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斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析
周凯敏, 江世贵, 黄建华, 杨其彬, 姜松, 邱丽华, 杨丽诗, 周发林
2017, 13(4): 59-68. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.04.008
研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(PmChi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因cDNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因cDNA全长2 050 bp,其中5′-非编码区(5′-UTR)144 bp、3′-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。
关键词: 斑节对虾, 几丁质酶, 基因克隆, 表达分析, 蜕皮, 变态
维生素E和裂壶藻对斑节对虾精荚再生的协同作用
刘栋梁, 黄建华, 周发林, 杨其彬, 姜松, 杨丽诗, 朱彩艳, 江世贵
2018, 14(1): 20-26. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.003
文章探究了维生素E (Vitamin E, VE)和裂壶藻(Schizochytrium sp., Sch)对斑节对虾(Penaeus monodon)雄虾精荚再生的作用。以基础饲料配制了4种不同配合饲料(0添加组;VE 200组;1% Sch组;VE 200+1% Sch组),饲喂被挤压排出精荚的成熟雄性斑节对虾40 d,评估斑节对虾雄虾精荚再生后的精子数量和质量。结果表明,添加量为200 mg·kg–1 VE饲料组的活精子数百分比显著高于对照组(P<0.05);单一添加1%裂壶藻饲料组的活精子数与对照组间差异不显著(P>0.05);共同添加200 mg·kg–1VE和1%裂壶藻的饲料组的精子总数显著高于对照组(P<0.05)。综合精荚质量、精子数量及活精子数百分比3个指标得出,饲料中共同添加1%裂壶藻与200 mg·kg–1 VE对斑节对虾雄虾精荚的再生和提高精子数量具有协同促进作用。
关键词: 斑节对虾, 维生素E, 裂壶藻, 精荚
斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析
刘倩, 江世贵, 邱丽华, 黄建华, 周发林, 杨其彬, 姜松, 杨丽诗
2017, 13(5): 63-71. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.05.009
Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体, 在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(PmToll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型, 通过免疫印迹方法证实PmToll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处PmToll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。qRT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路, 促进通路下游髓样分化因子(MyD88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达, 同时酶联免疫吸附测定结果证明PmToll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活PmToll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达, 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制PmToll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过PmToll9激活Toll信号通路, 引起机体免疫防御反应, 而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。
关键词: 斑节对虾, Toll受体蛋白, 细胞免疫模型, TLR信号通路, 微生物刺激, 先天性免疫
斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析
何鹏, 江世贵, 李运东, 杨其彬, 姜松, 杨丽诗, 黄建华, 周发林
2019, 15(2): 72-82. doi: 10.12131/20180264
该研究利用RACE技术克隆获得了斑节对虾(Penaeus monodon) GLUT1 (glucose transporter type 1)的cDNA全长序列;采用实时荧光定量的方法研究了PmGLUT1在斑节对虾幼体发育过程中、各个组织中及低盐胁迫下的差异表达情况。该基因cDNA开放阅读框(ORF)全长1 476 bp,可编码491个氨基酸。检测PmGLUT1基因从受精卵至仔虾期发育过程的表达情况,结果显示,PmGLUT1在幼体发育各期的表达量有所波动,但总体呈现上升趋势。组织表达分析发现,PmGLUT1在鳃组织中的表达量最高,肝胰腺次之,在卵巢中的表达量最低。急性低盐胁迫后,PmGLUT1在肝胰腺中的表达水平显著高于对照组(P<0.05),但在鳃中的表达水平显著低于对照组(P<0.05)。研究结果表明,PmGLUT1可能在斑节对虾幼体发育及机体应对低盐胁迫过程中具有重要作用,这为进一步研究葡萄糖转运蛋白基因在斑节对虾幼体发育调控和耐低盐胁迫应答中的分子机制提供了理论依据。
关键词: 斑节对虾, GLUT1, 基因克隆, 幼体发育, 低盐胁迫
斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析
丁阳阳, 江世贵, 李运东, 杨其彬, 姜松, 杨丽诗, 黄建华, 周发林
2019, 15(3): 87-96. doi: 10.12131/20180216
Pellino蛋白家族,是一类高度保守的E3泛素连接酶,在泛素化和先天性免疫中发挥重要作用。该研究通过RACE技术得到斑节对虾(Penaeus monodon)泛素连接酶Pellino基因的cDNA全长。该基因序列全长1 961 bp,编码区序列长1 299 bp,编码432个氨基酸,5'非编码区(UTR)为89 bp,3'UTR为573 bp。通过qRT-PCR技术,研究了PmPellino基因在斑节对虾不同组织中的表达水平,并研究了其在不同浓度氨氮胁迫下和不同微生物刺激下的表达情况。结果显示,PmPellino基因在各组织中均有表达,在鳃组织中表达量最高。急性氮氮胁迫后,PmPellino在肝胰腺中的表达量显著上调(P<0.01),但在鳃中的表达被抑制(P<0.01)。哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著激活PmPellino在鳃中的表达,抑制其在肝胰腺中的表达。鳗弧菌(V. anguillarum)可显著抑制PmPellino在肝胰腺中的表达,而对PmPellino在鳃中的表达无显著影响。金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)可以显著激活PmPellino在肝胰腺和鳃中的表达。结果表明PmPellino可以激活免疫应答通路,在免疫防御中发挥重要作用。
关键词: 斑节对虾, 泛素连接酶, Pellino蛋白, 急性氨氮胁迫, 微生物刺激
克氏原螯虾对2种材质洞穴的选择和空间分布研究
骆磊, 黄建华, 刘栋梁, 谭理琦, 江世贵, 周发林, 姜松, 杨其彬, 杨丽诗
2019, 15(4): 76-81. doi: 10.12131/20190005
文章通过观察人工养殖环境下,克氏原螯虾 (Procambarus clarkiaii) 在堆积的竹筒和PVC管2种类型洞穴中的分布情况,分析比较了克氏原螯虾对2种洞穴的选择适应性和空间分布占比规律,不同洞穴内外的雌雄比例分布规律,及单一洞穴内虾的数量分布及雌雄比例规律。实验结果表明,克氏原螯虾喜栖息躲藏于洞穴中 (A组83.47%,B组89.87%),尤其喜栖息躲藏于竹筒洞穴中[B组竹筒 (71.80%)和PVC管 (11.63%)]。垂直摆放洞穴的上下位置会影响克氏原螯虾分布,克氏原螯虾更喜欢在中下层和下层洞穴中躲藏,其分布数量由下而上依次降低。克氏原螯虾具有一雄多雌同居一穴的现象,不同垂直空间雌雄分布比例没有明显规律,但雌雄比最高分别出现在A组的最下层 (3.43∶1) 和B组竹筒洞穴的最上层 (2.86∶1)。
关键词: 克氏原螯虾, 竹筒, PVC管, 洞穴选择, 分布规律
斑节对虾2种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究
吴勉之, 杨丽诗, 周发林, 黄建华, 姜松, 杨其彬, 江世贵
2018, 14(4): 27-36. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.04.004
在斑节对虾(Penaeus monodon)体内新发现了2种高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)家族基因PmCHHPmHHLPP。基因组分析结果显示,其均具有CHH-Ⅰ型基因基本的“信号肽-CPRP-KR/ER/RR-成熟肽”结构,且与已报道的CHHs基因的基因组结构相似;聚类分析结果显示,尽管PmCHHPmHHLPP与多个CHHs基因序列相似性超过50% (最高达99%),但与其聚为一支的基因均不是CHH-Ⅰ型基因;生物信息学分析结果显示,PmCHHPmHHLPP的转录起始位点“A”及其核心启动子区域分别位于开放阅读框(ORF)上游的99 bp和190 bp,同时在预测其空间结构后发现,两者的三维结构中均含有4个α螺旋构型;组织表达结果显示,2个基因均在肠中有较高的表达量,而PmCHH在鳃、PmHHLPP在眼柄中表达量也较高,但在肝胰腺和肌肉中表达量较低;幼体发育阶段表达结果显示,2个基因在无节幼体Ⅲ~Ⅳ期、溞状幼体Ⅰ期和糠虾幼体期表达量均有较大波动,与代谢强度呈弱相关关系。根据其一级结构的特征和相关表达情况,可推测PmCHHPmHHLPP均为CHHs家族基因。
关键词: 斑节对虾, 甲壳动物高血糖激素, 基因组结构, 表达分析, 幼体发育
斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数估计
周发林, 杨其彬, 黄建华, 姜松, 杨丽诗, 张汤生, 江世贵
doi: 10.12131/20190091
该研究以高氨氮和淡水胁迫致死时间为衡量指标,估计了斑节对虾(Penaeus monodon)耐氨氮和淡水应激性状的遗传参数。以斑节对虾“南海1号”和非洲品系为亲本,建立了27个全同胞家系,含5个半同胞家系。利用单性状动物模型和ASReml软件估计斑节对虾幼体阶段的耐氨氮和淡水应激性状的方差组分和遗传参数。通过最佳线性无偏预测法估计所有个体和家系耐氨氮和淡水应激性状的育种值。斑节对虾耐氨氮和耐低盐的遗传力分别为0.11±0.04和0.29±0.08,且统计检验达到显著水平。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系表型值相关系数为0.15,表现为低度线性正相关。斑节对虾耐氨氮和淡水应激性状的家系育种值相关系数为0.57,表现为中度线性正相关。因此在进行斑节对虾耐氨氮性状选育时,耐淡水应激性状也能得到一定的改良。
关键词: 斑节对虾, 耐氨氮, 耐淡水应激, 遗传参数
2种培养方式对小新月菱形藻生长及菌群结构的影响研究
唐亚鹏, 王瑞旋, 黄建华, 杨丽诗, 江世贵, 林黑着, 王国福
doi: 10.12131/20190011
文章以小新月菱形藻 (Nitzschia closterium f. minutissima)为研究对象,分析比较了小新月菱形藻在负压光生物反应器与开放式桶培养下,藻密度、pH、溶解氧及菌落结构的变化情况。结果表明,在负压光生物反应器培养下的藻密度可达到1.33×107个·mL–1,明显高于开放式培养的藻密度 (8.36×106个·mL–1)。藻液中pH随藻密度增加而升高,两者呈显著正相关 (P<0.01),在负压光生物反应器及开放式培养环境中pH最高值分别为10.3和9.3。溶解氧与pH变化趋势相反,在负压光生物反应器内溶解氧随藻密度增加而降低,最后稳定在6.5 mg·L–1,溶解氧的下降可能与玫瑰杆菌 (Roseobacter)成为优势细菌有关。利用16S rDNA基因的高通量测序技术,分析在培养过程中藻际菌群的结构变化,发现菌落的多样性显著下降 (P<0.05),培养前期主要以变形杆菌 (Proteobacteria)和拟杆菌 (Bacteroidetes)为优势细菌,在负压光生物反应器内培养后期主要以蓝细菌 (Cyanobacteria)与玫瑰杆菌为优势细菌,其菌落结构与开放式桶存在明显差异。
关键词: 小新月菱形藻, 培养方式, pH, 溶解氧, 菌落结构, 负压光生物反应器
斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析
陈劲松, 江世贵, 黄建华, 杨其彬, 马振华, 周发林
2017, 13(3): 73-82. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.03.010
为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用, 该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列, 进行了相关生物信息学分析, 在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp, 开放阅读框(ORF)为1 242 bp, 3′非编码区(UTR)为584 bp, 包括含有30个碱基的poly(A)尾, 5′非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸, 预测分子量为45.852 kD, 理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达, 在肝胰腺中表达量最高, 其次为鳃组织, 在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明, PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调, 显著高于对照组(P < 0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调, 并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大, 所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。
关键词: 斑节对虾, 天门冬氨酸转氨酶, 氨氮胁迫, 基因克隆, 组织表达
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