias)和孔虾虎鱼(Trypauchen vagina)正关联的鱼类各有9种；负关联种对中涉及鱼种最多的是光泽黄颡鱼(Pelteobagrus nitidus)，共有9对。主要经济鱼类(11种)中正关联种对19对(34.5%)，负关联种对8对(14.5%)。同科种对有52对，其中正关联种对11个，负关联种对2个，分别是矛尾虾虎鱼和斑尾刺虾虎鱼 (Synechogobius ommaturus)，短吻红舌鳎(Cynoglossus joyneri)和窄体舌鳎 (C. gracilis)，其余种对为随机关联(表2，图2)。
表 2 长江口鱼类共现模式呈正相关、负相关和随机性的种对数量Table 2. Number of pairs of fish species with positive, negative and random co-occurrence patterns in Yangtze River estuary月份
month物种数
number of species共现模式
pattern of co-occurrence正相关
positive负相关
negative随机
random2月 Feb. 18 3 3 147 5月 May 24 11 4 261 8月 Aug. 27 51 4 296 11月 Nov. 27 26 6 319 总体 total 38 76 12 615 ![]()
图 2 长江口鱼类种间共现模式Figure 2. Co-occurrence patterns of fish species in Yangtze River estuary鱼类共现模式存在季节差异。随机关联的种对占绝对优势。8月正关联种对最多，其次是11月，2月最少；负关联种对不论是各个季节还是总体，均占比很小 (表2，图3)。共现网络中物种权度和边线数量以8月最为复杂，2月最简单(图4)。
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图 3 长江口鱼类种间共现模式季节变化Figure 3. Seasonal variance of fish species co-occurrence patterns in Yangtze River estuary![]()
图 4 长江口鱼类种间共现网络季节变化Figure 4. Seasonal variation of fish species co-occurrence networks in Yangtze River estuary物种权度的季节变化较大。平均物种权度最高的是8月，其次是11月，最低的是2月(图4，图5)。2月物种权度最高的为髭缟虾虎鱼(Triaenopogon barbatus) (2)；5月除了棘头梅童鱼(4)和矛尾虾虎鱼(4)之外，其他种类都小于4；8月物种权度大于5的种类有8种，其中龙头鱼11，棘头梅童鱼10，短吻红舌鳎、鮸鱼(Miichthys miiuy)和髭缟虾虎鱼均为9，矛尾虾虎鱼8，多鳞四指马鲅(Eleutheronema rhadinum) 和孔虾虎鱼为7；11月物种权度除了棘头梅童鱼(5)和龙头鱼(3)之外，其余种类均≤3。
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图 5 长江口鱼类群落各季节权度和局部聚类系数 (均值±标准误)Figure 5. Bar plots of$\overline X$ ±SE of weight degrees and local clustering coefficients in different seasons in Yangtze River estuary与物种权度相似，物种的中间中心性也存在季节差异。2月最高的为髭缟虾虎鱼(1.00)；5月最高的为棘头梅童鱼(4.50)；8月最高的为龙头鱼(23.26)，其余种类超过5的有棘头梅童鱼(18.87)、髭缟虾虎鱼(18.66)、睛尾蝌蚪虾虎鱼(Lophiogobius ocellicauda，18.46)、短吻红舌鳎(17.01)、矛尾虾虎鱼(16.48)、鮸鱼(13.17)和孔虾虎鱼(7.73)；11月最高也为棘头梅童鱼(13.17)，其余超过5的有龙头鱼(6.33)、白姑鱼(Argyrosomus argentatus，6.00)和凤鲚(Coilia mystus，6.00)。
调查期间长江口发现的鱼类虽然有38种，但不存在每个季节都显著正关联的物种。在3个季节(5月、8月和11月)均正关联的有3个种对，分别为矛尾虾虎鱼与短吻红舌鳎、矛尾虾虎鱼与棘头梅童鱼以及棘头梅童鱼与白姑鱼。
3. 讨论
传统的河口鱼类群落结构研究多采用多元统计分析(包括聚类分析、多维标度排序、主成分分析、对应分析、冗余分析和典范对应分析等)描述变量间的相关关系，以及环境变量对各个物种的影响，这类研究一般不包括物种间的相互作用[25]。本研究利用成对概率模型和网络分析方法分析鱼类种间共现关系，对了解生物时空分布规律和评估种间作用关系具有重要意义。
3.1 长江口鱼类共现模式
部分研究认为鱼类共现主要是物种在生物和环境因素作用下的非随机关联[26-27]，环境因素的作用要大于生物间相互作用[28-29]。本研究证实长江口鱼类群落模式主要是物种的随机共现[16-17]。94.5%的随机共现种对涉及偶见种，表明这种随机共现模式受偶见种影响较大。主要经济鱼类中49%的种间非随机共现模式，说明长江口主要经济鱼类在某些不确定因素的影响下形成了较为稳定的种间共现模式。
一般在环境因子变化较大的环境中，相似性较高的物种表现出相似的生态位，往往是生境过滤共现机制占据主要地位[30]。也有研究认为同科或同属鱼类在时间上出现明显的错位分布，因为生态位接近，时间错位分布可以减少对空间和食物资源的竞争，因而竞争排斥对群落的影响超过环境过滤[3]。但长江口鱼类同科种对仍然以随机共现模式为主。长江口水温、盐度等环境因素的空间梯度较大，对鱼类的环境过滤作用较高，且资源(如小型浮游动物等饵料生物)分布密度较大[18]。以上分析一定程度上说明在调查期间种间对空间和食物资源的竞争对长江口鱼类共现模式的影响较小，环境因子季节变化驱动的随机因素可能是导致长江口鱼类随机共现模式的主要原因，种间共现的正关联性则能够说明物种间对环境需求的相似性[9]。
对环境因子需求的相异性、躲避捕食者或种间对空间或饵料竞争等因素都有可能导致种间共现负关联[11]。光泽黄颡鱼是长江口常见的淡水鱼类，物种出现矩阵显示，光泽黄颡鱼在调查期间的各月均有出现，但光泽黄颡鱼与和其呈负关联的种类(如棘头梅童鱼、龙头鱼和矛尾虾虎鱼等)相比有明显的栖息地选择性差异[18]。鉴于负关联种对间的这种差异以及不明显的捕食关系[31]，本研究认为环境过滤可能是导致种间负关联的主要因素。
3.2 共现模式的季节差异
种间共现模式的季节差异反映了鱼类群落构建季节变动的动力机制[1]。长江口鱼类空间共现模式的季节变化，反映了其鱼类群落组成明显的季节差异。季节性水文变化、自然资源变动可能导致种间共现模式的变化[11]。如夏秋季节长江栖息环境更适合鱼类索饵育肥，其物种丰度、生物多样性要高于其他季节[32-33]，相应的8月和11月的鱼类共现网络复杂程度和群落聚集程度都较高，2月和5月则相对较低。高权度和高中间中心性物种的季节更替进一步证明长江口鱼类群落较大的季节波动，这种更替一定程度上影响了种间共现的随机性[3]。溯河洄游鱼类和海洋洄游鱼类分别在不同时空尺度上的优势导致了长江口鱼类群落出现明显的时空差异[18]，本研究发现这种更替主要与海洋洄游和河口定居型鱼类有关(如2月的髭缟虾虎鱼，5月的棘头梅童鱼和矛尾虾虎鱼，8月的龙头鱼、棘头梅童鱼和髭缟虾虎鱼以及11月的棘头梅童鱼、龙头鱼和白姑鱼等)，说明海洋洄游鱼类和河口定居型鱼类在长江口鱼类共现网络中占主导地位，在生物多样性维持中发挥重要作用。
3.3 长江口鱼类核心物种
在维护群落结构稳定性中，核心物种起着决定作用。控制模拟实验法、物种相互作用相对重要性法、群落重要性指数法、网络分析法和Ecopath with Ecosim模型法是常见的核心种识别方法[15]。本研究以种间共现关系为基础构建鱼类种间关系网，确定了棘头梅童鱼、矛尾虾虎鱼为长江口鱼类核心物种，其中棘头梅童鱼具有较高的IRI和中间中心性，说明其对群落内信息交换的控制能力较强，对维持长江口鱼类群落结构的稳定起关键作用。
3.4 生物多样性保护策略
由于长江口鱼类群落受环境过滤影响较大，并且长江口又是棘头梅童鱼、刀鲚、凤鲚等重要经济鱼类的产卵场和育肥场，季节性洄游鱼类变化对长江口鱼类生物多样性有较大影响。因此为保护长江口鱼类生物多样性，除了采取合理措施保护长江口生态环境(如减少污染物排放，建立海洋牧场以修复河口底栖生态环境、保护底栖生物等)外，还应采取措施降低邻近海域的捕捞强度、实施经济种类的增殖放流、保持长江口与邻近海域的连通性及种群密度。
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图 1 不同酶酶解时间对水解度 (a) 和还原力 (b) 的影响
Figure 1. Effect of enzymolysis time of different enzymes on degree of hydrolysis (a) and reducing power (b)
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图 2 pH (a)、酶解温度 (b)、底物质量浓度 (c)、酶解时间 (d) 和加酶量 (e) 对水解度和还原力的影响
Figure 2. Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), substrate mass concentration (c), hydrolysis time (d) and enzyme dosage (e) on degree of hydrolysis and reducing power
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图 3 Y=(A，B)的响应面与等高线
固定因素C=0
Figure 3. Response surface and contour plots under Y=(A, B)
fixed factor C=0
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图 4 Y=(B，C)的响应面与等高线
固定因素A=0
Figure 4. Response surface and contour plots under Y=(B, C)
fixed factor A=0
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图 5 Y=(A，C)的响应面与等高线
固定因素B=0
Figure 5. Response surface and contour plots under Y=(A, C)
fixed factor B=0
表 1 不同蛋白酶的酶解条件
Table 1 Hydrolysis condition of different proteases
蛋白酶种类
kinds of protease酶活性/U·mg−1
enzyme activitypH 温度/℃
temperature中性蛋白酶 neutral protease 100 7 50 胰蛋白酶 trypsin 250 8 50 复合蛋白酶 compound protease 120 7 50 木瓜蛋白酶 papain 6 000 7 50 风味蛋白酶 flavored proteinase 40 7 50 菠萝蛋白酶 bromelain 100 7 50 
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表 2 响应面实验因素水平表
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平 level 因素 factor 温度 (A) /℃
temperaturepH (B) 加酶量 (C) /U·g−1
enzyme dosage−1 40 6 24 960 0 45 7 28 800 1 50 8 32 640
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表 3 响应面实验设计及结果
Table 3 Experimental results of Box-Behnken design
序号 No. 温度 (A)
temperaturepH (B) 加酶量 (C)
enzyme dosageY/% 1 1 −1 0 23.43 2 −1 0 −1 22.03 3 0 −1 −1 22.57 4 0 0 0 29.94 5 0 0 0 30.33 6 0 −1 1 25.51 7 1 1 0 28.45 8 0 1 −1 24.50 9 0 1 1 29.99 10 1 0 1 27.97 11 0 0 0 29.53 12 1 0 −1 23.80 13 −1 0 1 27.31 14 0 0 0 28.57 15 0 0 0 29.41 16 −1 −1 0 23.70 17 −1 1 0 26.58
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表 4 回归与方差分析结果
Table 4 Analysis of variance for fitted regression model
方差来源
source of variation平方和
SS自由度
df均方
MSF P
prob>F显著性
significance模型 model 129.33 9 14.37 44.69 <0.000 1 *** A 2.04 1 2.04 6.35 0.039 8 * B 25.60 1 25.60 79.63 <0.000 1 *** C 39.91 1 39.91 124.14 <0.000 1 *** AB 1.14 1 1.14 3.55 0.101 4 AC 0.31 1 0.31 0.96 0.360 7 BC 1.63 1 1.63 5.07 0.059 0 A2 20.18 1 20.18 62.76 <0.000 1 *** B2 14.04 1 14.04 43.66 0.000 3 *** C2 18.34 1 18.34 57.05 0.000 1 *** 残差 residual 2.25 7 0.32 失拟项 lack of fit 0.50 3 0.17 0.38 0.772 3 纯误差 pure error 1.75 4 0.44 总和 sum 131.58 16 R2 0.982 9 注：***. P<0.001；*. P<0.05
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表 5 坛紫菜酶解前后抗氧化能力的比较
Table 5 Comparison of antioxidant activity of P. haitanensis before and after hydrolysis
抗氧化指标
antioxidant index酶解前
before hydrolysis酶解后
after hydrolysis还原力 reducing power 0.7±0.01 2.2±0.006 DPPH·清除率/%
scavenging activity11.64±0.02 56.26±0.01 ·OH清除率/%
scavenging activity63.47±0.05 85.84±0.02 ${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率/%
scavenging activity58.36±0.07 72.73±0.03
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