Preliminary analysis of the Bahaba taipingensis' acoustic spectrum characteristics
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摘要: 文章通过被动声学方法监听黄唇鱼(Bahaba taipingensis)的声音，初步分析了其声谱特征，旨在为黄唇鱼声学无损调查、水下噪声影响分析和发声的生物学行为等物种保护研究提供基础数据。2017年3—5月，用microMARS型声学记录仪对东莞黄唇鱼市级自然保护区室内水族箱和室外2个驯养池中救护驯养的96尾黄唇鱼进行了2个时段、每个时段连续7个昼夜的声学监听。监听到黄唇鱼共发声246次，发出7类声音，分别是类鼓声、咔嚓声、雀鸣声、嗡嗡声、嗒嗒声、嚓咕声和其他声音等。黄唇鱼昼夜发声次数没有明显差异。黄唇鱼发声以类鼓声为主(175次)，类鼓声由1~3个脉冲组成，又以单脉冲类鼓声为主(139次)。类鼓声为类正弦波形，能量集中在0~1 000 Hz，声纹与时间轴平行，谱峰中心频率为50~140 Hz。嗒嗒声与类鼓声相似，其能量也集中在0~1 000 Hz，但谱峰中心频率范围为180~190 Hz。嗡嗡声、咔嚓声、雀鸣声和嚓咕声同时包含低频(0~1 000 Hz)与高频(3 000~12 500 Hz)成分。类鼓声时长、脉冲宽度和脉冲间隔范围分别为67~1 333 ms、35~733 ms和0~1 130 ms，平均值分别为279 ms、70 ms和183 ms；类鼓声时长和脉冲间隔随着声信号脉冲数的增加而增长，脉冲宽度则减短。Abstract: We analyzed the acoustic spectrum of Bahaba taipingensis by monitoring its sound with passive acoustic method to provide basic data for the non-destructive investigation method, underwater noise environment analysis and sounding behavior of B. taipingensis. We carried out acoustic monitoring on 96 individuals of B. taipingensis by microMARS acoustic recorder in the indoor aquarrium and the two outdoor pools of Dongguan B. taipingensis Nature Reserve from March to May in 2017 (two periods and each period had 7 days and nights). We had monitored 246 sounds in total, belonging to seven types (drum sound, humming sound, cracking sound, clacking sound, bird sound, cha goo sound and other sounds). No significant difference was observed in the number of sounds between day and night. The drum sound was the main sound of B. taipingensis (175 times). The drum sound was composed of 1−3 pulses, being dominated by a single pulse type of drum (139 times). The drum sound had some sine shaped waveform (energy: 0−1 000 Hz), and its voiceprint was parallel to the timeline. The drum sound's spectral frequency peak ranged from 50 Hz to 140 Hz. The energy distribution of cracking sound was similar to that of drum sound (0−1 000 Hz), while the spectral frequency peak was 180−190 Hz. The energy distribution and frequency of the humming sound, cracking sound, birds sound and cha goo sound were both at low frequency (0−1 000 Hz) and high frequency (3 000−12 500 Hz). The pulse length, width and interval of drum sound were 67−1 333 ms, 35−733 ms and 0−1 130 ms, respectively (the average values were 279 ms, 70 ms and 183 ms, respectively). The length of drum sound and the pulse interval increased with increasing number of pulse of sound signals, while the pulse width decreased.
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岩藻黄质是一种类胡萝卜素，在自然界中分布广泛，主要存在于藻类、贝类中，尤其在褐藻、硅藻中含量较高。岩藻黄质可以与叶绿素、蛋白质形成捕光复合体，是硅藻中发挥捕光作用的重要化合物[1]。目前有关岩藻黄质活性的报道较多，研究表明岩藻黄质具有抑菌、抗炎、抗肥胖、抗糖尿病、抗肿瘤、调节肠道菌群和抗器官纤维化等生理活性[2-6]。
目前岩藻黄质的最主要来源依旧是海藻[7]，例如海带 (Laminaria japonica)、三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum)[8]。岩藻黄质是一种优质的海洋来源功能因子，但由于其合成途径目前尚未得到完全解析，其生产及产量调控尚缺乏理论依据[9-12]，合成生物学是发掘未知合成途径的重要手段，通常需要首先在微生物中异源构建目标化合物的上游已知中间物的合成途径，然后利用合成该中间物的工程菌株探索下游未知途径[13]。目前已知合成途径且结构上最接近岩藻黄质的中间物是新黄质[14]。作为岩藻黄质的可能前体物质，新黄质的结构与岩藻黄质很相似 (图1)，两者均含有1条多烯链，2个六元环和1个累积双键，但存在着双键、羟基和羰基、乙酰氧基的区别。
新黄质的合成途径见图2。甲羟戊酸 (MVA) 途径主要存在于真核生物、古生菌和植物的细胞质中，甲基赤藓糖醇-4-磷酸 (MEP) 途径主要存在于细菌和植物叶绿体中，丙酮酸、甘油醛-3-磷酸和乙酰辅酶A分别通过MEP途径和MVA途径生成MEP和MVA，再经由其他酶催化生成异戊烯焦磷酸 (IPP) 和二甲基烯丙基焦磷酸 (DMAPP)[15-17]。大肠杆菌中含有MEP途径，并有法尼基焦磷酸 (FPP) 可以作为岩藻黄质的底物[15,18]。
目前尚未见以微生物宿主生产新黄质的报道，因此构建合成新黄质的微生物细胞工厂成为发掘岩藻黄质的未知途径，并进一步成为海藻高效生产岩藻黄质提供理论依据的关键环节。本研究以大肠杆菌 (Escherichia coli ) 为宿主，按照代谢途径逐步构建番茄红素、β-胡萝卜素、玉米黄质、紫黄质的合成途径，最终实现了新黄质的代谢工程合成，为进一步发掘岩藻黄质合成的未知途径奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试剂材料
1.1.1 菌株及质粒
本文所用菌株的基因型、功能及来源见表1，质粒的基因型、功能及来源见表2。
表 1 本文所用菌株Table 1. Strains in this study菌株
Strain基因型
Genotype功能
Function来源
SourceTreliefTM5α化学感受态细胞
TreliefTM5α Chemically competent cellF−, φ80dlacZ Δ M15, Δ (lacZYA-argF) U169, deoR, recA1, endA1, hsdR17 (rK−, mK+), phoA, supE44, λ−, thi-1, gyrA96, relA1 质粒克隆 擎科生物 BL21 (DE3) 化学感受态细胞
BL21 (DE3) Chemically competent cellF−, ompT, hsdSB (rB−, mB−), gal, dcm (DE3) 高效表达 擎科生物 菠萝泛菌 Pantoea ananatis crtE, crtB, crtI, crtY, crtZ 获取crtE、crtB、
crtI、crtY和crtZ基因中国工业微生物菌
种保藏管理中心E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 生产番茄红素 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 生产β-胡萝卜素 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 生产玉米黄质 本实验构建 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-TT7, AmpR, CmR 生产紫黄质 本实验构建 E. coli BL21 NEO lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, PT7-QZEP3-NSY-TT7, AmpR, CmR 生产新黄质 本实验构建 注：crtE. 牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因；crtB. 八氢番茄红素合成酶基因；crtI. 八氢番茄红素脱氢酶基因；crtY. 番茄红素环化酶基因；crtZ. β-胡萝卜素羟化酶基因；ZEP3. 玉米黄质环氧化酶基因；QZEP3. 去除叶绿体转运肽的玉米黄质环氧化酶基因；NSY. 新黄质合酶基因；后表同此。 Note: crtE. The gene of Geranylgeranyl diphosphate synthase; crtB. The gene of phytoene synthase; crtI. The gene of phytoene desaturase; crtY. The gene of Lycopene cyclase; crtZ. The gene of β-carotene hydroxylase; ZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase; QZEP3. The gene of zeaxanthin epoxidase without chloroplast transport peptide; NSY. The gene of neoxanthin synthase. The same case below. 表 2 本文所用质粒Table 2. Plasmids in this study质粒
Plasmid基因型
Genotype功能
Function来源
SourcepTrc99a lacI, Ptrc-TrrnB, AmpR 载体 本实验室 pTrc99a-crtEBI lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产番茄红素 本实验构建 pTrc99a-crtEBIY lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产β-胡萝卜素 本实验构建 pTrc99a-crtEBIYZ lacI, Ptrc-crtE-crtB-crtI-crtY-crtZ-TrrnB, AmpR 在E. coli BL21中生产玉米黄质 本实验构建 pACYCDuet-1 lacI, PT7-TT7, CmR 载体 本实验室 pACYCDuet-1-ZEP3 lacI, PT7-ZEP3-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建 pACYCDuet-1-QZEP3 lacI, PT7-QZEP3-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产紫黄质 本实验构建 pACYCDuet-1-QZEP3-NSY lacI, PT7-QZEP3-NSY-TT7, CmR 在E. coli BL21中生产新黄质 本实验构建 1.1.2 生化试剂及药品
番茄红素标准品、β-胡萝卜素标准品、玉米黄质标准品、紫黄质标准品和新黄质标准品购于Sigma-Aldrich公司。高保真DNA聚合酶试剂Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase、DNA聚合酶试剂2×Taq Master Mix (Dye Plus)、重组克隆试剂ClonExpress Ultra One Step Cloning Kit购于诺唯赞生物公司。凝胶萃取试剂盒E.Z.N.A® Gel Extraction Kit购于Omega Bio-Tek公司。细菌基因组DNA提取试剂盒、快速质粒小提试剂盒购于天根生化科技公司。酵母粉、蛋白胨、琼脂粉、氨苄青霉素、氯霉素购于索莱宝科技公司。SSCS Solution感受态制备液购于上海捷瑞生物公司。其他试剂及药品未作特殊说明均为国药化试分析纯。PCR引物合成及测序由青岛擎科公司提供。
1.1.3 试剂及培养基配方
LB培养基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，1%的氯化钠(NaCl，固体培养基中加入2%琼脂粉)，115 ℃灭菌30 min。
ZYP-5052培养基：0.5%酵母粉，1%蛋白胨，8.1 g·L−1 磷酸氢钠 (Na2HPO4)，6.8 g·L−1 磷酸二氢钾 (KH2PO4)，3.3 g·L−1 磷酸铵 [(NH4)2SO4]，0.2%的0.5 mol·L−1 硫酸镁(MgSO4)，2%的50×5052母液 (50×5052母液：25%甘油，2.5%葡萄糖，10%的α-乳糖)，115 ℃灭菌30 min。
氨苄青霉素溶液：溶剂为水，在培养基中使用的终质量浓度为100 µg·mL−1。
氯霉素溶液：溶剂为乙醇，在培养基中使用的终质量浓度为25 µg·mL−1。
1.2 方法
1.2.1 DNA目的片段PCR扩增
考虑到一个质粒上需要加入多个目的片段，为了保证每个片段能够正确表达，本研究在构建质粒的过程中会在2个目的片段的中间加入一段核糖体结合位点 (RBS)。在NCBI查找了菠萝泛菌中crtE、crtB、crtI、crtY、crtZ目的片段的CDS序列[19]。设计引物见表3，从菠萝泛菌基因组中通过PCR扩增得到了这5个基因。ZEP3基因来自三角褐指藻[20]，NSY基因来源于番茄[21]，由华大基因全基因合成。
表 3 引物序列Table 3. Primer sequence引物名称
Primer序列 (5'—3')
Sequence (5'—3')crtE-F CCGGAATTCATGACGGTCTGCGCAAAA crtE-R TCCCCCGGGTTAACTGACGGCAGCGAG crtB-F TCCCCCGGGCAGGAACAGATGAATAATCCGTCGTTA crtB-R CTAGTCTAGACTAGAGCGGGCGCTGCCA crtI-F CTAGTCTAGACAGGAACAGATGAAACCAACTACGGTA crtI-R CCCAAGCTTTCATATCAGATCCTCCAG crtY-F GAGGATCTGATATGAAAGCTTCACAGGAAACAGACCATGCAACCGCATTAT crtY-R GGTCTGTTTCCTGTGTTAACGATGAGTCGT crtZ-F CACAGGAAACAGACCATGTTGTGGATTTGG crtZ-R TCCGCCAAAACAGCCAAGCTTTTACTTCCCGGATGCGG ZEP3-F CACCACAGCCAGGATCCTATGAGTGAAGAAAAAGTGGA ZEP3-R TGCGGCCGCAAGCTTTTACAGGCCTGCTGC NSY-F AGATATACATATGGCAGATCTATGGAAACCCTGCTGAAAC NSY-R GGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTACAGGCTTTCAATTGC 1.2.2 质粒的构建
同源重组法构建质粒：利用高保真DNA聚合酶PCR扩增目的基因片段与质粒片段，使得各片段连接处留有15~20 bp同源序列，使用重组克隆试剂进行重组连接，将重组产物转入E. coli Trelief™5α感受态中，涂布至对应抗生素的LB固体培养基上。12 h后对固体培养基上生长的转化子进行菌落PCR验证并选取样品进行测序。LB培养基培养测序正确的菌株，使用快速质粒小提试剂盒提取质粒。
1.2.3 工程菌的构建
单质粒工程菌的构建：将pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ质粒分别利用热激法直接转入E. coli BL21感受态细胞中。
双质粒工程菌的构建：将E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ工程菌制备成感受态细胞，再利用热激法将pACYCDuet-1-QZEP3、pACYCDuet-1-QZEP3-NSY质粒转入。感受态制备方法为：将需制成感受态的菌株在LB培养基中培养4~5 h (OD600达到0.6左右)，取菌液在4 000 r·min−1、4 ℃条件下离心5 min，弃上清后加入10%原菌液体积的10%无菌甘油洗涤菌体，再次离心弃上清，再重复一次甘油洗涤和离心弃上清，加入2%原菌液体积的SSCS Solution感受态制备液，即得到感受态细胞。
1.2.4 工程菌株的发酵培养
将工程菌在含有对应抗生素的LB固体培养基上培养，再挑取菌落在含有抗生素的LB培养基中培养12 h，得到种子液。按2%接菌量将种子液接入50 mL ZYP-5052培养基，20 ℃发酵48 h。
1.2.5 产物提取
大肠杆菌类胡萝卜素提取[22]：取2.0 mL的菌液，8 000 r·min−1离心10 min留菌体，加入1 mL丙酮，在40 ℃条件下，萃取至菌体颜色全部变成白色，12 000 r·min−1离心2 min留丙酮上清。萃取液采用氮吹法进行吹干，获得类胡萝卜素产物，用200 μL丙酮复溶，0.22 µm尼龙滤膜去除杂质，得到待检测样品。
1.2.6 高效液相色谱 (HPLC) 和质谱法 (MS) 对产物的鉴定及定量分析
C30检测方法[23]：使用YMC Carotenoid类胡萝卜素分析色谱柱 (250×4.6 mm) 对提取产物进行分析，进样量20 μL，吸光值476 nm，柱温35 ℃，流速1.0 mL·min−1。具体的液相检测条件见表4。用该方法绘制标准曲线 [y为峰面积，x为质量浓度 (mg·L−1)]。番茄红素：y=52.505x−1.670 7, R2=0.999；β-胡萝卜素：y=1 312.9x−12.668, R2=0.999；玉米黄质：y=129.92x−39.204, R2=0.999；紫黄质：y=130.76x−33.414, R2=0.999。
表 4 YMC Carotenoid流动相条件Table 4. YMC Carotenoid mobile phase conditionst/min 甲醇比例
Methanol proportion/%甲基叔丁醚比例
Methyl tertiary butyl ether/%0 90 10 15 90 10 25 40 60 35 90 10 上述C30色谱柱检测方法无法分离紫黄质和新黄质，所以我们采用了另一种C18检测方法来达到分离目的。C18检测方法[24]：使用C18 (250×4.6 mm, 5 μm)色谱柱检测，流动相是V(乙腈)∶V(乙酸乙酯)∶V(水)=74∶16∶10，采用等度洗脱，进样量20 μL，吸光值440 nm，柱温42 ℃，流速1.0 mL·min−1。用该方法绘制标准曲线 [y为峰面积，x为质量浓度 (µg·L−1)]。紫黄质：y=76.889 x−140.93，R2=0.997；新黄质：y=357.07x+2.392，R2=0.991。
四极杆飞行时间质谱条件：离子源为电喷雾电离源 (ESI)；电离化方式为ESI+；毛细管温度为350 ℃；雾化器压力为276 kPa；干燥气流速为10 L·min−1；扫描范围为m/z 20~1 000。
1.2.7 细胞干质量的测量方法
取2 mL发酵后的菌液，12 000 r·min−1离心3 min，置于85 ℃烘箱烘干24 h，测量细胞干质量[25]。根据产物浓度与细胞干质量，计算出产量单位 (细胞干质量，下同) 为mg·g−1或µg·g−1。
2. 结果与分析
2.1 番茄红素、 β-胡萝卜素和玉米黄质工程菌的构建
质粒pTrc99a-crtEBI、pTrc99a-crtEBIY和pTrc99a-crtEBIYZ成功转入E. coli BL21后，对应的工程菌E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI、E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ发酵后菌体发生了颜色变化，对菌体内物质进行HPLC分析 (图3)，结果表明成功产出了番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质。根据标准曲线及细胞干质量计算出各产物浓度，其中E. coli BL21 pTrc99a-crtEBI的番茄红素产量为3.20 mg·g−1；E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY的β-胡萝卜素产量为1.35 mg·g−1；E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ的玉米黄质产量为0.70 mg·g−1。
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图 3 番茄红素、β-胡萝卜素和玉米黄质工程菌的构建Figure 3. Construction of lycopene, β-carotene and zeaxanthin engineered bacteria在T7启动子的作用下，基因crtE、crtB、crtI、crtY和crtZ成功表达，产出目标产物。根据HPLC结果，E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIY和E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ中并没有发现中间产物的积累，可能原因是产物浓度较低，CRTI、CRTY和CRTZ蛋白水平相较于低浓度产物来说催化能力较强，导致没有中间产物的积累，也可能与菌株本身以及生长状况有关，不同菌株在不同生长状况下产物积累量存在差异。
2.2 紫黄质和新黄质工程菌株的构建
以产玉米黄质的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ为宿主菌株，转入pACYCDuet-1-ZEP3质粒，构建产紫黄质菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-ZEP3。但HPLC检测结果显示并无紫黄质产生。分析原因可能为ZEP3基因来源于三角褐指藻，是真核生物来源的基因，可能存在信号肽或叶绿体转运肽的编码区，但原核生物无法实现真核生物对蛋白的加工，导致蛋白折叠错误，使活性减弱甚至消失。
因此利用网站http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/预测叶绿体转运肽，预测前54个氨基酸为cTP区域。去除ZEP3基因的cTP后得到QZEP3，重新构建pACYCDuet-1-QZEP3质粒再转入产玉米黄质的工程菌中，HPLC分析菌体内产物有紫黄质存在 (图4)，进一步证实了以上猜想。
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图 4 E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3工程菌发酵产物HPLC结果Figure 4. HPLC results of fermentation products of E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3根据标准曲线及细胞干质量计算出产物浓度，E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3的紫黄质的产量为114.70 μg·g−1, 玉米黄质产量为289.45 μg·g−1。该工程菌中不仅有紫黄质生成，还有β-胡萝卜素和玉米黄质中间产物的积累，但并未检测到番茄红素的积累，可能原因是QZEP3的蛋白水平并不高，使得玉米黄质有较多积累，而番茄红素和β-胡萝卜素的积累可能与菌株生长状况相关，在不同生长状况下产物积累量存在差异，致使菌体内存在中间产物的积累。进一步分析HPLC结果，该工程菌不仅产出预期的β-胡萝卜素、玉米黄质和紫黄质，还有未知的产物 (保留时间6.2和10.6 min) 被检测到，猜测可能是QZEP3催化玉米黄质生成紫黄质时还生成了中间体产物。
以产紫黄质的菌株E. coli BL21 pTrc99a-crtEBIYZ pACYCDuet-1-QZEP3为宿主菌株，转入pACYCDuet-1-QZEP3-NSY质粒，构建产新黄质菌株E. coli BL21 NEO。用C30和C18色谱柱的方法对E. coli BL21 NEO菌体内产物进行检测 (图5)。紫黄质与新黄质是同分异构体，分子式为C40H56O4，分子量为600.417 9。E. coli BL21 NEO中的新黄质和紫黄质质谱结果 (图6) 显示，新黄质对应分子离子峰的m/z为600.414 6，紫黄质对应分子离子峰的m/z为600.413 8，这与紫黄质和新黄质分子量基本相当。HPLC与MS结果表明E. coli BL21 NEO成功产出新黄质。根据标准曲线及细胞干质量计算出各产物浓度，其中新黄质的产量为99.27 μg·g−1，紫黄质的产量为150.30 μg·g−1，玉米黄质的产量为119.77 μg·g−1。E. coli BL21 NEO不仅产出预期的新黄质，还有β-胡萝卜素、玉米黄质和紫黄质的积累，也有未知的中间体产物生成。
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图 6 E. coli BL21 NEO工程菌新黄质 (a) 和紫黄质 (b) 的质谱检测结果Figure 6. Detection results of neoxanthin (a) and violaxanthin (b) in E. coli BL21 NEO by MS本文以产玉米黄质的工程菌为宿主，并将QZEP3和NSY导入，实现了新黄质的合成，但是QZEP3和NSY基因导入后的紫黄质和新黄质产量浓度不高，可能是上游途径的底物含量少，酶的催化效果不高，后续可以通过理性设计或定向进化对QZEP3和NSY进行改造，提高QZEP3和NSY在大肠杆菌中的活性来提高紫黄质和新黄质的产量，或者通过更换启动子，调节MEP上游通路途径，基因的过表达等方法[26-29]，进一步提升紫黄质和新黄质的产量。
3. 结论
本文以大肠杆菌为表达菌株，进行了新黄质合成途径的构建。以含有crtEBIYZ基因的产玉米黄质的E. coli BL21为宿主，引入了QZEP3和NSY基因，成功在大肠杆菌中建立了新黄质合成途径。有关新黄质本身的生理活性研究并不多[30-32]，以微生物生产新黄质可提供新的生产途径，为研究新黄质的生理活性等提供便利，也为进一步探究岩藻黄质的合成途径奠定了基础。岩藻黄质的合成途径可以指导褐藻等海藻中岩藻黄质等物质的高值化利用，如通过理性设计改造获得高产岩藻黄质的藻类。
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图 1 黄唇鱼主要发出的6类声音
a. 类鼓声；b. 嗡嗡声；c. 咔嚓声；d. 嗒嗒声；e. 雀鸣声；f. 嚓咕声
Figure 1. Six kinds of sounds made mainly by B. taipingensis
a. drum sound; b. humming sound; c. cracking sound; d. clacking sound; e. bird sound; f. cha goo sound
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图 2 单脉冲 (a)、双脉冲 (b) 和三脉冲 (c) 类鼓声
Figure 2. Single pulse (a), double-pluse drum sound (b) and three-pluse (c) drum sound
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图 3 总发声和类鼓声昼夜分布
Figure 3. Day and night signal distribution of total sound and drum sound
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图 7 语谱图和频谱图
a1~a2. 类鼓声语谱图和声频谱图; b1~b2. 嗡嗡声语谱图和频谱图; c1~c2. 咔嚓声语谱图和频谱图; d1~d2. 嗒嗒声语谱图和频谱图; e1~e2. 雀鸣声语谱图和频谱图; f1~f2. 嚓咕声语谱图和频谱图
Figure 7. Spectrogram and spectrum map
a1−a2. spectrogram and spectrum map of drum sound; b1−b2. spectrogram and spectrum map of humming sound; c1−c2. spectrogram and spectrum map of cracking sound; d1−d2. spectrogram and spectrum map of clacking sound; e1−e2. spectrogram and spectrum map of bird sound; f1−f2. spectrogram and spectrum map of cha goo sound
表 1 各类别发声次数
Table 1 Number of different sound types
监听区
monitored area时间 (月-日)
time (month-date)总发声数
total number of sounds
平均发声密度/次·h–1
mean sound density类鼓声
drum sound咔嚓声
cracking sound雀鸣声
birds sound嗡嗡声
humming sound嗒嗒声
clacking sound嚓咕声
cha goo sound其他声
other sound1#池
Pool 103-28—04-04 7
0.0400 0 0 6 0 0 1 04-21—04-28 10
0.0587 3 0 0 0 0 0 2#池
Pool 204-05—04-12 19
0.1115 6 1 0 5 0 2 05-22—05-29 63
0.36450 5 0 2 0 0 6 水族箱aquarium 05-02—05-04 24
0.52221 0 0 0 0 0 3 05-10—05-17 123
0.71292 3 1 0 0 1 26 合计 total 246 175 17 2 8 5 1 38 
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表 2 类鼓声时域特征统计
Table 2 Pulse width and pulse interval of drum sound
脉冲类型
number of pulse时长/ms
duration time脉冲宽度
pulse width脉冲间隔
pulse interval单脉冲 single pulse drum sound 67~733 243 67~733 243 − 双脉冲 double-pulse drum sound 100~1 333 370 35~350 113 0~1 130 143 三脉冲 three-pulse drum sound 333~1 268 655 47~333 100 0~834 179 总平均值 overall mean 279 70 183
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表 3 部分鱼类声信号谱峰中心频率
Table 3 Spectral frequency peak of sound signal of servaral fishes
种类
species谱峰中心频率/Hz
spectral frequency peak文献来源
Reference黄唇鱼 Bahaba taipingensis 类鼓声50~140；嗒嗒声180~190；嗡嗡声40~140；咔嚓声3 200~3 600；
雀鸣声400~500、2 000~2 500；嚓咕声50~150本研究 大黄鱼 Larimichthys crocea 630~800 [7,23,28] 梅童鱼 Collichthys lucidus 1 000 [8] 黄姑鱼 Nibea albiflora 650±20.12 [23] 尖头黄姑鱼 Nibea acuta 630±15.57 [23] 白姑鱼 Argyrosomus argentatus 400 [29] 叫姑鱼 Johnius belengeri 2 000 [29] 拟石首鱼 Sciaenops ocellatus 139 [30] 金尾贝氏石首鱼 Bairdiella chrysoura 1 046 [30] 狗䱛 Cynoscion regails 347 [30] 云斑狗䱛 Cynoscion nebulosus 300 [30] 红牙䱛 Otolithes ruber 632±10.06 [23] 褐菖鲉 Sebasticus marmoratus 83~174 [25] 金眼鲷 Beryx splendens Lowe 337±8.50 [23] 带鱼 Trichiurus haumela 628±11.40 [23] 白鱼 Salangichthysm icrodon Bleeker 536±10.39 [23] 刺鱼 Gasterosteus aculeatus Linnaeus 420±0 [23] 大斑石鲈 Pomadasysmaculatus 415±9.40 [23] 粗纹鲾鱼 Leiognathus lineolatus 757±24.70 [23] 黑鳍叶鲹 Atule malam 542±16.90 [23] 游鳍叶鲹 Atule mate Cuvier et Va lenciennes 528±9.67 [23] 白舌尾甲鲹 Uraspis helvola 534±17.92 [23] 海鲶 Arius sp. 735±12.39 [23] 东方豹鲂鮄鱼 Dactyloptena orientalis 348±0 [23] 鳓鱼 Ilisha elongata 251±18.41 [23] 白腹豆娘鱼 Abudefduf luridus 356 [31] 鼬鳚 Ophidion marginatum 1 200 [32] 红棘胸鲷 Gadidae mediterraneus 180 [33]
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