Synergism between Fructus mume and antibiotics against Vibrio harveyi based on response surface methodology
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摘要: 为了给哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)疾病防治新手段的开发提供基础实验数据,筛选了协同抗哈维氏弧菌的乌梅(Fructus mume)水提液与抗生素复合物。首先绘制药物浓度对数对抑菌圈直径标准曲线,采用全组合法筛选与乌梅水提液具有协同抗菌活性的抗生素,然后采用中心组合设计法(CCD)结合响应面法(RSM)分析乌梅水提液与筛出抗生素复合后两两药物间的交互作用,并确定最佳复合配比。全组合法筛出的四环素、土霉素、金霉素和强力霉素分别与乌梅水提液具有协同抗菌作用,RSM分析显示将这4种药物复合后,乌梅水提液与土霉素对哈维氏弧菌存在显著协同抗菌作用;土霉素分别与金霉素和强力霉素存在交互抑制作用;乌梅水提液、土霉素、金霉素和强力霉素最佳复合配比为45∶0.12∶0.00∶0.00 (mg·mL–1)。模型预测最优复合物对哈维氏弧菌的抑菌圈直径为18.54 mm,琼脂扩散法平行3次测得该复合物的抑菌圈直径为(19.03±0.07) mm,相对误差为2.6%,表明该方法结果可靠,为考察药物间的交互作用提供了新思路。Abstract: To provide basic experimental data for developing protocols to prevent and cure the disease caused by Vibrio harveyi, we collected the compound of Fructus mume water extract and antibiotics, which has synergism of antibacterial activity against V. harveyi. First, we plotted the standard curves of concentration logarithms versus inhibitory zone diameters of the test drugs, and used comprehensive combination experimental design method to screen the antibiotics which had synergism effect with F. mume water extract. Then, we applied central concentration design (CCD) with response surface methodology (RSM) to investigate the interaction among F. mume water extract and antibiotics against V. harveyi and to find their optimum combination. Results show that significant synergism existed between F. mume water extract and tetracycline, oxytetracycline, aureomycin and deoxytetracycline. RSM results indicate that the synergism between F. mume water extract and oxytetracycline contributed to the most significant effect on the antibacterial activity against V. harveyi. However, antagonism effect existed between oxytetracycline and aureomycin, and between oxytetracycline and deoxytetracycline. The optimum ratio of F. mume water extract, oxytetracycline, aureomycin and deoxytetracycline was 45∶0.12∶0.00∶0.00 (mg·mL–1). For this optimum combination, the predictive inhibitory zone diameter was 18.54 mm. According to cup method, agar diffusion method with three replicates, the practical maximum inhibitory zone diameter was (19.03±0.07) mm, and the relative error between predictive values and actual values was 2.6%. Thus, RSM is a reliable approach to describe the relationship among test drugs and inhibitory zone diameter.
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Keywords:
- Vibrio harveyi /
- Fructus mume /
- antibiotics /
- response surface methodology /
- synergism effect
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克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)俗称小龙虾。据统计,2017年我国克氏原螯虾养殖面积已经超过66.7×104 hm2,养殖产量超过100×104 t,产值 (含养殖和捕捞)达2 600×108元;而其拉动的养殖、加工、餐饮经济总产值超过1 400×108元,全产业链从业人数将近520×104人[1]。克氏原螯虾正以特别的魅力红遍神州,成为名副其实的大产业。
当前克氏原螯虾养殖主要有稻虾综合种养 (约占70%)、池塘养殖、湖汉 (泊)养殖3种类型。在其养殖业迅速发展过程中也存在养殖技术和良种选育基础研究滞后等问题,制约了产业的发展。关于克氏原螯虾的研究,过去多集中在营养、病害、繁殖和幼体发育等方面[2-12],对其养殖模式的研究也较多[13-16]。克氏原螯虾生性好斗,白天喜欢穴居或潜伏躲藏,晚上觅食,营造适合克氏原螯虾穴居的栖息空间将有利于提高其成活率。唐建清等[17]发现人工洞穴可以使克氏原螯虾的成活率提高81%,此外螯虾更适应穴长较长、避光、透气的人工洞穴。养殖户尝试利用各种模拟洞穴及遮蔽物使螯虾可栖息躲藏[18-19],主要使用的材料有瓦片、网片、砖块、塑料管等[20],但以竹筒和聚氯乙烯 (PVC)管作为克氏原螯虾的人工洞穴较为少见。研究克氏原螯虾对不同人工巢穴的选择和适应程度,有助于了解其穴居生活方式,具有重要的应用价值。
近年,研究发现竹筒也可作为一种良好的克氏原螯虾栖息环境的隐蔽物[21-22]。PVC管作为一种常见的易淘汰型管道用具[23-24],如将废弃的PVC管收集起来用作养殖克氏原螯虾的栖息遮蔽物,可实现废物的再利用。本文通过探究克氏原螯虾对竹筒和PVC管2种洞穴的选择状况,及其在养殖过程中的雌雄分布情况,初步了解克氏原螯虾穴居的生活习性,为其健康养殖和人工繁殖提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 实验设计
按照所选用克氏原螯虾个体大小,设计口径50 mm、长度50 cm的竹筒和PVC管 (图 1),两者均为两端开口,竹筒内为贯通,PVC管内用铁片作为隔物隔断。实验设2个组,分别为A组 (放置100个竹筒型洞穴)和B组 (放置50个PVC管及50个竹筒型洞穴)。实验每隔10 d记录1次洞穴内外虾的数量及雌雄比例,连续记录3次。
1.2 实验对象管理
实验在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行,随机挑选一批个体大小均匀、体质健康的克氏原螯虾[体质量 (31.23±3.52) g]为实验用虾。实验共分成2个处理组,每组200尾,雌雄比例接近2∶1[25],于室内车间玻璃缸 (1.84 m×0.70 m×1.73 m)分缸养殖30 d。实验期间用水为纯淡水,水温27~31.5 ℃,溶解氧5.6~6.4 mg·L–1。自然采光 (屋顶是间隔透光瓦,为室外光强1/2以上,中午光强可达到50 000 lx以上),24 h充气。每天投喂2次 (8:00和17:00),日投喂量为克氏原螯虾体质量的4%~6%,8:00投喂日投喂量的40%,17:00投喂日投喂量的60%,投料1 h后观察克氏原螯虾摄食情况,并及时调整投料量,每隔3日吸污换水1次,换水量20%~30%。
1.3 统计分析
数据采用Excel 2013和SPSS 21.0软件处理,进行单因素方差分析,用Duncan's多重比较分析各组间的差异显著性 (P<0.05)和差异极显著性 (P<0.01)。结果表示为“平均值±标准误
$(\overline X \pm$ $ {\rm{SE}})$ ”。2. 结果
2.1 克氏原螯虾在洞穴层次及洞穴内外的分布占比规律
克氏原螯虾在洞穴内的空间分布呈现出由下至上依次降低的分布规律 (表 1),不同层次虾的分布占比存在显著性差异。A组竹筒中由下至上分别为21.17%、33.73%、17.51%、9.53%和7.87%。在B组竹筒型洞穴内不同层次的分布占比由下至上分别为26.63%、23.07%、9.13%、8.27%和4.70%;B组PVC管洞穴中由下至上分别为8.61%、2.00%、0.00%、0.00%和1.02%。
表 1 克氏原螯虾在洞穴内的分布占比Table 1. Proportion of distribution of P. clarkii inside cave% 层次
layerA组
Group AB组 Group B 竹筒型洞穴
bamboo cavePVC管型洞穴
PVC cave上层 upper 7.87±1.10e 4.70±0.46d 1.02±0.08c 中上层
middle and upper9.53±0.29de 8.27±0.86c 0.00±0.00d 中层 middle 17.57±0.64c 9.13±1.50c 0.00±0.00d 中下层
middle and lower33.73±1.40a 23.07±2.13b 2.00±0.09b 下层 lower 21.17±0.58b 26.63±2.87a 8.61±0.77a 注:同列数据中上标不同字母者之间差异显著 (P<0.05);下表同此 Note: Values within the same row with different superscript letters are significantly different (P<0.05). The same case in the following tables. 两组实验躲藏在洞穴中虾的数量分别占总数的83.47%和89.87%,远高于未躲藏在洞穴中的虾数量占比 (10.13%和16.53%)。B组内竹筒型洞穴内虾的总分布占比为71.8%,PVC管型洞穴内虾的总分布占比为11.63%。相比于PVC管型洞穴而言,躲藏栖息于竹筒型洞穴内虾的数量较多。
2.2 克氏原螯虾在洞穴内外的雌雄比例分布规律
不同垂直空间雌雄分布比例并没有明显规律,但筒型洞穴内虾的平均雌雄比例 (1.94∶1)高于PVC管型洞穴 (1.04∶1,表 2、图 2)。雌雄比最高分别出现在A组的最下层 (3.43∶1)和B组竹筒洞穴的最上层 (2.86∶1)。A组竹筒中不同层次的虾的雌雄比例存在差异,由上至下分别为1.81∶1、0.78∶1、2.25∶1、1.64∶1、3.43∶1和1.62∶1,雌雄比例大都高于1∶1;在B组竹筒型洞穴中,除下层、中层、中上层3层之间虾的雌雄比例差异不明显外,其他各层次之间有显著性差异。由上至下分别为2.86∶1、1.73∶1、1.11∶1、1.55∶1、1.73∶1和2.76∶1,雌雄比例均高于1∶1。在B组PVC管型洞穴中,除了没有虾分布的层次外,其他各层雌雄比例均高于1∶1,虾的雌雄比例由上层至下层分别为1.08∶1、0、0、1.25∶1、1.17∶1和2.76∶1。
表 2 克氏原螯虾在不同空间的雌雄比例分布Table 2. Proportion of ratio of male and female of P. clarkii in different spaces层次
layerA组
Group AB组 Group B 竹筒型洞穴
bamboo cavePVC管型洞穴
PVC cave上层 upper 1.81±0.20c 2.86±0.13a 1.08±0.14b 中上层
middle and upper0.78±0.12d 1.73±0.06b 0.00±0.00c 中层 middle 2.25±0.14b 1.11±0.10c 0.00±0.00c 中下层
middle and lower1.64±0.20c 1.55±0.82b 1.25±0.25b 下层 lower 3.43±0.01a 1.73±0.10b 1.17±0.14b 洞穴外
outside cave1.62±0.06c 2.76±0.26a 2.76±0.26a 2.3 克氏原螯虾在洞穴内虾的数量分布比例规律
栖息有1尾虾的竹筒洞穴和PVC管分别占36.64%~40.52%和36%,栖息有2尾虾的竹筒洞穴和PVC管分别占19.79%~20.58%和3%,栖息有3尾虾以上的竹筒洞穴和PVC管分别占17.26%~23.05%和0%,竹筒洞穴内栖息最多虾数量达到7尾,其中栖息5~7尾虾的洞穴占4.24%~6.94%,没有虾栖息的竹筒洞穴占16.65%~25.54%,而PVC管则高达61% (表 3、图 3)。
表 3 克氏原螯虾在洞穴内虾数量占比比较Table 3. Comparison of proportion of number of P. clarkii in cave% 尾数
numberA组
Group AB组 Group B 竹筒型洞穴
bamboo cavePVC管型洞穴
PVC cave0 16.65±1.02c 25.54±0.87b 61.00±3.61a 1 40.52±1.07a 36.64±0.94a 36.00±4.00b 2 19.79±0.45b 20.58±1.03c 3.00±1.00c 3 10.75±1.50d 6.63±0.74d 0.00±0.00c 4 5.36±1.10e 6.36±0.51d 0.00±0.00c 5~7 6.94±0.47e 4.24±0.74e 0.00±0.00c A组栖息有1尾虾的竹筒洞穴高达40.52%,B组竹筒型洞穴中栖息有1尾虾的洞穴为36.64%,B组PVC管型洞穴中栖息1尾虾的洞穴为36%,没有虾栖息的洞穴占61%。
3. 讨论
3.1 洞穴有无及2种材质对克氏原螯虾穴居生活的影响
克氏原螯虾喜温畏冷,需要靠洞穴躲避以满足生存需求[26],尤其在繁殖季节其打洞筑穴能力显著增强,而且克氏原螯虾受精、抱卵都需要在洞穴内完成[27]。本实验发现在竹筒型洞穴内,虾主要分布于洞穴中下层和下层,其他层次和洞穴外较少,这与克氏原螯虾的游泳能力不强和主要依靠爬行的生活方式有关,与一般泥土池塘生活习性[28]大致吻合。此外有研究发现,克氏原螯虾多数时间喜欢在洞穴底部栖息,只有在白天温度上升时才会慢慢从底层游走到上层,或者洞穴外[29-30]。而B组内既有竹筒又有PVC管,PVC管中虾的数量少,可见相对PVC管的洞穴而言,虾更喜欢竹筒型洞穴,这可能与虾栖息洞穴的材质有关。PVC管由聚氯乙烯纤维构成,质地硬,透气性差;相比之下竹材由基本组织和维管束 (导管和厚壁纤维)组成,竹节细胞全部纵向排列,内部表面粗糙,透气性好。另外使用竹筒作为人工洞穴,其遮阴性、舒适性皆较PVC管好,与克氏原螯虾的繁殖生物学特性最接近,虾对竹筒型洞穴也有一定的亲和力。PVC管是由人工合成的聚氯乙烯构成,虾对这种材质没有亲和力,不喜欢栖息其中,所以在洞穴外会比较多[31]。但如果虾长期不躲避于洞穴,其生存繁衍能力就会下降,在实际养殖过程中会造成很大损失[17]。因此选择一个好的人工模拟洞穴,对克氏原螯虾的工厂化、集约化养殖具有重要意义。
3.2 2种材质洞穴及空间隔层对克氏原螯虾雌雄比例的影响
本研究结果表明,克氏原螯虾具有一雄多雌同居一穴的现象。不同洞穴内外的雌雄比例分布没有明显规律,但上层和下层的雌雄比例相对其他层雌雄比例高。克氏原螯虾生性好斗,性格凶猛[32],尤其在繁殖季节雄虾对雌虾的争斗会加剧,因而在池塘养殖过程中,投放雌虾的比例要大于雄虾[33]。另有研究发现,克氏原螯虾的雌雄投放比例设为2~3∶1较恰当[25]。本次投放比例接近2∶1,结果显示,在A组内下层的虾雌雄比例差异最大 (3.43∶1),而B组竹筒内上层的虾雌雄比例差异最大 (2.86∶1),这可能与克氏原螯虾攀缘和游泳能力不强有关,下层是最易占据的空间位置,栖息虾数量多,而最上层则可能由于受到其他虾的干扰较小,呈现出较高的雌雄比例。B组PVC管内中下层的雌雄比例差异最大 (1.25∶1),说明雌雄分布比例与空间关系不大,但是竹筒内的平均雌雄比例大于PVC管。而刘琦[34]研究发现螯虾因其趋触性而喜欢更加粗糙的洞穴,因为这更易标记自己的信号,而洞穴“信号”的差异性能够引起螯虾选择行为的变化,螯虾均对有过“印痕”的隐蔽所具有倾向性,雌性对雄性具有显著性趋向性。由此推测,竹筒或许因其粗糙度高于PVC管而使得其中的雄虾更吸引雌虾。
3.3 2种材质洞穴及不同空间对克氏原螯虾数量分布的影响
克氏原螯虾是穴居动物,多数喜欢躲避在洞穴内[35-36],然而躲避在洞穴内虾的数量是由不同空间、时间等各种因素决定的[37]。本实验得出,在两组的竹筒型洞穴中,藏有1尾虾的洞穴数量最多,这可能是因为实验季节未到其繁殖季节,且克氏原螯虾又有胆小、喜独处的特性。另外在B组PVC管型洞穴组中,只有一小部分虾躲避在洞穴内,表明PVC管不如竹筒适合小龙虾躲藏,经过B组2个处理组的对比也说明了竹筒型洞穴比PVC管型洞穴更适合小龙虾躲避栖息。
此外,笔者还发现1个洞穴内藏有5~7尾虾的比例占4%~7%,单个洞穴里躲藏最多达7尾虾 (4雌3雄),说明克氏原螯虾不仅有某种领地意识,还有一种“群居”的生活方式,如多雌多雄交配的繁殖习性等[38]。这可能是克氏原螯虾经过一段时间的内部争斗与空间调节后,虾群之间逐渐形成了某种稳定的配对繁衍模式,这与郑方东等[39]对黑眶蟾蜍 (Duttaphrynus melanostictus)的研究有些类似。
4. 结论
本研究初步探讨了克氏原螯虾在不同空间洞穴的分布情况,发现克氏原螯虾喜欢躲藏在洞穴中,尤其是喜欢在纤维素质材料的竹筒型洞穴中躲藏,其在洞穴中躲避时更喜欢栖息于洞穴的中下层,克氏原螯虾还具有一雄多雌同居一穴的现象。该结果对于了解克氏原螯虾选择人工洞穴的偏好性具有重要意义,可为克氏原螯虾的工厂化养殖提供参考和借鉴。
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表 1 各药物的标准方程及其参数
Table 1 Standard functions and parameters of each drug
药物名称
drug标准曲线
standard curve质量浓度范围/mg·mL–1
range of concentrationR2 乌梅水提液 F. mume water extract Y=8.688 0lgC−5.799 0 20~100 0.939 6 四环素 tetracycline Y=7.088 0lgC+18.893 8 0.07~0.52 0.986 9 土霉素 oxytetracycline Y=5.400 1lgC+14.388 4 0.03~0.58 0.961 9 强力霉素 deoxytetracycline Y=3.927 2lgC+15.835 6 0.10~1.55 0.935 5 金霉素 aureomycin Y=3.667 4lgC+16.121 0 0.03~0.58 0.991 4 新霉素 neomycin Y=7.116 0lgC+15.598 0 0.10~0.80 0.941 0 链霉素 streptomycin Y=10.134 1lgC+15.950 4 0.15~0.65 0.927 4 表 2 全组合实验结果
Table 2 Experimental design and results of combination of F. mume water extract and antibiotics
抗生素
antibiotics质量浓度/mg·mL–1
concentration抑菌圈直径范围/mm
inhibitory zone diameter相互促进效率/%
synergism efficiency乌梅水提液
F. mume water extract抗生素
antibiotics估算值
predicted value测量值
actual value四环素 tetracycline 50 0.13 13.43~13.83 15.47±0.06 11.88 土霉素 oxytetracycline 0.27 12.05~12.93 16.60±0.08 28.37 强力霉素 deoxytetracycline 0.20 13.23~14.18 16.27±0.09 14.73 金霉素 aureomycin 0.13 13.01~14.02 16.32±0.07 16.35 新霉素 neomycin 0.20 12.04~12.50 10.64±0.09 − 链霉素 streptomycin 0.20 11.53~11.96 8.35±0.04 − 注:− 表示无交互促进作用
Note: − indicates no synergism effect.表 3 乌梅水提液与抗生素复合CCD设计因素水平表
Table 3 Factors and levels of CCD for combination of F. mume water extract and antibiotics
mg·mL–1 水平
level乌梅水提液 (X1)
F. mume water extract土霉素 (X2)
oxytetracycline金霉素 (X3)
aureomycin强力霉素 (X4)
deoxytetracycline–1 15 0.06 0.05 0.02 0 30 0.09 0.08 0.04 1 45 0.12 0.11 0.06 表 4 CCD设计方案及其实验结果
Table 4 Design and results of CCD
序号
No.X1 X2 X3 X4 Y/mm 序号
No.X1 X2 X3 X4 Y/mm 1 –1 –1 0 0 16.96±0.02 15 0 1 –1 0 17.06±0.07 2 –1 1 0 0 16.66±0.03 16 0 1 1 0 16.81±0.09 3 1 –1 0 0 16.51±0.14 17 –1 0 –1 0 16.53±0.16 4 1 1 0 0 17.20±0.13 18 –1 0 1 0 16.33±0.08 5 0 0 –1 –1 16.67±0.04 19 1 0 –1 0 16.85±0.05 6 0 0 –1 1 16.92±0.07 20 1 0 1 0 17.21±0.09 7 0 0 1 –1 16.72±0.05 21 0 –1 0 –1 15.83±0.04 8 0 0 1 1 17.01±0.04 22 0 –1 0 1 16.97±0.08 9 –1 0 0 –1 16.67±0.06 23 0 1 0 –1 17.33±0.12 10 –1 0 0 1 16.55±0.03 24 0 1 0 1 16.59±0.08 11 1 0 0 –1 16.87±0.08 25 0 0 0 0 16.61±0.08 12 1 0 0 1 16.79±0.07 26 0 0 0 0 16.68±0.05 13 0 –1 –1 0 16.55±0.09 27 0 0 0 0 16.66±0.04 14 0 –1 1 0 16.47±0.08 表 5 RSM统计分析结果
Table 5 Statistical results of RSM analysis
来源
source自由度
df平方和
SS均方差
MSF Pr>F X1 1 0.243 7 0.243 7 6.953 8 0.021 7 X2 1 0.469 7 0.469 7 13.402 7 0.003 3 X3 1 0.000 0 0.000 0 0.000 6 0.980 7 X4 1 0.047 6 0.047 6 1.359 2 0.266 3 X12 1 0.022 4 0.022 4 0.640 6 0.439 1 X1X2 1 0.242 6 0.242 6 6.921 9 0.021 9 X1X3 1 0.077 3 0.077 3 2.205 5 0.163 3 X1X4 1 0.000 3 0.000 3 0.008 7 0.927 1 X22 1 0.008 8 0.008 8 0.251 2 0.625 3 X2X3 1 0.007 2 0.007 2 0.206 2 0.657 9 X2X4 1 0.895 9 0.895 9 25.565 5 0.000 3 X32 1 0.021 4 0.021 4 0.611 3 0.449 5 X3X4 1 0.000 3 0.000 3 0.007 3 0.933 3 X42 1 0.008 3 0.008 3 0.236 0 0.635 9 模型 model 14 2.018 1 0.144 1 4.113 6 0.009 4 线性项 linear 4 0.761 0 0.190 3 5.429 1 0.009 9 平方项 quadratic 4 0.033 6 0.008 4 0.239 6 0.910 5 交互项 cross product 6 1.223 5 0.203 9 5.819 2 0.004 8 残差 error 12 0.420 5 0.035 0 失拟项 lack of fit 10 0.417 6 0.041 8 28.793 5 0.034 0 净误差 pure error 2 0.002 9 0.001 5 总和 total 26 2.438 6 -
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