篮子鱼科隶属鲈形目、刺尾鱼亚目，该科鱼类肉质细嫩，味道鲜美，体内富含ω-3不饱和脂肪酸，是重要的经济型鱼类。篮子鱼科鱼类主要分布于印度洋和太平洋热带、亚热带海域及地中海东部，全球共有篮子鱼科1属28种^[1]，中国海域有16种^[2]。目前，对篮子鱼科鱼类的种类鉴定主要依据其形态学特征^[3-4]，但篮子鱼科部分鱼类形态特征极为相似，如褐篮子鱼(Siganus fuscescens)和长鳍篮子鱼(S. canaliculatus)；多数种类在离水、休息、死亡或受惊时，其体表颜色及斑纹会发生变化；部分种类形态特征(如尾鳍)也会随着年龄的增长而改变，这对基于形态特征的篮子鱼科鱼类的分类鉴定造成了极大的困难。

分子技术的发展使利用DNA条形码进行生物学分类成为可能，此方法可以有效克服传统形态学分类存在的缺陷，是生物分类学研究中的新方法和研究热点^[5]。DNA条形码是生物共有的、种间差异明显的一段DNA序列^[6-7]，其长度较短、易于扩增、变异率适度、种间遗传距离明显大于种内遗传距离，为物种鉴定提供了一种新方法^[8]。线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的进化速度快且容易被扩增，所积累的遗传变异足以区分近缘种，所以被选定为动物界物种鉴定的标准基因^[9]。目前，基于COⅠ基因的DNA条形码技术已广泛用于生物物种的鉴定研究^[10-17]。但DNA条形码应用于篮子鱼科鱼类的鉴别尚未见报道。因此，本研究通过采集篮子鱼科鱼类样本，获取样本COⅠ基因序列，利用DNA条形码技术对样品进行种类鉴定，结合从BOLD及GenBank上筛选的蓝子鱼COⅠ基因序列，探究其在篮子鱼科鱼类种类鉴定中的适用性。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

本研究的篮子鱼科鱼类样品采集于海南沿海地区，参考《台湾鱼类图鉴》^[18]进行形态学分类鉴定。篮子鱼样品共46尾，初步判定隶属于10个种。对每个样品拍照记录，取其背部肌肉用乙醇保存。

1.2   分子生物学鉴定

利用软体动物DNA提取试剂盒(HiPure Mollusc DNA Kit)提取DNA，–20 ℃保存备用。PCR扩增采用DNA条形码通用引物，引物序列为F：TCRACYAAYCAYAAAGAYATYGGCAC；R：ACTTCWGGGTGRCCRAAGAATCA，由北京睿博兴科生物技术有限公司进行引物合成。

PCR反应总体积为25 μL，反应体系为：ddH₂O 16.7 μL、10×Buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、MgCl₂ 1.5 μL、正反向引物各0.5 μL、r-Taq 0.3 μL、模板DNA 1 μL。反应程序为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，70 ℃ 40 s，30个循环；72 ℃ 10 min。

1.5%琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物检测，检测结果为单一亮带的PCR产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司进行双向测序。

1.3   公共序列信息下载与筛选

从BOLD和GenBank下载篮子鱼科鱼类COⅠ基因序列，通过序列分析进行准确性验证。最终筛选出12种篮子鱼科COⅠ基因序列27条。将本研究获得的46条篮子鱼科COⅠ基因序列与下载序列合并，共计获得73条篮子鱼科鱼类的DNA条形码序列，隶属于19个种，相关信息见表1。

表  1  本研究篮子鱼科19种鱼类COⅠ基本信息

Table  1.  Information of COⅠ genes from 19 Siganidae species

序号 No.	物种 species	拉丁名 Latin name	样品数目 number of samples	Genbank序列号 GenBank accession No.
Gp1	银篮子鱼	Siganus argenteus	2	JQ350365, JQ350364
Gp2	长鳍篮子鱼	Siganus canaliculatus	12	MH469588~MH469599
Gp3	凹吻篮子鱼	Siganus corallinus	2	KP194212, KP194871
Gp4	大瓮篮子鱼	Siganus doliatus	3	KP194691, KF930440, RESIC044-11
Gp5	褐篮子鱼	Siganus fuscescens	3	KY372164, MH469600, MH469601
Gp6	星斑篮子鱼	Siganus guttatus	6	MH469574~MH469579
Gp7	爪哇篮子鱼	Siganus javus	2	KU692888, EU752210
Gp8	截尾篮子鱼	Siganus luridus	3	BIM342-13, BIM364-13, MF409629
Gp9	眼带篮子鱼	Siganus puellus	3	FJ584108, MH469572, MH469573
Gp10	暗体篮子鱼	Siganus punctatissimus	1	KP194669
Gp11	斑篮子鱼	Siganus punctatus	2	MH469570, MH469571
Gp12	金带篮子鱼	Siganus rivulatus	3	KM538561, KM538560, BIM363-13
Gp13	刺篮子鱼	Siganus spinus	5	KJ968266, KP193962, KF930443, MH469602, MH469603
Gp14	白点篮子鱼	Siganus sutor	3	MF409513, MF409582, MF409508
Gp15	单斑篮子鱼	Siganus unimaculatus	3	MH469558, MH469560, MH469561
Gp16	蓝带篮子鱼	Siganus virgatus	8	MH469580~MH469587
Gp17	狐篮子鱼	Siganus vulpinus	5	MH469562~MH469565, MH469557
Gp18	蠕纹篮子鱼	Siganus vermiculatus	3	KF715016.1, KF715017.1, KF715018.1
Gp19	大篮子鱼	Siganus magnificus	4	MH469566~MH469569
注：本研究基因序列为MH469557~MH469558、MH469560~MH469603 　Note: The GenBank accession No. are MH469557−MH469558 and MH469560−MH469603 in this study.

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1.4   数据处理

使用SSRHunter 1.3软件对序列进行编辑，利用Clustal X (1.83)对所有序列进行序列比对，去除两端冗余序列。处理后的序列利用MEGA 7.0分析核苷酸组成、变异位点数以及密码子组成等，基于Kimura 2 parameter model (K₂P)计算种间及种内遗传距离，采用邻接法(neighbor-joining，NJ)构建分子系统进化树^[16]，经1 000次重复抽样检测其置信度。

2.   结果

2.1   COⅠ基因片段序列特征

经Clustal X序列比对，保留共有序列574 bp。对篮子鱼科73条COⅠ基因共有序列进行合并分析。结果显示，19种篮子鱼的COⅠ基因序列平均碱基组成为T：28.9%、C：28.7%、A：24.6%、G：17.8%。其中G+C的含量(46.5%)低于A+T的含量(53.5%)，碱基组成表现出明显的偏倚性。分析所得的各密码子碱基含量特征为：第1密码子GC含量最低、变化范围最大，平均为40.8% (36.5%~46.9%)；第2密码子GC含量最高，平均为55.7% (53.4%~57.1%)；第3密码子GC含量最为稳定，平均为42.9%。所分析的核苷酸位点中保守位点有526个，变异位点有49个。变异位点中转换位点35个，颠换位点12个，其中94.4%的转换和100%的颠换发生在第1密码子，相应的其GC含量变化范围最大。第3密码子没有发生转换和颠换，GC含量最为稳定。

2.2   种间及种内遗传距离

依据K₂P模型计算19种篮子鱼科鱼类的遗传距离。结果显示，19种鱼类的种内遗传距离为0.000~0.006，平均为0.002，均低于Hebert等^[6]提出的物种界阈值 (2%)；种间遗传距离为0.002~0.163，平均为0.098。种间遗传距离为种内遗传距离的49倍，符合DNA条形码种间遗传距离需为种内遗传距离10倍以上的要求(“10×”标准 )。但是篮子鱼科鱼类中有部分物种的种间遗传距离为种内遗传距离的0.67~5.00倍(表2)，小于“10×”标准，其分类地位需进一步探究。

表  2  种间/种内遗传距离小于“10×”的物种对

Table  2.  Species of interspecific/intraspecific distance ratio less than “10×”

物种1 (种内遗传距离) Species 1 (intraspecific distance)	物种2 (种内遗传距离) Species 2 (intraspecific distance)	种间距离 interspecific distance	种间/种内遗传距离比 intraspecific/intraspecific distance
凹吻篮子鱼 S. corallinus (0.000)	大瓮篮子鱼 S. doliatus (0.004)	0.016	4.00
大瓮篮子鱼 S. doliatus (0.004)	蓝带篮子鱼 S. virgatus (0.001)	0.008	2.00
单斑篮子鱼 S. unimaculatus (0.002)	狐篮子鱼 S. vulpinus (0.003)	0.002	0.67
单斑篮子鱼 S. unimaculatus (0.002)	大篮子鱼 S. magnificus (0.000)	0.010	5.00
狐篮子鱼 S. vulpinus (0.003)	大篮子鱼 S. magnificus (0.000)	0.010	3.33

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2.3   分子系统进化树

本研究以羽鳃鲐(Rastrelliger kanagurta)作为外群，采用NJ法对篮子鱼科19种鱼类73条COⅠ条形码序列构建系统进化树。分子系统进化树显示，除单斑篮子鱼(S. unimaculatus)与狐篮子鱼(S. vulpinus)聚类为1个分支外，其他17种(89.5%)的相同种内个体各自聚在一起，形成了17个独立分支，具有较高的支持度，不同物种皆可得到有效区分(图1)。

图  1  NJ 法构建的篮子鱼科鱼类系统进化树

节点上数字显示1 000次重复的bootstrap验证分析中大于50%的支持率；标尺代表遗传距离单位为0.02·百万年^–1

Figure  1.  NJ tree resulting from analysis of COⅠ gene for 19 Siganidae species

Values higher than 50% bootstrap in 1 000 replications are shown on branches. The scale represents the genetic distance of 0.02 per million years.

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3.   讨论

随着DNA的进化，基因的碱基会发生相应的转换和颠换。转换是同类碱基的置换，颠换是不同类碱基的置换，基因转换在基因的致同进化和降低突变率等方面具有重要作用。基因转换的位点一般为DNA损伤位点，DNA损伤位点越多，转换发生的概率越大^[19]。通常情况下，转换的概率大于颠换的概率，两者的比值R可以反映出物种的进化速率，R值越小，进化速度越快^[20]。本研究对19种篮子鱼73条COⅠ基因序列进行分析。结果显示，第2密码子拥有2个转换位点，无颠换发生；第3密码子无转换与颠换发生，因此导致第1密码子的R值虽然最大但其进化速度最快。密码子的变异受GC含量的影响，第1 密码子中GC含量变化范围最大 (36.46%~46.88%)，故其碱基变异位点数最多(47个)；第3密码子中GC含量最为稳定(42.93%)，因此，在第3密码子中没有转换和颠换的发生。这与石首科鱼类COⅠ基因序列的特征一致^[5]。19种篮子鱼科鱼类COⅠ基因的碱基组成特征与已报道的其他硬骨鱼纲鱼类的结果不同，为GC含量小于AT含量^[21-22]。

本研究中篮子鱼科鱼类的种间遗传距离(0.098)为种内遗传距离(0.002)的49倍，符合Hebert和Ratnasingham^[6]提出种内最大遗传距离为0.02且种间遗传距离至少是种内遗传距离的10倍的要求。在构建的系统进化树中，17种(89.5%)篮子鱼各自形成了独立的分支，并具有较高的支持度。表明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可应用于篮子鱼科鱼类的物种鉴定。

长鳍篮子鱼又称黄斑篮子鱼，是中国重要的捕捞和养殖鱼类^[23-24]。其形态特征与褐篮子鱼非常相似(图2)，且在外界环境变化时，其外部特征也会发生很大变化，导致利用形态学特征对长鳍篮子鱼和褐篮子鱼进行准确鉴定十分困难。本研究中长鳍篮子鱼与褐篮子鱼种内遗传距离分别为0.001和0.000，种间遗传距离为0.067，种间遗传距离与种内遗传距离的比值为106，系统进化树中长鳍篮子鱼与褐篮子鱼的相同种内个体各自聚为独立分支。表明基于COⅠ基因的DNA条形码技术可以用于长鳍篮子鱼与褐篮子鱼的准确鉴定。

图  2  长鳍篮子鱼 (全长179 mm) (a) 和褐篮子鱼 (全长267 mm) (b)

Figure  2.  S. canaliculatus (total length=179 mm) (a) and S. fuscessens (total length=267 mm) (b)

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本研究中单斑篮子鱼与狐篮子鱼在系统进化树中未能形成独立分支，在遗传距离分析中，单斑篮子鱼和狐篮子鱼的种间与种内遗传距离的比值为0.67，远未达到Hebert提出的“10×”标准。比较两种篮子鱼的形态特征，发现两者在形态上的唯一区别为背鳍基部是否有一大型黑斑(图3)。Gawel和Woodland^[25]对27个样品进行形态学鉴定，同样发现单斑篮子鱼与狐篮子鱼形态学上唯一的差别为背鳍基部的黑斑。单斑篮子鱼和狐篮子鱼系统进化树位置与其形态学分类地位不一致的原因可能为：1)两物种可能为同一物种，因外界环境(如水体营养、所食饵料等)或内在环境(如性别、年龄等)有所差异而导致形态上出现差异。生物个体的生理因素(包括年龄、性别等)、背景基因型以及外界环境条件(如光照、温度、营养)等都会影响某些等位基因的显隐性关系，从而影响其表型^[26]。2)两者为近期辐射进化形成，亲缘关系较近，而COⅠ条形码序列所包含的遗传变异信息有限，无法找到足够的碱基变异以区分^[6]。Shearer和Coffroth^[27]对30个加勒比海珊瑚礁物种的研究发现，近期形成的物种由于种间分化不足，导致种间与种内遗传距离相差不大，致使COⅠ条形码难以鉴定。因此，针对单斑篮子鱼与狐篮子鱼，在后续研究中可利用线粒体全基因组或核基因等信息开展进一步分类研究。

图  3  单斑篮子鱼 (全长162 mm) (a) 和狐篮子鱼 (全长121 mm) (b)

Figure  3.  S. unimaculatus (total length=162 mm) (a) and S. vulpinus (total length=121 mm) (b)

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本研究获得的篮子鱼科鱼类基因特征与鲈形目石首科鱼类的基因特征相同，与其他已报道的硬骨鱼纲鱼类形成了显著差异，推测该特征为鲈形目鱼类所特有，还有待进一步研究。另外，本研究中部分条形码序列来源于BOLD和GenBank数据库，其序列测定和提交受人为因素影响较大，准确性难以确定。因此，在今后的研究中需扩大采样的地理范围，增加篮子鱼科鱼类种类及数量，对所获样品进行详细的形态学测量，对其水体进行采集，分析其中营养成分，并对样品的性别及性腺发育做出判断，再结合线粒体基因组^[28-29]、核基因序列^[30-31]等信息研究是否存在生殖或遗传隔离，明确它们的遗传背景，从而进行准确的分析和鉴定，以更好地明确篮子鱼科不同物种的分类地位。