Optimization of enzymatic hydrolysis of protein in abandoned Porphyra haitanensis by response surface methodology and study on antioxidant activity of its hydrolysate
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摘要:
为实现末水坛紫菜(Porphyra haitanensis)的高值化利用，研究了末水坛紫菜的蛋白酶解工艺及其酶解液的抗氧化活性。以酶解产物水解度和还原力为指标，分别采用单因素和响应面优化实验筛选出最适蛋白酶和最佳酶解工艺参数；通过测定酶解液还原力对1,1-二苯基-三硝基苯肼(DPPH)自由基、羟自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(
\begin{document}${\rm{O}}_2^- $\end{document} ·)的清除作用，研究了最高水解度下的酶解液的抗氧化性活性。结果表明，中性蛋白酶是6种蛋白酶中的最适用酶；最佳酶解条件为：底物质量浓度35 g·L−1、加酶量31 200 U·g−1、温度45 ℃、pH 7.6、酶解时间5 h，在此条件下坛紫菜水解度达31.37%；酶解液还原力为2.2，对DPPH、·OH和
${\rm{O}}_2^-$ ·自由基清除率分别为56.26%、85.84%和72.73%。结果表明，中性蛋白酶可以有效水解末水坛紫菜，水解后的酶解产物具有较好的抗氧化能力和应用前景。
Abstract:In order to achieve high-value utilization of abandoned Porphyra haitanensis, we studied the enzymatic hydrolysis technique and antioxidant activity of P. haitanensis protein. Single factor test and response surface optimization test were used to screen the optimum protease and enzymolysis parameters based on the indices of hydrolysis degree and reducing power. The antioxidant activity of the hydrolysate was studied by determining the reducing power of hydrolysate and scavenging ability of hydrolysate on the free radicals DPPH, ·OH and
${\rm{O}}_2^- $ ·. The results show that neutral protease was the optimal enzyme among the six enzymes. The optimal conditions for the hydrolysis of P. haitanensis proteins were as follows: substrate concentration 35 g·L–1, enzyme dosage 31 200 U·g–1, hydrolysis temperature 45 ℃, pH 7.6, hydrolysis time 5 h. Under these conditions, the hydrolysis degree was 31.37% and the reductive power was 2.2. The scavenging rates for DPPH, ·OH and
${\rm{O}}_2^- $ ·were 56.26%, 85.84% and 72.74%, respectively, which indicates that P. haitanensis can be hydrolyzed by neutral protease effectively, and its hydrolysate has good antioxidant activity and application prospects.
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大口黑鲈(Micropterus salmoides)属鲈形目、鲈属，又称加州鲈，是中国高档淡水经济鱼类品种之一[1]。在大口黑鲈养殖与流通过程中，活鱼运输是重要环节之一，捕捞、搬运、离水操作等均会造成鱼体不同程度的应激和损伤，进而影响后续成活率。鱼通过鳃丝或体表摄入麻醉药后，首先抑制脑皮质(触觉丧失期)，再作用于基底神经节与小脑(兴奋期)，最后作用于脊髓(麻醉期)[2]。麻醉在减少操作损伤和死亡率方面发挥着重要作用，不仅能镇静鱼体，缓解惊吓，减少体表碰撞擦伤，还能降低鱼体代谢，维持暂养水质。目前已有应用报道的渔用麻醉剂有60多种，其中间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐(MS-222)与丁香酚较为常用，已有胎花鳉(Poecilia vivipara)[3]、五彩搏鱼(Betta splendens)[4]、刀鲚(Coilia nasus)[5]、孔雀花鳉（Poecilia reticulata）[6]、黑鲷(Sparus macrocephlus)[7]、大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)[8]等种类的麻醉应用被报道。关于MS-222和丁香酚对大口黑鲈麻醉效应的相关研究国内外报道较少，王利娟等[9]和Cooke等[10]分别研究了MS-222和丁香酚对大口黑鲈的模拟运输和运输效果，但未对2种麻醉剂效果进行比较。本文分析了MS-222和丁香酚对大口黑鲈幼鱼的静水麻醉效应及其在模拟运输中的麻醉效果，并结合血清生化指标分析比较两者在同等麻醉强度下对鱼体的麻醉损伤程度，以明确在本实验条件下大口黑鲈幼鱼适合的麻醉方式与麻醉剂量，为大口黑鲈幼鱼活体运输提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
大口黑鲈幼鱼购自广东省珠海市某鱼苗场，平均体质量为(130±10) g。运输至实验室后先经15 g·m–3的甲醛浸浴消毒1 h，再暂养于室内循环水养殖池(直径4.5 m，水深0.8 m)，暂养密度为5 kg·m–3，持续2周。暂养期间投喂佛山市顺德区海皇实业有限公司生产的“海皇”牌鲈鱼配合饲料，每日上午投喂1次，投喂量为鱼质量的(3±1)%。养殖水日循环量200%，水温(28±0.5) ℃，溶解氧质量浓度始终大于6 mg·L–1，pH 7.6±0.2，自然光周期。
1.2 实验方法
1.2.1 静水麻醉实验
实验所用MS-222购自北京格林恒兴生物科技有限公司，与碳酸氢钠按质量比1∶1混溶于纯水，制成母液备用[11]。丁香酚购自上海医疗器械有限公司，与乙醇按体积比1∶10制成母液。已有研究表明，乙醇对鱼没有麻醉作用[12]。以上麻醉剂母液在使用当天制备，并保存于深色玻璃瓶中。麻醉实验在10 L的白桶中进行，MS-222按终质量浓度为40 mg·L–1、50 mg·L–1、60 mg·L–1、70 mg·L–1、80 mg·L–1、90 mg·L–1和100 mg·L–1设置7个梯度组，丁香酚按终质量浓度为8 mg·L–1、10 mg·L–1、12 mg·L–1、14 mg·L–1、16 mg·L–1、18 mg·L–1和20 mg·L–1设置7个梯度组。
实验鱼经停食24 h后用于麻醉实验。每组麻醉重复10尾鱼，每尾鱼单独观察并只使用1次，每重复5尾鱼更换新鲜溶液。麻醉开始1 h内，当鱼停止呼吸或不能进入更深的麻醉状态时将鱼放入复苏桶中直至完全恢复。参照Cooke等[10]、Hikasa等[13]以及Mcfarland和Klontz[14]等的分类标准结合大口黑鲈的实际情况，将麻醉诱导过程分为6个阶段，复苏过程分为4个阶段(表1)。
表 1 麻醉与复苏阶段鱼类行为特征Table 1. Behavioral characteristics of fish during anaesthesia and recovery stages麻醉与复苏阶段
anaesthesia and recovery stages行为特征
behavioral characteristics备注
remarksA0 正常 normal 对外界刺激有反应；鳃盖张合和肌肉收缩正常 麻醉阶段
anaesthesia stageA1 轻度镇静 平衡正常；平衡略微丧失；鳃盖张合频率略减少 A2 深度镇静 对强刺激有反应；鳃盖张合频率减少；平衡正常 用于一般运输 A3 失去平衡 游动无规律；鳃盖张合频率增加；只对强刺激有反应 A4 麻醉 完全丧失肌肉张力和平衡；鳃盖张合频率慢 最佳操作期 A5 深度麻醉 失去反射反应性；鳃盖动作缓慢且不规则；
并且完全丧失反射和反应应当立即复苏 A6 延髓麻醉 窒息；其中鳃盖停止张合；紧接着心脏骤停 复苏阶段
recovery stageR1 身体静止；呼吸恢复；鳃盖开始振动 R2 部分平衡及运动能力恢复 R3 平衡和对外界刺激恢复 R4 行为完全恢复 1.2.2 模拟运输
根据静水麻醉实验得出的2种麻醉剂致大口黑鲈幼鱼深度镇静的作用浓度，进行模拟麻醉运输实验。实验设置麻醉组Ⅰ (50 mg·L–1 MS-222麻醉+运输)、麻醉组Ⅱ (10 mg·L–1丁香酚麻醉+运输)、对照组Ⅰ (无麻醉+无运输)和对照组Ⅱ (无麻醉+运输) 4个处理组，每组设4个重复，每个重复选取5尾幼鱼置于装有5 L养殖水的整理箱，运输密度约130 g·L–1，气石微充气，整理箱固定于恒温振荡器中，转速60 r·min–1，恒温(28.0±0.5) ℃，模拟运输10 h。实验共进行2次模拟运输，第一次用于记录运输成活率和运输后复苏24 h的成活率，第二次用于取血进行血清生化指标分析。
1.2.3 血清生化指标分析
模拟运输结束后，每个重复随机取4~5尾鱼，经200 mg·L–1的MS-222迅速麻醉后，无抗凝剂尾静脉取血，合并为一个混合样，每个处理组共4个血液样本。全血样品在4 ℃下静置2 h，待血液分层后以3 000 r·min–1离心10 min，收集血清于2 mL离心管。采用BS-200全自动生化分析仪测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)，检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司。
1.2.4 数据处理
所有数据均以“平均数±标准差(
$ \overline X \pm {\rm SD}$ )”表示。使用SPSS 22.0软件对实验数据进行统计学分析。在单因素方差分析的基础上，采用Duncan多重比较法进行分析。显著性水平设定为P<0.05。2. 结果
2.1 MS-222和丁香酚的静水麻醉及复苏效果
随着2种麻醉剂浓度的增加，幼鱼进入相同麻醉时期的时间缩短，而完全复苏的时间延长(图1，表2)。当MS-222与丁香酚质量浓度分别为50 mg·L–1和10 mg·L–1时，幼鱼始终保持在深度镇静期，随着麻醉剂浓度增加，麻醉程度加深，分别在70 mg·L–1和16 mg·L–1时进入麻醉期。
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图 1 大口黑鲈在不同浓度的MS-222和丁香酚作用下进入麻醉状态A1~A5 和复苏至R4 的时间 （n=10）Figure 1. Time for largemouth bass reached A1–A5 anesthesia stages and recovery to R4 stage at different concentrations of MS-222 and eugenol表 2 不同浓度MS-222和丁香酚对大口黑鲈的麻醉及复苏效果 (n=10)Table 2. Anaesthetic and recovery effects of MS-222 and eugenol on largemouth bass at different concentrations麻醉剂质量浓度/mg·L–1
anesthetic concentration进入不同麻醉程度的时间/s
average time for reaching different anaesthesia stages复苏至R4时间/s
recovery time
(to R4)24 h后成活率/%
survival rate after 24 hA1 A2 A3 A4 A5 A6 MS-222 40 160±19 – – – – – 49±9 100 50 126±16 254±53 – – – – 58±13 100 60 113±15 190±41 310±54 * – – 98±36 100 70 103±10 131±25 258±50 504±83 – – 189±47 100 80 66±11 122±19 188±39 319±64 487±90 – 280±52 90 90 61±9 119±21 162±36 202±45 453±103 * 313±73 70 100 56±13 83±20 116±32 172±38 295±59 * 346±85 50 丁香酚 eugenol 8 240±49 – – – – – 44±8 100 10 220±43 403±76 – – – – 60±11 100 12 194±37 366±68 * – – – 65±12 100 14 160±33 330±63 780±132 – – – 69±14 100 16 127±27 294±56 576±107 1 034±204 – – 76±17 90 18 80±18 181±39 251±48 513±98 683±133 * 106±23 60 20 55±12 148±28 220±32 234±42 277±53 * 120±31 50 注：–. 在1 h内没有观察到相应的麻醉状态；*. 只有少数鱼在1 h内进入麻醉状态 Note: no corresponding anaesthesia state was observed within 1 h; *. only a few fish reached anaesthesia state within 1 h. 当幼鱼在麻醉液中1 h内不能进入更深状态时立即放入清水中复苏，并记录时间。待复苏至R4阶段后放回暂养池，记录24 h后的成活率。复苏时间随着麻醉剂浓度增加而增加(图1，表2)。复苏后24 h，经80 mg·L–1 MS-222和16 mg·L–1丁香酚处理的幼鱼开始出现死亡，且死亡率随着麻醉剂浓度升高而增加(表2)。从麻醉和复苏时间看，丁香酚进入同一麻醉阶段时间迟于MS-222，但复苏时间短。
2.2 MS-222和丁香酚的模拟麻醉运输效果
大口黑鲈幼鱼经10 h模拟运输，麻醉组成活率和复苏后24 h成活率均为100%，显著高于对照组Ⅱ的80%和60% (P<0.05，图2)。同时对各处理组实验鱼模拟运输过程中的行为观察发现，麻醉组鱼对长期持续的震荡摇晃刺激敏感性差，全程呼吸平缓，紧张不安表现较弱。而对照组Ⅱ的鱼在模拟运输过程中表现出狂躁游动、呼吸加快、碰撞和惊跃等不安行为。
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图 2 大口黑鲈运输和复苏24 h 的成活率大写字母不同表示运输后成活率差异性显著，小写字母不同表示复苏后24 h成活率差异性显著(P<0.05)Figure 2. Survival rate of largemouth bass after anaesthesia transportDifferent uppercase letters indiacte significant difference in the survival rate after transportation (P<0.05); while different lowercase letters indicate significant difference in the survival rate after 24 h of recovery (P<0.05).2.3 模拟麻醉运输后血清生化指标分析
与无麻醉运输组和静水组相比，麻醉运输组血清中ALT、AST水平显著升高(P<0.05)，AKP略微升高，但差异不显著(图3)。而在麻醉运输组中，MS-222麻醉组血清中ALT和AST的含量显著高于丁香酚麻醉组(P<0.05，图3)。
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图 3 麻醉运输后大口黑鲈血清生化指标组间字母不同者差异显著(P<0.05)Figure 3. Change of serum biochemical index of largemouth bass after anaesthesia transportValues with different letters were significantly different (P<0.05).3. 讨论
3.1 2种麻醉剂对大口黑鲈幼鱼的静水麻醉效应
麻醉剂在现代水产养殖和养殖动物福利方面发挥着重要作用。时效性、持久性、安全性和经济性等是筛选麻醉剂的几个关键指标。从本实验结果看，MS-222和丁香酚均能快速达到麻醉和复苏效果，具有较高的时效性。其中MS-222分别在50 mg·L–1和70 mg·L–1，丁香酚分别在10 mg·L–1和16 mg·L–1时使本实验条件下的大口黑鲈幼鱼进入深度镇静和完全麻醉期，与已有文献结果稍有差异(表3)，这可能与麻醉剂纯度、物种、年龄和实验环境不同有关。
表 3 不同鱼进入深度镇静和麻醉阶段所需要麻醉剂的浓度Table 3. Concentration of anesthetic agent required for different fish species reaching deep sedation and anesthesia种类
species深度镇静
deep sedation麻醉
anesthesia刀鲚[5] C. nasus 30 mg·L–1 MS-222或8 mg·L–1丁香酚 150 mg·L–1 MS-222或30 mg·L–1丁香酚 大口黑鲈[10] M. salmoides 5~9 mg·L–1丁香酚 15~20 mg·L–1丁香酚 黑双带小丑鱼[15] Amphiprion sebae 17.5 mg·L–1丁香酚 大西洋鲑[16] Salmo salar 65 mg·L–1 MS-222 庸鲽[17] Hippoglossus hippoglossus 80 mg·L–1 MS-222 大西洋鳕[18] Gadus morhua 60 mg·L–1 MS-222 欧洲狼鲈[19] Dicentrarchus labrax 25 ℃时40 mg·L–1丁香酚，15 ℃时30 mg·L–1丁香酚 大西洋鲷[19] Sparus aurata 25 ℃时40 mg·L–1丁香酚，15 ℃时55 mg·L–1丁香酚 从麻醉复苏实验结果得出，随着2种麻醉剂浓度升高，实验鱼入麻时间缩短，复苏时间延长，复苏后24 h死亡率随着麻醉剂浓度增加而升高。已有研究发现，MS-222进入鱼体后大部分富集在脾脏和肝脏中，大剂量的麻醉剂会麻痹呼吸中枢，丁香酚也被认为会引起肝脏方面的问题[20]，因此肝脏受损可能是麻醉过度导致鱼类死亡的主要原因。此外，过度麻醉带来的鱼体急性缺氧也是造成死亡的原因之一，麻醉剂降低了鱼体呼吸频率导致动脉中氧分压降低，呼吸不畅加之血氧降低、二氧化碳升高，导致低血压和心率、心输出量发生变化[21]，进而影响成活率。
3.2 2种麻醉剂对大口黑鲈幼鱼模拟麻醉运输效果
运输过程中的长时间持续震荡摇晃，造成鱼类机体较大程度的应激与其他继发损伤。通过一定剂量的麻醉辅助运输，可以镇定鱼体，舒缓紧张，降低因紧张和惊吓带来的机体能量消耗和碰撞损伤。本实验将幼鱼置于50 mg·L–1的MS-222和10 mg·L–1的丁香酚时，幼鱼均能达到深度镇静阶段，没有产生不适现象，复苏后24 h成活率为100%，说明MS-222和丁香酚具有持久性和安全性。
在活鱼运输中，麻醉剂可使鱼体运动量和生理变化最小化[22]。使用麻醉剂能使运动导致的体表损伤、相关的渗透调节障碍和对病原体的易感性降低[23]，并且降低代谢，从而降低需氧量并产生较少的代谢物[24]。对照组Ⅱ的成活率为80%，复苏后24 h成活率仅为60%。造成对照组Ⅱ死亡的主要原因是幼鱼对震荡环境产生了应激反应，鱼体之间相互摩擦和碰撞造成鱼体损伤，且活动量增加使鱼体缺氧，从而导致鱼体在运输过程中发生死亡，造成复苏后24 h死亡的原因可能是在运输过程中的过度应激和免疫功能下降[25]。
3.3 麻醉损伤与2种麻醉剂应用效果比较
AST和ALT是肝脏中连接糖、脂质和蛋白质代谢的重要酶[26]，且AST是人及动物肝脏受损最灵敏的指标[27]。正常血清中AST和ALT活性较低且相对稳定；当肝脏受损时，AST和ALT从肝细胞中释放到血液，血清中的AST和ALT活性增加[28-29]。AKP的活性可以作为预测疾病诊断及环境污染程度的重要指标[30-31]。
经过10 h运输，2个对照组血清生化指标差异不显著，而麻醉运输组血清AST和ALT的活性较对照组显著升高(P<0.05)，AKP也有增加，但不显著(图4)。张丽和汪之和[32]曾指出MS-222进入鱼体后大部分聚集在脾脏、肝脏中，而丁香酚会引起肝脏方面的问题[20]，因此，2个麻醉组较2个对照组血清中AST和ALT显著升高(P<0.05)，可能与麻醉剂的代谢方式有关。而运输过程中实验鱼血清生化指标的变化趋势还需进一步研究。
使用MS-222会造成机体中间氨基苯酸、乙醇、甲烷、磺酸盐及其化合物残留，而丁香酚作为天然植物提取物，其代谢产物能迅速从血液和组织中排出[33]。此外，丁香酚能通过非竞争性对抗钙离子(Ca2+)催化反应，抑制羟自由基形成，保护细胞膜脂质免受氧化[34]，从而在一定程度上降低了肝细胞的损伤。麻醉组Ⅰ较麻醉组Ⅱ血清中AST和ALT显著升高(P<0.05)，这可能是丁香酚对鱼体肝脏的损伤程度低于MS-222，这一观点同刘双凤和蔡勋[35]的报道相符。Pawar等[36]研究了MS-222、苯佐卡因、丁香油和2-苯氧乙醇对管海马(Hippocampus kuda)的麻醉效果，发现在所有被测试的麻醉品中，MS-222和丁香油被证明是最有效的，而后者满足了理想鱼类麻醉的许多标准。从安全和成本上考虑，笔者更倾向于使用丁香酚。
尽管丁香酚在美国、加拿大、英国不被允许使用，但是在澳大利亚、智利、芬兰、新西兰等国家是合法的水产麻醉剂[37]，日本也批准了丁香酚可用作水产动物的麻醉[13]。与MS-222相比，丁香酚具有以下优点：1)价格低廉且易获得；2)代谢快；3)降低基于血清皮质醇和中性粒细胞分析水平的应激反应[38]。
本实验模拟运输使用的是密闭整理箱，降低了丁香酚的挥发率，避免了因有效浓度变化而造成在运输过程中复苏的现象，若是使用敞口的运输装置，很可能造成幼鱼在运输途中复苏。所以在生产中针对快速麻醉搬运的短期运输时，丁香酚更为适合，长期运输时则可选择补加丁香酚或使用MS-222进行麻醉运输。
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图 1 不同酶酶解时间对水解度 (a) 和还原力 (b) 的影响
Figure 1. Effect of enzymolysis time of different enzymes on degree of hydrolysis (a) and reducing power (b)
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图 2 pH (a)、酶解温度 (b)、底物质量浓度 (c)、酶解时间 (d) 和加酶量 (e) 对水解度和还原力的影响
Figure 2. Effects of pH (a), hydrolysis temperature (b), substrate mass concentration (c), hydrolysis time (d) and enzyme dosage (e) on degree of hydrolysis and reducing power
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图 3 Y=(A，B)的响应面与等高线
固定因素C=0
Figure 3. Response surface and contour plots under Y=(A, B)
fixed factor C=0
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图 4 Y=(B，C)的响应面与等高线
固定因素A=0
Figure 4. Response surface and contour plots under Y=(B, C)
fixed factor A=0
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图 5 Y=(A，C)的响应面与等高线
固定因素B=0
Figure 5. Response surface and contour plots under Y=(A, C)
fixed factor B=0
表 1 不同蛋白酶的酶解条件
Table 1 Hydrolysis condition of different proteases
蛋白酶种类
kinds of protease酶活性/U·mg−1
enzyme activitypH 温度/℃
temperature中性蛋白酶 neutral protease 100 7 50 胰蛋白酶 trypsin 250 8 50 复合蛋白酶 compound protease 120 7 50 木瓜蛋白酶 papain 6 000 7 50 风味蛋白酶 flavored proteinase 40 7 50 菠萝蛋白酶 bromelain 100 7 50 
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表 2 响应面实验因素水平表
Table 2 Factors and levels of response surface experiment
水平 level 因素 factor 温度 (A) /℃
temperaturepH (B) 加酶量 (C) /U·g−1
enzyme dosage−1 40 6 24 960 0 45 7 28 800 1 50 8 32 640
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表 3 响应面实验设计及结果
Table 3 Experimental results of Box-Behnken design
序号 No. 温度 (A)
temperaturepH (B) 加酶量 (C)
enzyme dosageY/% 1 1 −1 0 23.43 2 −1 0 −1 22.03 3 0 −1 −1 22.57 4 0 0 0 29.94 5 0 0 0 30.33 6 0 −1 1 25.51 7 1 1 0 28.45 8 0 1 −1 24.50 9 0 1 1 29.99 10 1 0 1 27.97 11 0 0 0 29.53 12 1 0 −1 23.80 13 −1 0 1 27.31 14 0 0 0 28.57 15 0 0 0 29.41 16 −1 −1 0 23.70 17 −1 1 0 26.58
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表 4 回归与方差分析结果
Table 4 Analysis of variance for fitted regression model
方差来源
source of variation平方和
SS自由度
df均方
MSF P
prob>F显著性
significance模型 model 129.33 9 14.37 44.69 <0.000 1 *** A 2.04 1 2.04 6.35 0.039 8 * B 25.60 1 25.60 79.63 <0.000 1 *** C 39.91 1 39.91 124.14 <0.000 1 *** AB 1.14 1 1.14 3.55 0.101 4 AC 0.31 1 0.31 0.96 0.360 7 BC 1.63 1 1.63 5.07 0.059 0 A2 20.18 1 20.18 62.76 <0.000 1 *** B2 14.04 1 14.04 43.66 0.000 3 *** C2 18.34 1 18.34 57.05 0.000 1 *** 残差 residual 2.25 7 0.32 失拟项 lack of fit 0.50 3 0.17 0.38 0.772 3 纯误差 pure error 1.75 4 0.44 总和 sum 131.58 16 R2 0.982 9 注：***. P<0.001；*. P<0.05
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表 5 坛紫菜酶解前后抗氧化能力的比较
Table 5 Comparison of antioxidant activity of P. haitanensis before and after hydrolysis
抗氧化指标
antioxidant index酶解前
before hydrolysis酶解后
after hydrolysis还原力 reducing power 0.7±0.01 2.2±0.006 DPPH·清除率/%
scavenging activity11.64±0.02 56.26±0.01 ·OH清除率/%
scavenging activity63.47±0.05 85.84±0.02 ${\rm{O}}_{\rm{2}}^{\rm{ - }}$·清除率/%
scavenging activity58.36±0.07 72.73±0.03
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