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斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析
周凯敏, 江世贵, 黄建华, 杨其彬, 姜松, 邱丽华, 杨丽诗, 周发林
2017, 13(4): 59-68. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.04.008
研究以斑节对虾(Penaeus monodon)转录组获得的几丁质酶基因(PmChi)片段,运用RACE技术克隆了PmChi基因cDNA全长,命名为PmChi-2。PmChi-2基因cDNA全长2 050 bp,其中5′-非编码区(5′-UTR)144 bp、3′-UTR 319 bp和开放阅读框(ORF)1 587 bp,编码528个氨基酸。生物信息学分析显示,PmChi-2与其他甲壳动物Chi-2的相似性为78%~97%。实时荧光定量PCR结果显示,PmChi-2在蜕皮前期(D期)表皮中表达水平最高,在胃、鳃、腹神经节和眼柄中表达水平依次降低,在其他组织(肝胰腺、肠、肌肉、心脏)中几乎不表达。不同蜕皮阶段,PmChi-2在鳃、胃和表皮3种组织中的表达变化模式基本一致,均在蜕皮期(E期)表达量最低,而最高表达量在鳃中出现在蜕皮后期(A期),在胃和表皮中为D期。幼体不同发育阶段分析揭示PmChi-2 mRNA在幼体发育阶段的无节幼体到糠虾幼体第二期表达量维持在一个低水平,在糠虾幼体第三期PmChi-2 mRNA表达水平显著升高,在仔虾期又显著下降,推测PmChi-2 mRNA可能与斑节对虾幼体发育密切相关。研究结果表明PmChi-2基因可能在斑节对虾蜕皮以及幼体的变态发育中发挥重要作用,为深入研究斑节对虾几丁质酶发育调控提供了重要信息。
关键词: 斑节对虾, 几丁质酶, 基因克隆, 表达分析, 蜕皮, 变态
斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析
刘倩, 江世贵, 邱丽华, 黄建华, 周发林, 杨其彬, 姜松, 杨丽诗
2017, 13(5): 63-71. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.05.009
Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体, 在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(PmToll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型, 通过免疫印迹方法证实PmToll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处PmToll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。qRT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路, 促进通路下游髓样分化因子(MyD88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达, 同时酶联免疫吸附测定结果证明PmToll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活PmToll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达, 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制PmToll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过PmToll9激活Toll信号通路, 引起机体免疫防御反应, 而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。
关键词: 斑节对虾, Toll受体蛋白, 细胞免疫模型, TLR信号通路, 微生物刺激, 先天性免疫
斑节对虾CDC42基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析
李丽丽, 赵超, 范嗣刚, 王鹏飞, 闫路路, 邱丽华
2018, 14(4): 37-45. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.04.005
细胞分裂周期蛋白42 (CDC42)是一类广泛表达的小三磷酸鸟苷 (GTP)酶,是Ras家族内Rho亚家族的成员之一,具有GTP酶活性。CDC42在细胞吞噬和炎症发生等先天免疫中发挥着不可替代的功能。该研究通过RACE技术克隆得到了斑节对虾(Penaeus monodon)细胞分裂周期蛋白42 (PmCDC42)基因cDNA全长。生物信息学分析结果表明PmCDC42全长2 233 bp,包括59 bp的5' 非编码区 (UTR)、1 598 bp的3'UTR和576 bp的开放阅读框 (ORF),编码191个氨基酸。通过实时定量PCR技术,研究了PmCDC42在斑节对虾各组织的表达模式,并研究了其在不同pH、盐度、重金属镉(Cd)和哈维弧菌 (Vibrio harveyi)胁迫下的表达情况。结果显示,PmCDC42基因在各组织中均有表达,在血淋巴中的表达量最高。在pH和Cd胁迫下PmCDC42表达量显著升高;在高盐胁迫下PmCDC42表达量上调,低盐胁迫下PmCDC42表达量变化不显著;在哈维弧菌的刺激下PmCDC42上调表达极显著。这表明PmCDC42在斑节对虾先天免疫中起重要作用。
关键词: 斑节对虾, 细胞分裂周期蛋白42, pH, 盐度, , 哈维弧菌
华贵栉孔扇贝MSTN基因启动子的功能分析
范嗣刚, 赵超, 王鹏飞, 闫路路, 邱丽华
2019, 15(1): 63-68. doi: 10.12131/20180182
为了解肌肉生长抑制素myostatin (MSTN)在华贵栉孔扇贝(Chalmys nobilis)闭壳肌肌肉生长和发育过程中所起的负调控作用,对华贵栉孔扇贝的MSTN启动子序列进行了生物信息学分析。结果显示,MSTN启动子序列长1 358 bp,有4个转录起始位点。核心启动子区为–100~–51 bp。有1个TATA-box (–92~–86 bp)和2个E-box等顺式作用元件;潜在的转录因子结合位点有MEF2、MEF3、FoxO、MTBF和MyoD等;启动子区域无CpG岛。成功构建了6个MSTN启动子不同长度片段的荧光素酶表达载体,瞬时转染到293T细胞并进行双荧光素酶报告基因活性检测,表明6个启动子片段均有转录活性,PGL-534的活性最高,其次为PGL-274、PGL-22和PGL-102,最低的为PGL-995。–216~–364区域可能存在负调控基因表达的转录因子结合位点,–364~–825区域可能存在正调控基因表达的转录因子结合位点。
关键词: 华贵栉孔扇贝, MSTN, 启动子, 瞬时转染, 功能分析
花鲈irak4基因cDNA的克隆与表达分析
李富祥, 王鹏飞, 闫路路, 邱丽华
2018, 14(5): 70-79. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.05.009
Toll样受体家族信号通路参与了机体特异性免疫和先天性免疫过程,白介素1受体相关激酶4 (IRAK4)是Toll样受体家族信号通路中的重要成员之一。该研究克隆了花鲈(Lateolabrax maculatus) lmirak4序列,并分析了其序列特征、表达模式及亚细胞定位。Lmirak4基因cDNA开放阅读框(ORF)全长942 bp,编码313个氨基酸,含有1个N端死亡结构域和1个中央蛋白激酶结构域。推导的Lmirak4氨基酸序列与其他鱼类Irak4氨基酸序列具有高度一致性。组织分布结果显示,lmirak4在各组织中表达具有差异性,在头肾中表达量最高。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)与哈维弧菌(Vibrio harveyi)后,花鲈头肾、肝脏和脾脏中lmirak4 mRNA的表达水平显著增加。亚细胞定位显示,外源性Lmirak4主要分布于HEK-293T细胞质中,在花鲈头肾原代培养细胞中成功表达但无明显分布差异。
关键词: 花鲈, irak4, 无乳链球菌, 哈维弧菌, 细胞转染
斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选
刘恩瑞, 赵超, 王鹏飞, 范嗣刚, 闫路路, 邱丽华
2019, 15(4): 88-98. doi: 10.12131/20180285
凋亡抑制因子1 (tumor protein p53 regulated inhibitor of apoptosis 1, TRIAP1)可以通过抑制细胞凋亡参与生物体内应激反应。为探究TRIAP1基因及调控其表达的miRNAs在斑节对虾 (Penaeus monodon) 应对哈氏弧菌(Vibrio harveyi)刺激时的表达调控情况,该研究通过RACE技术获得了斑节对虾TRIAP1基因(PmTRIAP1)cDNA全长序列,并利用实时荧光定量PCR (qRT-PCR)技术,对PmTRIAP1在斑节对虾不同组织中的表达分布模式,以及哈氏弧菌刺激下PmTRIAP1与相关miRNAs的表达关联情况进行了探究。结果显示,PmTRIAP1 cDNA全长2 522 bp,包括11 bp的5'非编码区(UTR)、2 289 bp的3'UTR和222 bp的开放阅读框(ORF),共编码73个氨基酸。PmTRIAP1基因在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高;哈氏弧菌刺激下,PmTRIAP1表达量显著降低,而Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p表达量显著升高,表明PmTRIAP1和Pm-miR-145-3p、Pm-miR-454-3p的表达量呈负相关关系;双荧光素酶报告实验结果显示,Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p可通过结合PmTRIAP1 3'UTR降低荧光素酶活性,表明Pm-miR-145-3p和Pm-miR-454-3p均可靶向调控PmTRIAP1的表达。
关键词: 斑节对虾, TRIAP1, Pm-miR-145-3p, Pm-miR-454-3p, 哈氏弧菌