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合浦珠母贝胸腺素β4 (thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究
何文耀, 范嗣刚, 刘宝锁, 张博, 周童, 苏家齐, 邓正华, 喻达辉
2018, 14(2): 66-74. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.02.009
胸腺素β4 (thymosin β4)具有抗菌、抑制炎症和促进伤口愈合等作用。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)胸腺素β4 (Pfthymosin β4)的基因序列。该基因长261 bp,其中开放阅读框(open reading frame, ORF) 126 bp,编码42个氨基酸。生物信息学分析发现,胸腺素β4的蛋白理论分子量为4.78 ku;具有典型的“THY”特征模体和胸腺素β家族的特征序列;氨基酸序列保守性很高,与其他物种相似性达90%以上。荧光定量PCR结果表明,Pfthymosin β4在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高,其次是足与鳃。插核手术后取血细胞和伤口组织,Pfthymosin β4在血细胞和伤口组织的表达量显著升高,第6小时达到最高,推测表达量升高的原因是Pfthymosin β4促进血细胞向伤口处移动来参与合浦珠母贝伤口的前期修复。在各个发育时期中Pfthymosin β4均有表达,在变态期的表达量突然升高,推测其可能参与了合浦珠母贝的变态附着过程。
关键词: 合浦珠母贝, 胸腺素β4, 表达分析, 伤口愈合, 发育时期
合浦珠母贝章鱼胺受体(OAR)基因的克隆与表达分析
王德清, 李海梅, 黄桂菊, 张博, 范嗣刚, 刘宝锁, 苏家齐, 喻达辉
2017, 13(1): 58-65. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.008
章鱼胺受体(octopamine receptor,OAR)广泛存在于无脊椎动物中,具有调节神经肌源性节奏收缩、调节cAMP水平、参与磷酸化途径等多种重要功能,但其在贝类中的研究却很少。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)OAR基因(pfOAR)的cDNA全长序列,比较分析了氨基酸序列的同源性,并采用荧光定量PCR技术检测了该基因在不同组织和幼体不同发育阶段的表达差异以及贝壳损伤后该基因在外套膜中表达水平的变化。结果显示:pfOAR的cDNA全长1 890 bp,开放阅读框1 659 bp,编码552个氨基酸,有7个跨膜结构域,具有G蛋白偶联受体的共性。pfOAR在6个被检测的组织中均有表达,且在外套膜中的表达水平显著高于其他组织;幼体发育过程中pfOAR表达水平逐渐升高,变态期的表达水平显著高于其他时期;人为损伤贝壳36 h后,pfOAR的表达水平显著升高。这些结果表明pfOAR在合浦珠母贝中可能具有多样化的功能,参与了贝壳的形成和修复,为进一步开展pfOAR的功能研究奠定了重要基础。
关键词: 合浦珠母贝, 章鱼胺受体, 生物矿化, 变态发育, 缺刻实验
合浦珠母贝matrilin-1基因的克隆和表达分析
王珍珍, 黄桂菊, 范嗣刚, 刘宝锁, 张博, 苏家齐, 喻达辉
2017, 13(1): 76-84. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.010
以合浦珠母贝(Pinctada fucata)转录组中的matrilin-1基因片段为基础,开展了matrilin-1的cDNA全长(Pfmatrilin-1)克隆和定量表达分析。Pfmatrilin-1基因cDNA全长2 036 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 194 bp,编码397个氨基酸,包括1个信号肽序列和2个血管性血友病因子A(von Willebrand factor A,VWA)样结构域。系统进化分析显示无脊椎动物的matrilins与脊椎动物的matrilins进化关系较远。荧光定量PCR表达分析结果显示,Pfmatrilin-1 mRNA在合浦珠母贝各个组织中均有表达,其中在血液中表达量最高(P < 0.05);Pfmatrilin-1从担轮幼虫期至变态期均有表达,眼点期表达量最高(P < 0.05),而贝类幼虫发育到眼点期就会开始附着,眼点期幼虫原壳生长停滞,次生壳形成,因此推测其可能与次生壳的形成有关。这些结果表明Pfmatrilin-1在合浦珠母贝生物矿化中发挥重要作用。
关键词: 合浦珠母贝, Pfmatrilin-1, 表达谱, 基因克隆
合浦珠母贝BMP7b基因的克隆与表达分析
范嗣刚, 周代志, 刘宝锁, 邓正华, 郭奕惠, 喻达辉
2018, 14(1): 121-126. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.016
为了解骨形态发生蛋白(BMP)在贝类生物矿化方面的作用,该研究发现并克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata) BMP7的同源基因BMP7b,并对其进行了组织表达分析。结果显示,该基因cDNA长2 464 bp,其中ORF长1 194 bp,编码397个氨基酸。BMP7b蛋白无跨膜结构,含有1个信号肽(1~26 aa),1个TGF-β前肽结构域(25~240 aa)和1个TGF-β结构域(299~396 aa)。BMP7b在各组织和各胚胎发育时期中均有表达,在鳃和外套膜的表达量高,在肠和肝胰腺的表达量低;在担轮幼虫期的表达量远远高于其他时期。贝壳缺刻实验显示24 h后,BMP7b表达量显著上升。以上结果表明BMP7b可能在合浦珠母贝贝壳形成和修护过程中起重要作用。
关键词: 合浦珠母贝, BMP7b, 时空表达模式, 贝壳形成与修复
斑节对虾CDC42基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析
李丽丽, 赵超, 范嗣刚, 王鹏飞, 闫路路, 邱丽华
2018, 14(4): 37-45. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.04.005
细胞分裂周期蛋白42 (CDC42)是一类广泛表达的小三磷酸鸟苷 (GTP)酶,是Ras家族内Rho亚家族的成员之一,具有GTP酶活性。CDC42在细胞吞噬和炎症发生等先天免疫中发挥着不可替代的功能。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾(Penaeus monodon)细胞分裂周期蛋白42 (PmCDC42)基因cDNA全长。生物信息学分析结果表明PmCDC42全长2 233 bp,包括59 bp的5' 非编码区 (UTR)、1 598 bp的3'UTR和576 bp的开放阅读框 (ORF),编码191个氨基酸。通过实时定量PCR技术,研究了PmCDC42在斑节对虾各组织的表达模式,并研究了其在不同pH、盐度、重金属镉(Cd)和哈维弧菌 (Vibrio harveyi)胁迫下的表达情况。结果显示,PmCDC42基因在各组织中均有表达,在血淋巴中的表达量最高。在pH和Cd胁迫下PmCDC42表达量显著升高;在高盐胁迫下PmCDC42表达量上调,低盐胁迫下PmCDC42表达量变化不显著;在哈维弧菌的刺激下PmCDC42上调表达极显著。这表明PmCDC42在斑节对虾先天免疫中起重要作用。
关键词: 斑节对虾, 细胞分裂周期蛋白42, pH, 盐度, , 哈维弧菌
华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的功能分析
范嗣刚, 赵超, 王鹏飞, 闫路路, 邱丽华
2019, 15(1): 63-68. doi: 10.12131/20180182
为了解肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)在华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)闭壳肌肌肉生长和发育过程中所起的负调控作用,对华贵栉孔扇贝的MSTN启动子序列进行了生物信息学分析。结果显示,MSTN启动子序列长1 358 bp,有4个转录起始位点。核心启动子区为–100~–51 bp。有1个TATA-box (–92~–86 bp)和2个E-box等顺式作用元件;潜在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等;启动子区域无CpG岛。成功构建了6个MSTN启动子不同长度片段的荧光素酶表达载体,瞬时转染到293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,表明6个启动子片段均有转录活性,PGL-534的活性最高,其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102,最低的为PGL-995。–216~–364区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,–364~–825区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。
关键词: 华贵栉孔扇贝, MSTN, 启动子, 瞬时转染, 功能分析
斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选
刘恩瑞, 赵超, 王鹏飞, 范嗣刚, 闫路路, 邱丽华
2019, 15(4): 88-98. doi: 10.12131/20180285
凋亡抑制因子1 (tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)可以通过抑制细胞凋亡参与生物体内应激反应。为探究TRIAP1基因及调控其表达的miRNAs在斑节对虾 (Penaeus monodon) 应对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激时的表达调控情况,该研究通过RACE技术获得了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术,对PmTRIAP1在斑节对虾不同组织中的表达分布模式,以及哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1与相关miRNAs的表达关联情况进行了探究。结果显示,PmTRIAP1 cDNA全长2 522 bp,包括11 bp的5'非编码区(UTR)、2 289 bp的3'UTR和222 bp的开放阅读框(ORF),共编码73个氨基酸。PmTRIAP1基因在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高;哈氏弧菌刺激下,PmTRIAP1表达量显著降低,而Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高,表明PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p的表达量呈负相关关系;双荧光素酶报告实验结果显示,Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p可通过结合PmTRIAP1 3'UTR降低荧光素酶活性,表明Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p均可靶向调控PmTRIAP1的表达。
关键词: 斑节对虾, TRIAP1, Pm-miR-145-3p, Pm-miR-454-3p, 哈氏弧菌