Sequencing and bioinformatic analysis for transcriptome of Micropterus salmoides based on RNA-seq
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摘要:
文章以大口黑鲈(Micropterus salmoides)组织作为研究对象，利用RNA-seq技术进行转录本测序和数据分析，经拼接组装，最终获得35 659条unigenes，序列平均长度738 bp，序列长度中位数 (N50)为1 052 bp。另外从长度分布与GC含量等方面对unigenes进行评估，数据显示测序质量好、可信度高。使用6大数据库 (KOG、Nr、Pfam、Swiss-Prot、GO和KEGG) 注释大口黑鲈转录组unigenes，分别对应有15 832、21 279、14 524、16 973、15 024和11 185条unigenes获得注释。其中，5 617条unigenes在以上所有数据库中同时注释成功，17 253条unigenes至少被一个数据库注释。KEGG分析结果显示，获得注释的11 185条unigenes被划分到267个代谢通路中，参与信号转导通路的unigenes数量最多，共有1 349条(12.06%)。另外还检测到4 030个微卫星 (SSR)位点。通过对大口黑鲈转录组测序，获得了大量的转录组信息，为大口黑鲈的功能基因克隆、基因组学、遗传多样性分析、分子标记开发及遗传改良等研究奠定了基础。
Abstract:The transcripts of Micropterus salmoides were obtained by RNA-seq technology to conduct a transcriptomic analysis. A total of 35 659 unigenes were generated by de novo assembly with an average length of 738 bp and N50 of 1 052 bp. The unigenes were assessed for length distribution and GC content. The sequencing data were of high quality and reliability. A total of 15 832, 21 279, 14 524, 16 973, 15 024 and 11 185 unigenes were annotated from the KOG, Nr, Pfam, Swiss-Prot, GO and KEGG databases, respectively, among which 5 617 were annotated in all the databases and 17 253 were annotated in at least one database. Blasted with KEGG pathway, 11 185 unigenes were annotated, belonging to 267 categories. Of all the pathways, the number of unigenes joining in the signal transduction was the most (1 349, 12.06%). Finally, 4 030 SSRs were identified. The results provide rich data to understand transcriptome information of M. salmoides and lay the foundation for further research on functional gene cloning, genomics, genetic diversity analysis, molecular marker exploitation and genetic improvement in M. salmoides.
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Keywords:
- Micropterus salmoides /
- transcriptome /
- unigenes /
- gene annotation
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池塘循环水槽养殖模式(in-pond raceway system，IPRS)是一种新兴的养殖模式，在池塘内一侧建设占总池塘面积1%~3%的流水槽，配备推水增氧设备和吸污设备为水槽内鱼类提供富氧流水环境，并对养殖尾水进行处理，具有高产、高效和环保等特点[1]。目前，IPRS已在包括斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)、草鱼(Ctenopharyngodon idellu)和大口黑鲈(Micropterus salmoides)等多个品种上进行了养殖试验[2-5]，均取得较好的结果。由于IPRS建设成本较高，养殖过程中还需要较高的电力成本，如何实现养殖模式高效利用，达到整体盈利是该模式成功推广的关键。
为实现IPRS的高效利用，必须提高流水槽的养殖产量。Masser和Lazur[6]通过控制流水槽和外池塘水体交换率来提高流水槽的载鱼量。Brown等[7]利用IPRS将斑点叉尾鮰和长鳍叉尾鮰 (I. funcatus)进行混养，提高养殖产量，降低养殖成本。在占据池塘总面积97%的区域套养其他品种，提高IPRS整体效益。倪建忠等[8]将IPRS与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)养殖池塘相互结合，利用养蟹池塘中的水草净化养鱼尾水，水草生长又为其提供隐蔽场所。陈凡等[9]利用IPRS外池塘进行凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)的养殖，取得每公顷189 030元的经济效益。
此前本课题组进行了一年一造吉富罗非鱼IPRS养殖研究，但8—9月高温季节爆发了链球菌病，导致罗非鱼成活率偏低；而且养殖期短，池塘和IPRS空置时间较长，严重影响了养殖效益[10]。鉴于此，本研究开展IPRS养殖吉富罗非鱼一年两造养殖。4月投放大规格越冬鱼种开展第一造养殖，8月中旬收获；8月下旬投放大规格鱼种开展第二造养殖，11月底收获，规避8—9月爆发链球菌病的风险，延长池塘养殖周期；同时通过外池塘套养罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)、鲢(Hypophthalmichthys molitrix)和鳙(Aristichthys nobilis)等措施，达到高产、高效，为罗非鱼池塘循环水槽养殖模式推广提供参考。
1. 材料与方法
1.1 池塘循环水槽养殖系统
IPRS位于1口面积为1.28 hm2的池塘内，主体采用砖混结构，规格为25.0 m×15.8 m×2.0 m，由3条独立水槽组成，每条水槽的规格为22.0 m×5.0 m×2.0 m，本研究使用1#和2#水槽。集污槽在流水槽后部，规格为15.0 m×3.0 m×2.0 m。池塘靠近水槽的一侧建有1个沉淀池，规格为4.0 m×2.0 m×1.5 m，连接1条100 m长的过滤水渠，过滤水渠中铺设麦饭石、海粗沙和活性炭。在流水槽前侧设置水生植物 (水葫芦)净化区，规格为50.0 m×20.0 m。在水槽后侧设置水生植物吸收转化区，面积为240 m2，由30个生物浮床组成，每个浮床的规格为4.0 m×2.0 m，种植空心菜。IPRS配套设备主要包括3套气提式推水增氧系统，1套底层增氧系统，1套吸污系统，4台叶轮式增氧机、1台涌浪式增氧机和备用发电机，图1为系统整体示意图。
1.2 传统池塘养殖模式
以传统池塘养殖模式为对照组。对照组为静水池塘，日常能进行少量换水，与IPRS位于同一养殖基地，池塘面积0.47 hm2，平均水深1.8 m，养殖用水与IPRS来源相同，池塘水面设置两台叶轮式增氧机。
1.3 苗种放养
本研究使用的吉富罗非鱼(GIFT, Oreochromis niloticus)来自国家级广西南宁罗非鱼良种场，罗氏沼虾来自国家级广西南宁罗氏沼虾良种场，鲢、鳙从当地购买。对照组于2018年4月17日放养吉富罗非鱼鱼种，放养鱼种19 830尾，放养密度为5尾·m−2。IPRS于2018年4月17日放养第一造罗非鱼鱼种，5月中上旬在外池塘放养鲢、鳙和罗氏沼虾，同年8月23日放养第二造罗非鱼鱼种，详细放养情况见表1。
表 1 IPRS苗种放养Table 1. Fingerlings allocation in IPRS项目
item面积/m2
area种类
species规格/g
size时间
time密度/(尾·m−2)
density数量/尾
quantity/ind.1#水槽 1# Raceway 110 罗非鱼 36.6±2.8 2018-04-17 183.00 20 220 2#水槽 2# Raceway 110 罗非鱼 36.6±2.8 2018-04-17 274.00 30 090 外池塘 outer pond 12 405 鲢 758.0±85.2 2018-05-10 0.08 1 000 鳙 500.0±36.7 2018-05-10 0.03 400 罗氏沼虾 1.00±0.09 2018-05-06 23.44 300 000 1#水槽 1# Raceway 110 罗非鱼 185.2±15.8 2018-08-23 154.00 16 890 2#水槽 2# Raceway 110 罗非鱼 185.2±15.8 2018-08-23 215.00 23 660 1.4 养殖管理
每天投喂两次，投喂质量为鱼体总质量的3%~8%，上午(7:00—9:00)投喂日粮的40%，下午(16:00—18:00)投喂60%，具体情况根据天气、水温和鱼类活动情况等及时调整。IPRS在投喂饵料时，适当控制投饵速度，保证饵料不漂出流水槽，外池塘罗氏沼虾和鲢、鳙在养殖期间不投饵。
IPRS在实验期间不换水，适时添补因蒸发、渗漏损失的水。投喂饲料3 h后开启吸污装置，吸污持续时间15~20 min，抽提出的尾水排放到池塘边的沉淀池，再经过过滤水渠过滤后流回池塘，沉淀物用作农作物肥料。传统池塘养殖模式定期换水，并根据水色、透明度的情况适时使用生物制剂调节水质。
每天定时巡塘，观察鱼类的活动并检查设备是否正常运行等。IPRS根据流水槽内罗非鱼的规格及载鱼量等情况，适时调整气提式推水增氧机阀门，控制流水槽内水流速度；根据溶氧情况，适时开启辅助增氧装置，定期清理水生植物净化区内的水葫芦。在6—10月空心菜生长旺季，每15~20 d收割1次。
1.5 样本采集和测定
实验开始后，每月17号测试2种养殖模式池塘的水质，上午10时采集水样。IPRS在池塘四角和1#、2#水槽中部设置采样点，对照组在池塘四角和进出水口设置采样点，每月17日测定透明度、温度和溶解氧(DO)。采集水面下50 cm处水样2 L，混合后，按照《水和废水监测分析方法》[11]，分别测定酸碱度(pH)、氨氮(NH4 +-N)和亚硝酸盐氮(NO2 −-N)，根据同一测定时间IPRS池塘氨氮和亚硝酸盐浓度相对对照组浓度减少的百分比，计算IPRS养殖模式下对氨氮和亚硝酸盐去除率。养殖结束后统计两条水槽和外池塘养殖产量和养殖效益，计算绝对生长率(absolute growth rate，RAG)、饲料系数(feed coefficient rate，RFC)和成活率(survival rate，RS)。
$$ R_{\rm AG}=({W_2}-{W_1})/{t} $$ $$ R_{\rm FC} = F/({W_2} - {W_1}) $$ $$ R_{\rm S} = {N_2}/{N_1}\times 100{\text{%}} $$ 式中W1为鱼的初始平均质量(g)；W2为鱼的终末平均质量(g)；t为饲养天数(d)；F为每尾鱼的平均总摄食量(g)；N1为初始鱼尾数；N2为终末鱼尾数。
1.6 数据统计
数据结果用“平均值±标准差(
$\overline X \pm {\rm{SD}} $ )”表示。2. 结果
2.1 养殖结果
2.1.1 2种养殖模式结果对比
IPRS第一造养殖122 d，2018年8月17日起捕上市；第二造养殖100 d，2018年11月30日起捕上市；对照组池塘养殖187 d，2018年10月21日起捕上市，吉富罗非鱼养殖结果见表2。结果显示，利用IPRS养殖吉富罗非鱼，在生长速度、饵料利用和养殖产量方面均优于对照组池塘。IPRS外池塘罗氏沼虾平均规格为(25.0±6.85) g，成活率为26.8%，产量为2 012 kg；鲢平均规格为(1 812.5±268.12) g，成活率为98.7%，产量为1 789 kg；鳙平均规格为(2 058.5±328.57) g，成活率为97.4%，产量为801 kg。IPRS中流水槽内养殖吉富罗非鱼，外池塘套养罗氏沼虾等品种，充分利用池塘水体；两造养殖期为222 d，高于对照组187 d，池塘使用时间延长，池塘使用效率明显提高。
表 2 2种养殖模式养殖结果Table 2. Farming results of two farming models项目
item起捕均质量/g
average mass成活率/%
survival rate绝对生长率/(g·d－ 1)
absolute growth rate饲料系数
feed coefficient rate收获总量/kg
total harvest单位产量/(kg·hm－ 2)
specific yieldIPRS第一造
IPRS first production574.73±74.75 83.38 4.48 1.12 24 107 28 261 IPRS第二造
IPRS second production680.69±88.49 93.35 4.96 1.17 25 730 30 164 传统池塘养殖模式
traditional pond aquaculture630.5±95.25 92.28 3.17 1.32 11 529 24 530 2.1.2 各水槽养殖结果
IPRS中将全池塘吉富罗非鱼集中到流水槽，单位养殖密度远高于对照组，第一造2#流水槽成活率和绝对生长率较低，推测是放养密度过高，环境胁迫强度高，导致其成活率偏低(表3)。养殖过程中无疾病暴发，两造吉富罗非鱼成活率均高于80%。结果显示，利用IPRS进行吉富罗非鱼一年两造养殖，能避开8—9月疾病高发期，成活率、单位产量与此前实验50%成活率、72.4 kg·m−2单位产量相比明显提高[6]；第二造养殖在起捕均质量、成活率、日增量、收获总量和单位产量方面均优于第一造养殖。
表 3 各流水槽养殖结果Table 3. Farming results of IPRS项目
item流水槽编号
runway No.起捕均质量/g
average mass成活率/%
SR绝对生长率/(g·d－ 1)
AGR饲料转化率
FCR收获总量/kg
TH单位产量/
(kg·m－ 2)
SY第一造
first production1# 635.7±86.60 87.98 4.99 1.17 11 296 102.7 2# 529.9±70.63 80.35 4.11 1.09 12 811 116.5 第二造
second production1# 695.3±94.42 94.25 5.10 1.19 11 065 100.6 2# 670.2±91.88 92.71 4.85 1.16 14 665 133.3 2.2 经济效益
2.2.1 养殖投入
罗非鱼养殖成本主要包括苗种、塘租、饲料、电费、药品、人工和其他(捕捞、调水等)。对照组池塘养殖模式每公顷养殖成本为199 862元，其中饲料成本(74.52%)占比最高，其次为塘租(8.91%)成本。IPRS第一造养殖每公顷成本为213 942元，其中饲料成本(66.03%)占比最高，其次为苗种(9.97%)成本(表4)。IPRS第二造养殖每公顷成本为229 092元，饲料成本(52.48%)占比最高，其次为苗种(27.73%)成本，由于第二造养殖鱼种规格相对较大，苗种投入明显高于第一造。IPRS外池塘套养品种不投喂饲料，养殖成本仅为苗种成本和捕捞成本。结果显示，IPRS养殖吉富罗非鱼相较于传统池塘养殖模式，养殖成本较高。在养殖成本构成中，IPRS固定成本(塘租和人工)占比降低，可变成本占比升高。
表 4 养殖成本构成Table 4. Cost structure of tilapia farming项目
item传统池塘养殖模式
traditional pond aquacultureIPRS 第一造
IPRS first productionIPRS 第二造
IPRS second productionIPRS 外池塘
IPRS rest pond金额/元
sum of money/Yuan占比/%
percentage金额/元
sum of money/Yuan占比/%
percentage金额/元
sum of money/Yuan占比/%
percentage金额/元
sum of money/Yuan占比/%
percentage苗种 fingerling 15 262 7.64 21 323 9.97 63 533 27.73 8 750 91.80 塘租 pond rent 17 811 8.91 8 906 4.16 8 906 3.89 − − 饲料 feed 148 938 74.52 141 265 66.03 120 221 52.48 − − 电费 electricity cost 3 000 1.50 14 909 6.97 10 650 4.65 − − 药品 fishery medicine 1 800 0.90 8 789 4.11 7 031 3.07 − − 人工 labor cost 6 751 3.38 14 063 6.57 14 063 6.14 − − 其他 other cost 6 300 3.15 4 688 2.19 4 688 2.05 781 8.20 总计 total cost 199 862 100.00 213 942 100.00 229 092 100.00 9 531 100.00 2.2.2 养殖效益
养殖效益见表5。对照组池塘养殖模式养殖产量为11 529 kg，起捕时成鱼售价为9.6元·kg−1，共收入110 679元，利润为16 744元，投资回报率为17.83%。折合每公顷投入199 862元，产出235 487元，利润35 616元。IPRS第一造罗非鱼产量为24 107 kg，起捕时成鱼售价为9.6元·kg−1，共收入231 428元，利润为48 864元，投资回报率为26.77%；第二造罗非鱼产量为25 730 kg，起捕时成鱼售价为9.0元·kg−1，共收入231 570元，利润为36 078元，投资回报率为18.45%；外池塘套养品种中，鲢产出14 901元，鳙产出6 209元，罗氏沼虾产出120 720元。利用IPRS进行罗非鱼一年两造养殖，外池塘套养鲢、鳙和罗氏沼虾，每条流水槽平均投入193 095元，产出279 509元，利润86 414元，折合每公顷投入452 566元，产出655 099元，利润为202 533元，投资回报率44.75%。结果显示，IPRS通过在流水槽内养殖吉富罗非鱼，外池塘套养其他养殖品种，提高池塘整体使用效率，养殖效益与传统养殖模式相比明显提升。
表 5 养殖效益Table 5. Farming profit analysis项目
item品种
speicies产量/kg
yield价格/(元·kg−1)
price投入/元
input cost/Yuan产出/kg
output利润/元
profit/Yuan回报率/%
return rate传统池塘养殖模式
traditional pond aquaculture吉富罗非鱼 11 529 9.6 93 935 110 679 16 744 17.83 IPRS 第一造
IPRS first production吉富罗非鱼 24 107 9.6 182 564 231 428 48 864 26.77 IPRS 第二造
IPRS second production吉富罗非鱼 25 730 9.0 195 492 231 570 36 078 18.45 IPRS 外池塘
IPRS rest pond鲢 1 789 9.0 1 533 16 101 14 568 950.29 鳙 801 9.0 1 333 7 209 5 876 440.81 罗氏沼虾 2 012 60.0 9 333 120 720 111 387 1 193.45 2.3 水质参数
2.3.1 pH、溶解氧、透明度和温度变化
部分水质参数见表6。IPRS在池塘四角设置叶轮增氧设备，流水槽内推水增氧设备24 h运行，全池塘水体一直处于循环状态，水槽内外水质无差异。利用IPRS进行罗非鱼一年两造养殖，在整个养殖周期内，水温介于24.6~32.6 ℃，溶解氧介于4.34~8.05 mg·L−1，pH介于7.4~7.8；对照组池塘养殖模式在整个养殖周期内，水温介于26.8~32.9 ℃，溶解氧介于3.53~7.79 mg·L−1，pH介于7.5~7.7，均符合渔业水质标准(GB 11607—89)。结果显示，IPRS中池塘水温略低于传统池塘养殖模式，透明度介于47~49 cm，对照组池塘透明度随着实验进行，透明度逐渐降低。
表 6 实验期间pH、溶解氧、透明度和温度变化Table 6. Change of water quality during test项目
item取样时间/月-日
sampling time/Mon-Dat酸碱度
pHρ (溶解氧)/(mg·L−1)
DO透明度/cm
transparency温度/℃
temperature传统池塘养殖模式
traditional pond aquaculture4-17 7.5 7.20 48 26.8 5-17 7.7 7.79 46 30.6 6-17 7.7 5.26 45 31.7 7-17 7.6 3.97 42 32.3 8-17 7.6 3.53 35 32.4 9-17 7.5 4.63 32 32.9 10-17 7.7 5.69 35 27.9 池塘循环水槽养殖模式
IPRS4-17 7.4 8.05 48 26.4 5-17 7.7 5.60 47 30.8 6-17 7.7 4.34 49 31.1 7-17 7.7 6.08 49 31.5 8-17 7.7 5.17 49 31.8 9-17 7.6 6.24 48 32.6 10-17 7.8 6.15 47 27.5 11-17 7.8 7.48 49 24.6 2.3.2 氨氮和亚硝酸盐变化
2种养殖模式池塘水体中氨氮和亚硝酸盐浓度见表7。本研究中对照组水体中的氨氮和亚硝酸盐不断累积，浓度随养殖时间呈现递增趋势。养殖结束时氨氮和亚硝酸盐质量浓度分别达到1.35 mg·L−1和0.164 mg·L−1。IPRS中配备有吸污装置，并在外池塘设置了水生植物浮床，水体中氨氮浓度呈现波动变化，亚硝酸盐浓度随养殖时间递增，氨氮质量浓度介于0.47~0.87 mg·L−1，在6月至10月间氨氮的去除率分别达到66.7%、29.9%、26.8%、44.9%和58.5%；亚硝酸盐浓度介于0.028~0.095 mg·L−1，在5月至10月间亚硝酸盐的去除率分别达到48.6%、15.6%、20.7%、22.4%、46.6%、67.1%和58.5%，均在罗非鱼的适宜范围之内。
表 7 氨氮和亚硝酸盐质量浓度变化Table 7. Change in ammonia nitrogen and nitrite concentration项目
item取样时间/月-日
sampling time/Mon-Dat池塘循环水槽养殖模式
IPRS传统池塘养殖模式
traditional pond aquaculture去除率/%
removal rateρ(氨氮)/(mg·L−1)
ammonia nitrogen4-17 0.47 0.37 − 5-17 0.57 0.56 −2.0 6-17 0.24 0.72 66.7 7-17 0.47 0.67 29.9 8-17 0.71 0.97 26.8 9-17 0.59 1.07 44.9 10-17 0.56 1.35 58.5 11-17 0.88 − − ρ(亚硝酸盐)/(mg·L−1)
nitrite concentration4-17 0.025 0.024 − 5-17 0.018 0.035 48.6 6-17 0.038 0.045 15.6 7-17 0.046 0.058 20.7 8-17 0.052 0.067 22.4 9-17 0.055 0.113 46.6 10-17 0.054 0.164 67.1 11-17 0.095 − − 3. 讨论
3.1 池塘循环水槽养殖模式提高了罗非鱼养殖效率
利用IPRS进行吉富罗非鱼一年两造养殖，能缩短养殖期，提高IPRS使用率，大幅提升养殖产量。IPRS配备推水增氧设备，运行时在流水槽内形成富氧流水环境，水流速度为0.04~0.07 m·s−1。在流水环境中，大多数鱼类具有溯流习性，合理的水流速度对鱼类的摄食、生长、和形态等产生积极影响[12-14]。养殖结果显示，流水槽内罗非鱼的平均生长速度分别达到4.48 g·d−1和4.96 g·d−1，远高于对照组的3.17 g·d−1；饲料系数为1.1～1.2，明显低于对照组(1.32)，这与宋宏等[15]的研究结果相似。IPRS能够提高罗非鱼生长速度，缩短养殖期。广西南宁地区罗非鱼的生长期为每年4月中旬至11月下旬，投放大规格鱼种(200 g·尾−1以上)可进行一年两造养殖，传统池塘养殖模式多采用当年培育罗非鱼鱼种，养殖期6~8个月，一年进行一造养殖[16]。本研究中对照组投放吉富罗非鱼鱼种规格为36.6 g·尾−1，养殖期为187 d。IPRS第一造投放规格为36 g·尾−1，养殖期为120 d。第二造投放规格为185.2 g·尾−1，养殖期为100 d。开展一年两造养殖，减少池塘的空置时间，提高了IPRS的使用率。袁媛等[17]调查广西地区池塘养殖罗非鱼的年平均产量为15 000~17 000 kg·hm−2，本研究采用大规格鱼种，对照组池塘养殖模式产量为24 530 kg·hm−2，高于广西地区平均值，但仍与IPRS有较大差距，利用IPRS一年两造养殖吉富罗非鱼产量为58 402 kg·hm−2，为传统池塘养殖的2~4倍。推水增氧设备控制流水槽与外池塘的水体交换，提高流水槽载鱼量，此次实验第一造放养密度为58 960尾·hm−2，第二造放养密度为47 500尾·hm−2，传统池塘养殖模式罗非鱼的放养密度一般为30 000~45 000尾·hm−2。目前关于吉富罗非鱼在IPRS中的适宜养殖密度研究尚未有报道，第一造2#流水槽放养密度相对较高，养殖效果较差，推测可能是鱼体受到拥挤环境胁迫，产生应激反应，生长速度减慢，死亡率升高[18]。
在外池塘套养其他养殖品种，提高池塘整体养殖效益。IPRS中养殖单元仅占池塘总面积的3%，剩余97%的其他水域用作净化养殖尾水。近年来，养殖人员为提高养殖效益，在外池塘套养其他养殖品种，如鲢、鳙、草鱼和螺蛳等，取得了一定的经济效益[19-21]。本研究在外池塘套养罗氏沼虾、鲢和鳙，日常管理中仅对流水槽内吉富罗非鱼投饵，罗氏沼虾、鲢和鳙以罗非鱼残饵、粪便以及外池塘水体中的浮游生物为食[22]。外池塘套养其他品种，提高了其净水能力，也增加了池塘整体的养殖效益。两造罗非鱼养殖结果较好，产值分别达到231 428元和231 570元，回报率分别为26.77%和18.45%。外池塘套养品种投入较少，仅需苗种和捕捞投入。在养殖效益方面，3种套养动物取得较好的养殖效益，其中罗氏沼虾由于市场价格高(60元·kg−1)，取得了120 720元的经济效益。外池塘套养品种提高IPRS整体的养殖效益，研究结果显示，利用IPRS进行罗非鱼一年两造养殖，每公顷投入452 566元，产出655 099元，利润为202 533元，投资回报率44.75%，与对照组池塘相比明显提高。在外池塘开展养殖作业能提高养殖效益，放养种类和密度过高时，会造成池塘生态系统满负荷运转，增加养殖风险[23]。
3.2 罗非鱼一年两造养殖降低了高温期病害风险
利用IPRS进行罗非鱼一年两造养殖，避开8—9月链球菌病高发期，降低养殖风险。近年来，罗非鱼链球菌病频发，给整个罗非鱼养殖产业造成巨大的经济损失[24-25]。链球菌病的发生与池塘水温和养殖密度有关，水温超过32 ℃发病概率显著增加[26]，养殖密度过高引起鱼类产生应激反应，增加罗非鱼链球菌病的感染概率[27]。一般而言，IPRS将全池塘罗非鱼集中到占据池塘总面积3%的流水槽中，单位养殖密度更高，在高温季节爆发链球菌病的风险更高。此前进行的罗非鱼一年一造的养殖研究中，6月下旬放养罗非鱼鱼种，8月上旬时爆发链球菌病，导致整个养殖期内罗非鱼存活率仅为50%左右[10]。本研究中利用IPRS进行一年两造养殖罗非鱼，养殖过程中无链球菌病暴发，两造养殖成活率均超过80%。养殖过程中池塘水温受气候影响难以控制，8—9月流水槽内平均水温均超过32 ℃，属于罗非鱼链球菌病高发季。卢迈新[28]认为减少鱼体应激是预防罗非鱼链球菌病的第一步；宋志飞等[29]研究发现，低养殖密度能减少俄罗斯鲟(Acipenser gueldenstaedti)幼鱼的应激效应，提高生长速度和成活率。本研究在8月中旬完成第一造养殖并起捕上市，8月下旬投放鱼种进行第二造养殖，流水槽中罗非鱼规格相对较小、养殖密度低，减少了罗非鱼的应激效应，降低了罗非鱼感染链球菌病的发病概率。对照组池塘中吉富罗非鱼在8—9月规格较大，且池塘水温超过32 ℃，为降低养殖风险，每天投饵量减半，导致生长速度减慢，养殖期延长。
3.3 池塘循环水槽养殖模式能提升池塘整体生态净化效能
IPRS对养殖尾水的处理主要依靠流水槽后端吸污设备的抽提分离和外池塘大水面的净化作用。近年来在推广IPRS的过程中，普遍存在净水效能不充分等问题[30]。此前进行的吉富罗非鱼一年一造养殖过程中，养殖中后期水体中含氮化合物浓度显著升高[10]。何杰等[31]研究发现吉富品系罗非鱼的排泄周期为2~3 h。蒋艾青[32]研究发现鱼类残饲和排泄物在水体中超过8~12 h，水质恶化速度加快。根据罗非鱼的摄食节律，确定投喂饲料3 h后开启吸污装置，减少粪便在池塘水体中的存在时间，提高了吸污装置的工作效率。张志山等[33]研究发现，空心菜浮床能改善养殖水质，对氮磷化合物有明显的吸收效果。本实验在IPRS外池塘设置水生植物净化区和吸收转化区，面积1 240 m2，占据池外池塘总面积的10%，整个养殖期内水体中的氨氮和亚硝酸盐浓度均在罗非鱼的适宜生存范围之内，与对照组传统池塘养殖相比，氨氮和亚硝酸盐的去除率最高达到66.7%和67.1%，这与宋超等[34]的研究结果相似，在集约化池塘中采用浮床种植空心菜能够对水体主要污染物实现有效控制。
综上所述，利用IPRS进行吉富罗非鱼一年两造养殖，投放大规格鱼种，提高了罗非鱼的养殖成活率和养殖产量，避开8—9月疾病高发期，降低养殖风险，养殖成活率可达80%以上，养殖产量58 402 kg·m−2。外池塘套养罗氏沼虾、鲢和鳙，实现IPRS的高效利用，每公顷产值655 099元，利润202 533元，投资回报率44.75%。搭建植物浮床，并合理使用吸污设备，提高IPRS的尾水处理能力，可使整个养殖周期水质指标均在罗非鱼适宜的生存范围之内。
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图 2 转录组transcript和unigenes长度分布
A. transcript的长度分布；B. unigenes的长度分布
Figure 2. Length distribution of assembled transcripts and unigenes of transcriptome
A. size distribution of transcripts; B. size distribution of unigenes
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图 3 Unigenes GO功能注释
1. 转录、DNA依赖性；2. 转录调控、DNA依赖性；3. 蛋白质转运；4. 凋亡；5. 细胞分化；6. 细胞黏附；7. 蛋白质水解；8. 多细胞器官发育；9. 细胞周期；10. 细胞分化；11. 胞内信号转导；12. mRNA加工；13. 信号转导；14. 小G蛋白介导信号转导；15. 转运；16. 转录正调控；17. 有丝分裂；18. 染色质修饰；19. 转录负调控；20. RNA剪切；21. 胞内蛋白质运输；22. 翻译；23. DNA修复；24. 转录；25. 内噬作用；26. 细胞核；27. 细胞浆；28. 必须膜；29. 胞液；30. 细胞质膜；31. 内质网膜；32. 核仁；33. 线粒体；34. 胞外区；35. 核质；36. 隔膜；37. 高尔基体膜；38. 细胞骨架；39. 高尔基体；40. 细胞核周区；41. ATP结合；42. 锌离子结合；43. 蛋白结合；44. DNA结合；45. 金属离子结合；46. RNA结合；47. 钙离子结合；48. 特异序列DNA结合；49. 结合；50. 蛋白质丝氨酸特异酶结合
Figure 3. GO functional annotation of unigenes
1. transcription, DNA-dependent; 2. regulation of transcription, DNA-dependent; 3. protein transport; 4. apoptosis; 5. cell division; 6. cell adhesion; 7. proteolysis; 8. multicellular organismal development; 9. cell cycle; 10. cell differentiation; 11. intracellular signal transduction; 12. mRNA procession; 13. signal transduction; 14. small GTPase mediated signal transduction; 15. transport; 16. negative regulation of transcription; 17. mitosis; 18. chromatin modification; 19. positive regulation of transcription; 20. RNA splicing; 21. intracellular protein; 22. translation; 23. DNA repair; 24. transcription; 25. endocytosis; 26. nucleus; 27. cytoplasm; 28. integral to membrane; 29. cytosol; 30. plasma membrane; 31. endoplasmic reticulum membrane; 32. nuclelous; 33. mitochondrion; 34. extracellular region; 35. nucleoplasm; 36. membrane; 37. golgi membrane; 38. cytoskeleton; 39. golgi apparatus; 40. perinuclear region of cytoplasm; 41. ATP binding; 42. zinc ion binding; 43. protein binding; 44. DNA binding; 45. metal ion binding; 46. RNA binding; 47. calcium ion binding; 48. specific DNA sequence binding; 49. binding; 50. protein serine/threonine-specific kinase
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图 4 Unigenes的KOG注释
A. RNA加工和修饰；B. 染色体结构和动力学；C. 能源生产和转换；D. 细胞周期调控－细胞分裂－染色体分离；E. 氨基酸转运和代谢；F. 氨基酸转运和代谢；G. 碳水化合物转运和代谢；H. 辅酶转运和代谢；I. 脂质转运和代谢；J. 翻译－核糖体结构－生物合成；K. 转录；L. 复制－重组－修复；M. 细胞壁－细胞膜合成；N. 细胞运动；O. 翻译后修饰－蛋白质周转－分子伴侣；P. 无机离子转运与代谢；Q. 次生代谢产物生物合成、转运和分解代谢；R. 一般功能预测；S. 功能未知；T. 信号转导机制；U. 细胞内分泌和囊泡运输；V. 防御机制；W. 胞外结构；Y. 核结构；Z. 细胞骨架
Figure 4. KOG annotation of unigenes
A. RNA processing and modification; B. chromatin structure and dynamics; C. energy production and conversion; D. cell cycle control, cell division, chromosome partitioning; E. amino acid transport and metabolism; F. nucleotide transport and metabolism; G. carbohydrate transport and metabolism; H. coenzyme transport and metabolism; I. lipid transport and metabolism; J. translation, ribosomal structure and biogenesis; K. transcription; L. replication, recombination and repair; M. cell wall/membrane/envelope biogenesis; N. cell motility; O. posttranslational modification, protein turnover, chaperones; P. inorganic ion transport and metabolism; Q. secondary metabolites biosynthesis, transport and catabolism; R. general function prediction only; S. function unknown; T. signal transduction mechanisms; U. intracellular trafficking, secretion, and vesicular transport; V. defense mechanisms; W. extracellular structure; Y. nuclear structure; Z. cytoskeleton
表 1 转录组数据拼接结果统计
Table 1 Assembly result of transcriptome data
序列种类
category总数
total numberN50长度/bp
N50 length总长度/bp
total length最大长度/bp
maximum length中等长度/bp
median length最小长度/bp
minimum length平均长度/bp
average lengthtranscript 42 264 1 331 36 549 208 35 516 522 201 864 unigene 35 659 1 052 26 340 493 35 516 472 201 738 注：N50表示将转录本从长到短排序，依次累加碱基数，当累计碱基数达到转录本总碱基数的50%时的转录本的长度 Note: N50 of transcript or unigenes was calculated by ordering all sequences, then adding the lengths from longest to shortest until the summed length exceeded 50% of the total length of all sequences. 
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