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添加外源酶类对腌制罗非鱼品质的影响

吴燕燕 赵志霞 李来好 郝淑贤 邓建朝 胡晓

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添加外源酶类对腌制罗非鱼品质的影响

    作者简介: 吴燕燕(1969 — ),女,博士,研究员,从事水产品加工与质量安全控制研究。E-mail: wuyygd@163.com;
  • 中图分类号: TS 254.4

Effect of adding exogenous enzymes on quality of pickled tilapia

  • CLC number: TS 254.4

  • 摘要: 为探究添加风味蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶对罗非鱼(Oreochromis mossambicus)腌制品质的影响,文章研究了添加酶制剂对腌制罗非鱼的氨基酸态氮含量、脂肪酸组成及感官分析的影响,并比较新鲜罗非鱼、食盐腌制组、低盐加酶腌制组中鱼肉挥发性风味物质的变化。结果表明,风味蛋白酶的最适质量分数为0.010 0%,氨基酸态氮质量分数为0.75 mg·g–1,比对照组高19.05%,饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)相对含量分别为35.65%、23.78%和40.57%,感官评分为89,比对照组高10.56%;中性蛋白酶的最适质量分数为0.010 0%,此时氨基酸态氮质量分数为0.81 mg·g–1,比对照组高28.57%,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为34.24%、24.82%和40.94%,感官评分为88.5,比对照组高10.63%;脂肪酶的最适质量分数为0.010 0%,此时鱼肉的氨基酸态氮质量分数为0.67 mg·g–1,比对照组高4.69%,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为33.97%、22.20%和43.85%,感官评分88.5,比对照组高11.32%。按照3种外源酶最适浓度混合腌制,实验证明能增加风味物质的生成(尤其是醇类、酮类),有效提高腌制效率,改善腌制罗非鱼的风味。
  • 图 1  不同浓度风味蛋白酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮及感官评分的影响

    Figure 1.  Effects of different additive amounts of flavor protease on amino nitrogen and sensory evaluation of pickled tilapia

    图 2  不同浓度中性蛋白酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮及感官评分的影响

    Figure 2.  Effects of diferent amounts of neutral protease on amino nitrogen and sensory evaluation of pickled tilapia

    图 3  不同浓度脂肪酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮及感官评分的影响

    Figure 3.  Effects of different amounts of lipase on amino nitrogen and sensory evaluation of pickled tilapia

    表 1  感官评价标准

    Table 1.  Sensory evaluation criteria

    程度
    level
    滋味 taste
    肉香味
    meat flavour
    鱼香味
    fish flavour
    脂肪味
    fatty flavour
    鲜味
    umami
    苦涩味
    bitter taste
    酸味
    sour
    腥味
    fishy smell
    略微识别 slightly recognized 0 0 10 0 10 10 10
    刚好识别 just recognized 2 2 8 2 8 8 8
    弱 weak 4 4 6 4 6 6 6
    中等 medium 6 6 4 6 4 4 4
    强 strong 8 8 2 8 2 2 2
    很强 very strong 10 10 0 10 0 0 0
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    表 2  不同浓度风味蛋白酶对腌制罗非鱼的脂肪酸组成影响

    Table 2.  Fatty acid composition of preserved tilapia at different concentrations of flavor protease

    脂肪酸
    fatty acid
    风味蛋白酶添加量/%
    different additive amount of flavor protease
    0.000 0 0.001 0 0.005 0 0.010 0 0.050 0
    十一烷酸 (C11∶0) undecanoic acid 3.63 1.44 4.45 2.05 0.94
    月桂酸 (C12∶0) lauric acid 0.08 0.07 0.06 0.08 0.10
    肉豆蔻酸 (C14∶0) myristic acid 1.92 1.80 1.94 1.51 1.90
    十五烷酸 (C15∶0) pentadecanoic acid 0.68 0.63 0.60 0.40 0.45
    棕榈酸 (C16∶0) palmitic acid 19.42 19.20 18.72 22.15 20.00
    十七烷酸 (C17∶0) heptadecanoic acid 0.86 0.81 0.71 0.52 0.60
    硬脂酸 (C18∶0) stearic acid 9.59 9.73 9.07 8.95 9.48
    花生酸 (C20∶0) arachidic acid 0.15 0.15 0.11
    棕榈油酸 (C16∶1) palmitoleic acid 3.33 4.33 3.17 3.10 4.23
    十七烯酸 (C17∶1) heptadecenoic acid 0.14 0.12 0.59 0.10 0.11
    油酸 (C18∶1) oleic acid 18.47 18.79 17.70 19.42 12.00
    二十烯酸 (C20∶1) eicosenoic acid 1.45 1.28 1.54 1.16 0.88
    芥酸 (C22∶1) erucic acid 0.24
    亚油酸 (C18∶2) linoleic acid 12.58 13.46 12.46 13.93 19.88
    二十碳二烯酸 (C20∶2) eicosadienoic acid 2.04 1.23 1.15 1.05 0.96
    二十碳三烯酸 (C20∶3) eicosatrienoic acid 1.84 2.24 2.25 2.12 2.31
    二十碳四烯酸 (C20∶4) arachidonic acid 4.67 9.10 9.67 8.83 8.05
    二十碳五烯酸 (C20∶5) eicosapentaenoic acid 4.98 3.05 4.39 1.17 2.05
    二十一碳四烯酸 (C21∶4) heneicosatetraenoic acid 2.52 2.74 2.48 2.13 2.60
    二十一碳五烯酸 (C21∶5) heneicosapentaenoic acid 0.00 2.25 2.26 3.39
    二十二碳六烯酸 (C22∶6) docosahexaenoic acid 11.80 13.28 9.82 9.06 11.10
    饱和脂肪酸 SFA 36.18 28.78 35.54 35.65 33.47
    单不饱和脂肪酸 MUFA 23.39 23.87 22.24 23.78 17.22
    多不饱和脂肪酸 PUMA 40.42 47.35 42.22 40.57 49.31
     注:–. 未检测出,后表同此  Note: –. undetected; the same case in the following tables.
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    表 3  不同浓度中性蛋白酶腌制罗非鱼的脂肪酸组成

    Table 3.  Fatty acid composition of preserved tilapia at different concentrations of flavor protease

    脂肪酸
    fatty acid
    中性蛋白酶添加量/%
    different additive amount of flavor protease
    0.000 0 0.001 0 0.005 0 0.010 0 0.050 0
    十一烷酸 (C11∶0) undecanoic acid 0.66 0.68 1.30 0.67 2.26
    月桂酸 (C12∶0) lauric acid 0.12 0.14 0.11 0.11 0.06
    肉豆蔻酸 (C14∶0) myristic acid 2.34 2.60 2.22 2.25 1.83
    十五烷酸 (C15∶0) pentadecanoic acid 0.63 0.65 0.60 0.60 0.50
    棕榈酸 (C16∶0) palmitic acid 20.31 21.27 21.58 20.81 18.69
    十七烷酸 (C17∶0) heptadecanoic acid 1.28 1.03 1.05 1.15 0.60
    硬脂酸 (C18∶0) stearic acid 8.78 7.99 8.87 8.66 9.09
    花生酸 (C20∶0) arachidic acid 0.13 0.12
    棕榈油酸 (C16∶1) palmitoleic acid 6.38 6.43 5.15 5.16 3.33
    十七烯酸 (C17∶1) heptadecenoic acid 0.17 0.16 0.17 0.16 0.11
    油酸 (C18∶1) oleic acid 19.76 19.97 24.24 19.03 23.17
    十九碳烯酸 (C19∶1) nonadecenoic acid 0.12
    二十烯酸 (C20∶1) eicosenoic acid 0.95 0.96 3.25
    十六碳二烯酸 (C16∶2) hexadecadienoic acid 0.36 0.13 0.11
    亚油酸 (C18∶2) linoleic acid 10.52 11.17 12.57 12.71 13.25
    亚麻酸 (C18∶3) linolenic acid 0.27 0.43 0.20 0.32 0.30
    二十碳二烯酸 (C20∶2) eicosadienoic acid 0.88 0.83 1.33 1.05 1.69
    二十碳三烯酸 (C20∶3) eicosatrienoic acid 1.80 1.67 2.03 2.05 2.31
    二十碳四烯酸 (C20∶4) arachidonic acid 6.57 6.33 4.30 4.10 9.00
    二十碳五烯酸 (C20∶5) eicosapentaenoic acid 3.31 4.95 2.94 3.86 2.44
    二十一碳四烯酸 (C21∶4) heneicosatetraenoic acid 1.84 1.60 2.14 4.82 2.47
    二十一碳五烯酸 (C21∶5) heneicosapentaenoic acid 3.71 3.01 4.27 2.59
    二十二碳三烯酸 (C22∶3) docosatrienoic acid 1.08 1.01 0.40
    二十二碳六烯酸 (C22∶6) docosahexaenoic acid 11.93 11.60 11.47 9.90 8.86
    饱和脂肪酸 SFA 34.12 34.35 31.29 34.24 28.45
    单不饱和脂肪酸 MUFA 26.37 26.56 30.04 24.82 29.86
    多不饱和脂肪酸 PUMA 39.51 39.09 38.67 40.94 41.69
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    表 4  不同浓度脂肪酶腌制罗非鱼的脂肪酸组成

    Table 4.  Fatty acid composition of preserved tilapia at different concentrations of lipase

    脂肪酸
    fatty acid
    脂肪酶添加量/%
    different additive amount of lipase
    0.000 0 0.001 0 0.005 0 0.010 0 0.050 0
    十一烷酸 (C11∶0) undecanoic acid 0.52 0.57 1.40 0.43 0.72
    月桂酸 (C12∶0) lauric acid 0.14 0.12 0.13 0.12 0.11
    肉豆蔻酸 (C14∶0) myristic acid 2.20 2.19 1.92 1.81 2.05
    十五烷酸 (C15∶0) pentadecanoic acid 0.50 0.51 0.61 0.57 0.37
    棕榈酸 (C16∶0) palmitic acid 22.09 22.50 21.87 20.68 20.11
    十七烷酸 (C17∶0) heptadecanoic acid 0.58 0.60 0.68 0.67 0.50
    硬脂酸 (C18∶0) stearic acid 9.72 10.55 9.68 9.71 9.59
    棕榈油酸 (C16∶1) palmitoleic acid 4.39 3.28 2.62 2.83 3.16
    十七烯酸∶(C17∶1) heptadecenoic acid 0.07 0.08 0.09 0.11 0.07
    油酸 (C18∶1) oleic acid 19.63 19.93 24.19 19.26 20.22
    二十烯酸 (C20∶1) eicosenoic acid 0.98 1.01
    十六碳二烯酸 (C16∶2) hexadecadienoic acid 0.12 0.09 0.14 0.10
    亚油酸 (C18∶2) linoleic acid 15.92 16.31 15.55 16.32 16.98
    亚麻酸 (C18∶3) linolenic acid 0.14 0.33
    二十碳二烯酸 (C20∶2) eicosadienoic acid 1.06 1.20 1.26 1.17 1.24
    二十碳三烯酸 (C20∶3) eicosatrienoic acid 1.78 1.94 2.04 2.17 2.19
    二十碳四烯酸 (C20∶4) arachidonic acid 7.24 4.18 3.95 4.54 4.71
    二十碳五烯酸 (C20∶5) eicosapentaenoic acid 3.31 3.29 2.11 3.44 2.40
    二十一碳四烯酸 (C21∶4) heneicosatetraenoic acid 1.65 1.65 4.69 4.69 5.51
    二十一碳五烯酸 (C21∶5) heneicosapentaenoic acid 2.61 2.50 1.63
    二十二碳三烯酸 (C22∶3) docosatrienoic acid 8.39 1.04 0.96
    二十二碳六烯酸 (C22∶6) docosahexaenoic acid 9.20 6.90 9.67 9.16 7.01
    饱和脂肪酸 SFA 35.74 37.05 31.46 33.97 33.46
    单不饱和脂肪酸 MUFA 24.09 23.25 27.35 22.20 24.43
    多不饱和脂肪酸 PUMA 40.17 39.70 41.20 43.85 42.11
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    表 5  不同腌制条件下罗非鱼的挥发性物质成分

    Table 5.  Volatile components of tilapia under different curing conditions

    名称
    name
    相对含量/% relative content
    新鲜鱼组
    fresh fish group
    低盐腌制组
    low-salt curing group
    低盐加酶腌制组
    low-salt enzymatic curing group
    正己醇 N-hexanol 0.31 1.08 0.12
    2-丁氧基乙醇 2-butoxyethanol 8.31
    1-辛烯-3-醇 1-octen-3-ol 2.66 3.72 4.31
    庚醇 1-heptanol 0.34 0.43 0.17
    2-乙基己醇 2-ethyl hexanol 2.60 2.59 1.26
    苯甲醇 benzyl alcohol 0.54
    正辛醇 1-octanol 0.80
    正丁醇 1-butanol 0.35 0.43
    1-戊烯-3-醇 1-penten-3-ol 0.42 0.28
    1-戊醇 1-pentanol 3.17
    1-辛醇 1-octanol 0.68 0.31
    2,3-丁二醇 2,3-butanediol 0.17 0.18
    反式-2-辛烯-1-醇 trans-2-octen-1-ol 0.89
    1-壬醇 1-nonanol 0.21
    十二醇 1-dodecanol 0.17
    1,4-丁二醇 1,4-butanediol 0.18
    己醛 hexanal 5.36 10.34 10.24
    庚醛 heptaldehyde 0.68
    辛醛 octanal 2.50 2.27 6.09
    壬醛 1-nonanal 6.71 5.32
    癸醛 decanal 1.59 1.12
    苯甲醛 benzaldehyde 0.41 0.24
    反式-2-壬烯醛 (E)-2-nonenal
    2,3-辛二酮 2,3-octadione 0.80
    6-甲基-5-庚烯-2-酮 6-methyl-5-hepten-2-one 0.56
    3-羟基-2-丁酮 3-hydroxy-2-butanone 0.39
    香叶基丙酮 geranylacetone
    苯乙酮 acetophenone 0.18
    十二烷 dodecane 0.35
    十三烷 tridecane
    十四烷 tetradecane 0.57
    十五烷 pentadecane 0.17
    十六烷 hexadecane 5.09 1.15
    十七烷 heptadecane 3.20
    二十一烷 heneicosane 1.43 3.01
    二十八烷 octacosane 0.24 0.35
    2,6,10-三甲基-十五烷 2,6,10-trimethyl-pentadecan 3.25 0.61 2.24
    8-己基-十五烷 8-hexylpentadecane 0.30
    2,6,10,14-四甲基十五烷 2,6,10,14-tetramethylpentadecane 12.92 2.74 6.40
    2,6,10,14-四甲基十六烷 2,6,10,14-tetramethylhexadecane 16.53 2.72 6.63
    2-甲基十六烷 2-methylhexadecane 0.30
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-02-11
  • 录用日期:  2018-04-04
  • 刊出日期:  2018-08-01

添加外源酶类对腌制罗非鱼品质的影响

    作者简介:吴燕燕(1969 — ),女,博士,研究员,从事水产品加工与质量安全控制研究。E-mail: wuyygd@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学食品学院,上海 201306

摘要: 为探究添加风味蛋白酶、中性蛋白酶、脂肪酶对罗非鱼(Oreochromis mossambicus)腌制品质的影响,文章研究了添加酶制剂对腌制罗非鱼的氨基酸态氮含量、脂肪酸组成及感官分析的影响,并比较新鲜罗非鱼、食盐腌制组、低盐加酶腌制组中鱼肉挥发性风味物质的变化。结果表明,风味蛋白酶的最适质量分数为0.010 0%,氨基酸态氮质量分数为0.75 mg·g–1,比对照组高19.05%,饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)、单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA)和多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)相对含量分别为35.65%、23.78%和40.57%,感官评分为89,比对照组高10.56%;中性蛋白酶的最适质量分数为0.010 0%,此时氨基酸态氮质量分数为0.81 mg·g–1,比对照组高28.57%,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为34.24%、24.82%和40.94%,感官评分为88.5,比对照组高10.63%;脂肪酶的最适质量分数为0.010 0%,此时鱼肉的氨基酸态氮质量分数为0.67 mg·g–1,比对照组高4.69%,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为33.97%、22.20%和43.85%,感官评分88.5,比对照组高11.32%。按照3种外源酶最适浓度混合腌制,实验证明能增加风味物质的生成(尤其是醇类、酮类),有效提高腌制效率,改善腌制罗非鱼的风味。

English Abstract

  • 罗非鱼(Oreochromis mossambicus),俗称非洲鲫、越南鱼等,是世界重要经济鱼类之一。罗非鱼富含蛋白质、多种不饱和脂肪酸及矿物质,肉质鲜美,成为联合国粮农组织(FAO)向全世界推广的优良品种之一。据FAO数据显示,2015年全球罗非鱼产量约为640×104t,产值超过98×108美元,国际贸易额超过18×108美元,其中中国为世界最大的罗非鱼生产国、消费国、出口国,罗非鱼已经成为全世界重要的鱼肉消费品[1]

    鲜活罗非鱼富含营养物质及水分,体内存在的内源水解酶能降解肌原蛋白,使鱼肉疏松,影响口感,且容易发生其他化学、物理、生物反应,导致腐败变质[2]。传统腌制可以部分去除罗非鱼体内水分,延长保质期;而在腌制过程中添加外源酶,可以提高腌制效率,也能促进产品风味物质的形成,改良腌制产品口感。封莉等[3]研究了脂肪酶对中式香肠脂肪氧化、脂质降解、挥发性风味物质和感官品质的影响,发现添加脂肪酶能有效地加速中式香肠的脂肪氧化和脂肪降解,促进挥发性风味物质的生成;添加外源脂肪酶能使香肠香气显著增强,且不影响香肠的感官品质,然而添加过量的外源脂肪酶会导致香肠过度氧化,影响感官品质。朱建军等[4]在腊肉加工过程中添加中性蛋白酶和木瓜蛋白酶,发现添加酶的样品中挥发性盐基氮、非蛋白氮、氨基酸态氮的含量及游离氨基酸种类、总量均高于未加酶样品,此外添加酶的样品中有65种挥发性风味物质,比对照组多10种。Ansorena等[5]研究发现加入脂肪酶和蛋白酶的发酵香肠在第21天达到成熟,而未加酶的对照组在第35天才成熟。Feng等[6]硏究了风味蛋白酶添加量对中式香肠蛋白质降解、抗氧化能力和感官品质的影响,结果显示添加外源风味蛋白酶能有效地加速中式香肠中蛋白的降解,香肠的水分活度会降低、抗氧化能力提高,且香气、质地等感官品质也有所改善。Broncano等[7]将3种不同的蛋白水解酶添加到香肠中,发现加酶香肠组提取物的抗氧化能力显著增强,其硫代巴比妥酸值和己酸含量显著低于对照组,表明添加酶能抑制发酵香肠的脂质氧化。本研究分析了中性蛋白酶、风味蛋白酶、脂肪酶等外源酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮、脂肪酸的影响,并探究外源酶的最适添加量,揭示外源酶对腌制罗非鱼产品品质的影响,为其开发利用提供技术和理论依据。

    • 鲜活罗非鱼(购于广州市华润万家客村店,活鱼约500 g);风味蛋白酶(酶活2×104 U·g–1,南宁庞博生物工程有限公司),中性蛋白酶(酶活20×104 U·g–1,南宁庞博生物工程有限公司),脂肪酶(酶活2×104 U·g–1,南宁庞博生物工程有限公司);甲醛(购自天津市福晨化学试剂厂),甲醇(购自天津市富宇精细化工有限公司),正己烷(购自天津市富宇精细化工有限公司),其余均为实验室常用试剂,分析纯;809Titrando自动电位滴定仪(瑞士Metrohm公司),T50均质机(德国IKA公司),3K30台式高速冷冻离心机(德国Sigma公司),GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪(日本岛津公司),N-EVAP24氮吹仪(美国ORGANOMATION公司)。

    • 将新鲜罗非鱼去鳃、鳞、内脏,用清水将残留在鱼体内的血污以及其他杂物洗净,沿背脊剖开成2片,单片120 g,用滤纸吸干水分。按照食盐水浓度2.22 mol·L–1、料液比 [w (鱼片,g)∶V (腌制液,mL)] 为1∶3.4、加入适量的酶制剂(酶制剂添加步骤及用量详见1.2.2),(15±2) ℃腌制2.5 h[8]

    • 各种酶不同添加量实验组分别为将风味蛋白酶按照0.000 0%、0.001 0%、0.005 0%、0.010 0%、0.050 0% (酶制剂质量/腌制液体积)的添加量,在腌制过程中分别和腌制剂一起加入样品中;中性蛋白酶、脂肪酶均重复上述风味蛋白酶的步骤加入样品中进行腌制。不同腌制方式的对比实验分为新鲜鱼组、低盐腌制组和低盐加酶腌制组(在低盐腌制组的基础上,添加最优水平的酶制剂进行腌制)。

    • 按照GB/T 5009.235—2016《食品中氨基酸态氮的测定》测定。

    • 参考杨贤庆等[9]的方法,略作修改。称量5.0 g搅碎的鱼肉于离心管中,加入15 mL V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1溶液,冰浴中置于分散均质机匀浆2次(10 000 r·min–1,2×15 s,间隔30 s)。转入50 mL具塞量筒中定容,静置1 h过滤,将下层脂质液体转移到45 mL离心管内,用氮气吹打有机试剂,得到浓缩的脂质。将得到的浓缩脂质加入2 mL 14%三氟甲硼-甲醇溶液,进行甲酯化反应30 min (60 ℃水浴),冷却至室温,分别加入1 mL正己烷和蒸馏水,振荡1 min,静置分层后,吸取上层有机层,用正己烷定容,过0.22 μm有机滤膜后,采用岛津GC-MS分析,并采用机带软件数据分析。

      GC条件为DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25 μm);进样口温度230 ℃;升温程序为110 ℃保持4 min,以10 ℃·min–1升温到160 ℃,保持1 min,最后以5 ℃·min–1升到240 ℃,保持15 min;载气为氦气,流量为1.52 mL·min–1;采用恒线速度,分流比为1∶30;进样量1 μL。

      MS条件为离子源温度200 ℃;电子能量70 eV;质量扫描范围m/z 40~550;溶剂切除时间3 min。

    • 将实验样品随机编码,采用水蒸方式蒸熟,蒸5 min。按照表1的感官评价参考标准,评定人员对样品进行感官评价。评定人员经过食品感官培训,每次10 人(5男5女)参加,评定3次,评定前用清水漱口,评定人员之间不互相交换意见。

      程度
      level
      滋味 taste
      肉香味
      meat flavour
      鱼香味
      fish flavour
      脂肪味
      fatty flavour
      鲜味
      umami
      苦涩味
      bitter taste
      酸味
      sour
      腥味
      fishy smell
      略微识别 slightly recognized 0 0 10 0 10 10 10
      刚好识别 just recognized 2 2 8 2 8 8 8
      弱 weak 4 4 6 4 6 6 6
      中等 medium 6 6 4 6 4 4 4
      强 strong 8 8 2 8 2 2 2
      很强 very strong 10 10 0 10 0 0 0

      表 1  感官评价标准

      Table 1.  Sensory evaluation criteria

    • 准确称取绞碎的鱼肉样品 2.00 g于15 mL顶空瓶中,加入 5 mL饱和氯化钠(NaCl)溶液,加入磁转子,于 65 ℃磁力搅拌器上加热平衡10 min后,用已活化好的 65 μm PDMS/DVB 萃取头顶空吸附40 min,迅速将萃取头插入气相色谱仪的进样口,解吸10 min。

      气相色谱条件为采用Rtx®-WAX (30 m×0.25 mm,0.25 μm)色谱柱;进样口温度为250 ℃,载气(He)流速 1.0 m L·min–1,采用恒线速度,分流比为1∶20;程序升温为柱初温40 ℃,保持 2 min,以 6 ℃·min–1的速度升温至200 ℃,保持3 min,再以10 ℃·min–1上升至250 ℃,保持3 min;质谱条件为离子源温度230 ℃,电子能量为70 eV;质量扫描范围m/z 35~350。

      数据处理与质谱检索是利用计算机NIST 05a.L普库数据库检索,通过对质谱图库中的标准谱图进行比较,并结合有关文献进行人工谱图解析挥发性成分,此外通过Excel 2010软件,按面积归一化法进行分析,得到各成分的相对百分含量,检测的数据用平均值表示。

    • 饱和脂肪酸(saturated fatty acids,SFA)是机体主要的功能物质,能提供机体生命活动所需要的能量;不饱和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA)具有降低低密度脂蛋白胆固醇的作用,能预防动脉硬化及胆固醇等疾病[10]。n-3长链多不饱和脂肪酸,尤其是二十碳五烯酸(eicosapntemacnioc acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)对人体营养健康有重要作用。不同浓度的风味蛋白酶对腌制罗非鱼的脂肪酸组成影响见表2。棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)为主要的SFA,棕榈油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)为主要的单不饱和脂肪酸(monounsaturated fatty acids,MUFA),亚油酸(C18∶2)、DHA (C22∶6)为主要的多不饱和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PUFA)。添加不同浓度的风味蛋白酶腌制罗非鱼后,与对照组相比,SFA的相对含量均略有降低,而PUFA的相对含量均略有所升高。这可能是由于不同的游离脂肪酸的降解速率使其在产品中最终含量有所不同,不同的游离脂肪酸易被氧化的程度也有所不同[11]。当风味蛋白酶添加量为0.001 0%时,UFA的相对含量最高,SFA的相对含量较低,其中PUFA相对含量为47.35%,SFA相对含量为28.78%,此时鱼肉中存在更多的有益于人体健康的n-3长链多不饱和脂肪酸,其中EPA相对含量为3.05%,DHA相对含量为13.28%。

      脂肪酸
      fatty acid
      风味蛋白酶添加量/%
      different additive amount of flavor protease
      0.000 0 0.001 0 0.005 0 0.010 0 0.050 0
      十一烷酸 (C11∶0) undecanoic acid 3.63 1.44 4.45 2.05 0.94
      月桂酸 (C12∶0) lauric acid 0.08 0.07 0.06 0.08 0.10
      肉豆蔻酸 (C14∶0) myristic acid 1.92 1.80 1.94 1.51 1.90
      十五烷酸 (C15∶0) pentadecanoic acid 0.68 0.63 0.60 0.40 0.45
      棕榈酸 (C16∶0) palmitic acid 19.42 19.20 18.72 22.15 20.00
      十七烷酸 (C17∶0) heptadecanoic acid 0.86 0.81 0.71 0.52 0.60
      硬脂酸 (C18∶0) stearic acid 9.59 9.73 9.07 8.95 9.48
      花生酸 (C20∶0) arachidic acid 0.15 0.15 0.11
      棕榈油酸 (C16∶1) palmitoleic acid 3.33 4.33 3.17 3.10 4.23
      十七烯酸 (C17∶1) heptadecenoic acid 0.14 0.12 0.59 0.10 0.11
      油酸 (C18∶1) oleic acid 18.47 18.79 17.70 19.42 12.00
      二十烯酸 (C20∶1) eicosenoic acid 1.45 1.28 1.54 1.16 0.88
      芥酸 (C22∶1) erucic acid 0.24
      亚油酸 (C18∶2) linoleic acid 12.58 13.46 12.46 13.93 19.88
      二十碳二烯酸 (C20∶2) eicosadienoic acid 2.04 1.23 1.15 1.05 0.96
      二十碳三烯酸 (C20∶3) eicosatrienoic acid 1.84 2.24 2.25 2.12 2.31
      二十碳四烯酸 (C20∶4) arachidonic acid 4.67 9.10 9.67 8.83 8.05
      二十碳五烯酸 (C20∶5) eicosapentaenoic acid 4.98 3.05 4.39 1.17 2.05
      二十一碳四烯酸 (C21∶4) heneicosatetraenoic acid 2.52 2.74 2.48 2.13 2.60
      二十一碳五烯酸 (C21∶5) heneicosapentaenoic acid 0.00 2.25 2.26 3.39
      二十二碳六烯酸 (C22∶6) docosahexaenoic acid 11.80 13.28 9.82 9.06 11.10
      饱和脂肪酸 SFA 36.18 28.78 35.54 35.65 33.47
      单不饱和脂肪酸 MUFA 23.39 23.87 22.24 23.78 17.22
      多不饱和脂肪酸 PUMA 40.42 47.35 42.22 40.57 49.31
       注:–. 未检测出,后表同此  Note: –. undetected; the same case in the following tables.

      表 2  不同浓度风味蛋白酶对腌制罗非鱼的脂肪酸组成影响

      Table 2.  Fatty acid composition of preserved tilapia at different concentrations of flavor protease

      氨基酸态氮表示蛋白质的水解程度,蛋白质水解程度将影响产品滋味及挥发性物质的生成。氨基酸态氮浓度较低,水解程度较低,挥发性物质生成较少,滋味不足;氨基酸态氮浓度较高,水解程度较高,则会出现疏水氨基酸及肽的苦味,不利于产品的感官[12]。未添加风味蛋白酶时,氨基酸态氮质量分数为0.63 mg·g–1,随着风味蛋白酶的加入,当添加量为0.010 0%,氨基酸态氮激增到0.75 mg·g–1 (图1)。其原因可能是风味蛋白酶与底物迅速结合催化,游离氨基酸增多,氨基酸态氮水平急剧增加[13]。无风味蛋白酶添加时,感官评定鲜味较低,腥味较重,随着风味蛋白酶的加入,鲜味、鱼香味逐渐明显,且在风味蛋白酶添加量为0.010 0%时,出现感官评分最高值(89),此时的肉香味、鱼香味、鲜味明显。风味蛋白酶添加量为0.050 0%时,感官评分下降到78.5,此时略显苦涩味。其原因可能是过多的蛋白质水解程度过高,疏水氨基酸及肽的苦味影响产品滋味,导致感官下降[14]。这与Zhang等[13]的结果一致,添加过量的风味蛋白酶会有不良的口感。

      图  1  不同浓度风味蛋白酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮及感官评分的影响

      Figure 1.  Effects of different additive amounts of flavor protease on amino nitrogen and sensory evaluation of pickled tilapia

      综合上述脂肪酸、氨基酸态氮和感官分析,风味蛋白酶添加量为0.010 0%,UFA与SFA的比例较高,且n-3长链多不饱和脂肪酸含量高,氨基酸态氮质量分数为0.75 mg·g–1,感官评价处于上升阶段,鲜味、鱼香味、肉香味充足;当风味蛋白酶添加量为0.050 0%,鱼肉水解过度,产生不良口感,因此选择风味蛋白酶最佳添加量为0.010 0%。

    • 不同浓度的中性蛋白酶对腌制罗非鱼的脂肪酸组成影响见表3。棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)为主要的SFA,棕榈油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)为主要的MUFA,亚油酸(C18∶2)、DHA (C22∶6)为主要的PUFA。随着中性蛋白酶添加量的增加,SFA大体呈现波动下降的趋势,MUFA呈现波动上升的趋势,其中棕榈油酸、DHA的相对含量一直在下降,而亚油酸的相对含量一直在上升。添加量为0.005 0%时,油酸(C18∶1)的相对含量最高(24.24%),比对照组高22.67%。中性蛋白酶添加量为0.05%时,PUFA相对含量最高(41.69%),SFA相对含量为28.45%,但此时EPA相对含量仅为2.44%,DHA相对含量仅为8.86%。

      脂肪酸
      fatty acid
      中性蛋白酶添加量/%
      different additive amount of flavor protease
      0.000 0 0.001 0 0.005 0 0.010 0 0.050 0
      十一烷酸 (C11∶0) undecanoic acid 0.66 0.68 1.30 0.67 2.26
      月桂酸 (C12∶0) lauric acid 0.12 0.14 0.11 0.11 0.06
      肉豆蔻酸 (C14∶0) myristic acid 2.34 2.60 2.22 2.25 1.83
      十五烷酸 (C15∶0) pentadecanoic acid 0.63 0.65 0.60 0.60 0.50
      棕榈酸 (C16∶0) palmitic acid 20.31 21.27 21.58 20.81 18.69
      十七烷酸 (C17∶0) heptadecanoic acid 1.28 1.03 1.05 1.15 0.60
      硬脂酸 (C18∶0) stearic acid 8.78 7.99 8.87 8.66 9.09
      花生酸 (C20∶0) arachidic acid 0.13 0.12
      棕榈油酸 (C16∶1) palmitoleic acid 6.38 6.43 5.15 5.16 3.33
      十七烯酸 (C17∶1) heptadecenoic acid 0.17 0.16 0.17 0.16 0.11
      油酸 (C18∶1) oleic acid 19.76 19.97 24.24 19.03 23.17
      十九碳烯酸 (C19∶1) nonadecenoic acid 0.12
      二十烯酸 (C20∶1) eicosenoic acid 0.95 0.96 3.25
      十六碳二烯酸 (C16∶2) hexadecadienoic acid 0.36 0.13 0.11
      亚油酸 (C18∶2) linoleic acid 10.52 11.17 12.57 12.71 13.25
      亚麻酸 (C18∶3) linolenic acid 0.27 0.43 0.20 0.32 0.30
      二十碳二烯酸 (C20∶2) eicosadienoic acid 0.88 0.83 1.33 1.05 1.69
      二十碳三烯酸 (C20∶3) eicosatrienoic acid 1.80 1.67 2.03 2.05 2.31
      二十碳四烯酸 (C20∶4) arachidonic acid 6.57 6.33 4.30 4.10 9.00
      二十碳五烯酸 (C20∶5) eicosapentaenoic acid 3.31 4.95 2.94 3.86 2.44
      二十一碳四烯酸 (C21∶4) heneicosatetraenoic acid 1.84 1.60 2.14 4.82 2.47
      二十一碳五烯酸 (C21∶5) heneicosapentaenoic acid 3.71 3.01 4.27 2.59
      二十二碳三烯酸 (C22∶3) docosatrienoic acid 1.08 1.01 0.40
      二十二碳六烯酸 (C22∶6) docosahexaenoic acid 11.93 11.60 11.47 9.90 8.86
      饱和脂肪酸 SFA 34.12 34.35 31.29 34.24 28.45
      单不饱和脂肪酸 MUFA 26.37 26.56 30.04 24.82 29.86
      多不饱和脂肪酸 PUMA 39.51 39.09 38.67 40.94 41.69

      表 3  不同浓度中性蛋白酶腌制罗非鱼的脂肪酸组成

      Table 3.  Fatty acid composition of preserved tilapia at different concentrations of flavor protease

      无中性蛋白酶添加时,鱼肉的氨基酸态氮质量分数为0.63 mg·g–1,处于较低水平,此时氨基酸的产生主要由鱼肉中的内源酶通过水解蛋白质为短肽,再分解为游离氨基酸(图2)。随着中性蛋白酶的加入,鱼肉氨基酸态氮的含量开始增多,其原因可能是中性蛋白酶迅速结合底物进行催化反应,氨基酸持续产生。随着中性蛋白酶添加量的增加,总体呈平稳上升趋势,中性蛋白酶添加量为0.010 0%时氨基酸态氮质量分数为0.81 mg·g–1,随后增加速度开始减慢,这与穆建稳等[15]研究结果一致。无中性蛋白酶添加时,鱼肉的感官较好,感官评分达到最高(88.5),此时鱼香味、鲜味、肉香味较好。中性蛋白酶添加量为0.050 0%时感官评分下降到79,其原因可能是中性蛋白酶添加量较多,水解程度大,产生不利于滋味的疏水氨基酸及短肽[16]

      图  2  不同浓度中性蛋白酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮及感官评分的影响

      Figure 2.  Effects of diferent amounts of neutral protease on amino nitrogen and sensory evaluation of pickled tilapia

      综合上述脂肪酸、氨基酸态氮和感官分析,当中性蛋白酶添加量为0.010 0%时,游离脂肪酸的相对含量较高,此时氨基酸态氮质量分数为0.81 mg·g–1,感官评分为88.5,鲜味、鱼香味充足,因此选择中性蛋白酶最佳添加量为0.010 0%。

    • 不同浓度的脂肪酶对腌制罗非鱼的脂肪酸组成影响见表4。棕榈酸(C16∶0)、硬脂酸(C18∶0)为主要的SFA,棕榈油酸(C16∶1)、油酸(C18∶1)为主要的MUFA,亚油酸(C18∶2)、DHA (C22∶6)为主要的PUFA。脂肪降解作用主要源于酶引发的水解作用和化学氧化作用,理论上游离脂肪酸的含量与脂肪酶活性相关[17]。随着脂肪酶添加量的增加,SFA大体呈现波动下降趋势,PUMA大体呈现上升趋势。脂肪酶添加量为0.010 0 %时PUFA的相对含量较高(43.85%),比对照组高9.16%,而SFA比对照组低6.38%。

      脂肪酸
      fatty acid
      脂肪酶添加量/%
      different additive amount of lipase
      0.000 0 0.001 0 0.005 0 0.010 0 0.050 0
      十一烷酸 (C11∶0) undecanoic acid 0.52 0.57 1.40 0.43 0.72
      月桂酸 (C12∶0) lauric acid 0.14 0.12 0.13 0.12 0.11
      肉豆蔻酸 (C14∶0) myristic acid 2.20 2.19 1.92 1.81 2.05
      十五烷酸 (C15∶0) pentadecanoic acid 0.50 0.51 0.61 0.57 0.37
      棕榈酸 (C16∶0) palmitic acid 22.09 22.50 21.87 20.68 20.11
      十七烷酸 (C17∶0) heptadecanoic acid 0.58 0.60 0.68 0.67 0.50
      硬脂酸 (C18∶0) stearic acid 9.72 10.55 9.68 9.71 9.59
      棕榈油酸 (C16∶1) palmitoleic acid 4.39 3.28 2.62 2.83 3.16
      十七烯酸∶(C17∶1) heptadecenoic acid 0.07 0.08 0.09 0.11 0.07
      油酸 (C18∶1) oleic acid 19.63 19.93 24.19 19.26 20.22
      二十烯酸 (C20∶1) eicosenoic acid 0.98 1.01
      十六碳二烯酸 (C16∶2) hexadecadienoic acid 0.12 0.09 0.14 0.10
      亚油酸 (C18∶2) linoleic acid 15.92 16.31 15.55 16.32 16.98
      亚麻酸 (C18∶3) linolenic acid 0.14 0.33
      二十碳二烯酸 (C20∶2) eicosadienoic acid 1.06 1.20 1.26 1.17 1.24
      二十碳三烯酸 (C20∶3) eicosatrienoic acid 1.78 1.94 2.04 2.17 2.19
      二十碳四烯酸 (C20∶4) arachidonic acid 7.24 4.18 3.95 4.54 4.71
      二十碳五烯酸 (C20∶5) eicosapentaenoic acid 3.31 3.29 2.11 3.44 2.40
      二十一碳四烯酸 (C21∶4) heneicosatetraenoic acid 1.65 1.65 4.69 4.69 5.51
      二十一碳五烯酸 (C21∶5) heneicosapentaenoic acid 2.61 2.50 1.63
      二十二碳三烯酸 (C22∶3) docosatrienoic acid 8.39 1.04 0.96
      二十二碳六烯酸 (C22∶6) docosahexaenoic acid 9.20 6.90 9.67 9.16 7.01
      饱和脂肪酸 SFA 35.74 37.05 31.46 33.97 33.46
      单不饱和脂肪酸 MUFA 24.09 23.25 27.35 22.20 24.43
      多不饱和脂肪酸 PUMA 40.17 39.70 41.20 43.85 42.11

      表 4  不同浓度脂肪酶腌制罗非鱼的脂肪酸组成

      Table 4.  Fatty acid composition of preserved tilapia at different concentrations of lipase

      图  3  不同浓度脂肪酶对腌制罗非鱼氨基酸态氮及感官评分的影响

      Figure 3.  Effects of different amounts of lipase on amino nitrogen and sensory evaluation of pickled tilapia

      无脂肪酶添加时,氨基酸态氮质量分数为0.64 mg·g–1,此时鱼肉中的内源酶分解底物产生游离氨基酸。随着脂肪酶添加量的增加,氨基酸态氮的含量也在增加,但前期增加缓慢,可能原因是脂肪酶作用的底物是脂肪,而脂肪的降解需要多种脂肪酶的参与,且反应较为复杂[18]。脂肪酶添加量为0.010 0%时,氨基酸态氮的质量分数为0.67 mg·g–1,比对照组高4.69%。无脂肪酶添加时脂肪味较明显,且有轻微苦涩味及腥味。随着脂肪酶的添加,肉香味、鱼香味及鲜味逐渐明显,且在添加量为0.010 0%时达到感官评分最高(88.5),此时鱼香味、鲜味较强,风味较好。脂肪酸添加量为0.050 0%时感官评分下降至78.5,其可能原因是脂肪酶分解大量脂肪,产生了不利于滋味的酮类及醛类物质。这与吴若娜等[19]的研究结果一致。

      综合上述脂肪酸、氨基酸态氮和感官分析,当脂肪酶添加量为0.010 0%时,游离的不饱和脂肪酸较多,此时氨基酸态氮质量分数为0.67 mg·g–1,鲜味、鱼香味充足,因此选择脂肪酶最佳添加量为0.010 0%。

    • 腌制罗非鱼的风味物质主要由醇类、醛类、酮类、烃类等物质产生,且不同物质及含量对风味物质的影响不同。

      醇类中饱和醇类的阈值较高,对风味物质的贡献不大,不饱和醇类的阈值较低,对风味物质有较大的贡献[20-21]。大部分的醇类物质是脂质氧化分解的产物,如1-戊醇来自于亚油酸,1-己醇可能是棕榈酸和油酸生成,1-辛醇来自油酸的氧化,1-辛烯-3-醇风味阈值较低,它呈蘑菇的气味[22]。新鲜鱼组、低盐腌制组、低盐加酶腌制组分别检测出7种、12种、9种醇类风味物质(表5)。在检测到的醇类物质中,属于不饱和醇类有1-辛烯-3-醇、1-戊烯-3-醇、反式-2-辛烯-1-醇、1,2,5-二甲基环己醇,其中加酶组的不饱和醇类相对含量最高(5.37%)。不饱和醇类能给腌制罗非鱼提供更加独特的风味[23]。相比新鲜鱼组,其他2组产生了较多有利于风味的醇类物质,说明经过腌制处理后,醇类风味物质的种类增多,罗非鱼制品风味更佳。

      名称
      name
      相对含量/% relative content
      新鲜鱼组
      fresh fish group
      低盐腌制组
      low-salt curing group
      低盐加酶腌制组
      low-salt enzymatic curing group
      正己醇 N-hexanol 0.31 1.08 0.12
      2-丁氧基乙醇 2-butoxyethanol 8.31
      1-辛烯-3-醇 1-octen-3-ol 2.66 3.72 4.31
      庚醇 1-heptanol 0.34 0.43 0.17
      2-乙基己醇 2-ethyl hexanol 2.60 2.59 1.26
      苯甲醇 benzyl alcohol 0.54
      正辛醇 1-octanol 0.80
      正丁醇 1-butanol 0.35 0.43
      1-戊烯-3-醇 1-penten-3-ol 0.42 0.28
      1-戊醇 1-pentanol 3.17
      1-辛醇 1-octanol 0.68 0.31
      2,3-丁二醇 2,3-butanediol 0.17 0.18
      反式-2-辛烯-1-醇 trans-2-octen-1-ol 0.89
      1-壬醇 1-nonanol 0.21
      十二醇 1-dodecanol 0.17
      1,4-丁二醇 1,4-butanediol 0.18
      己醛 hexanal 5.36 10.34 10.24
      庚醛 heptaldehyde 0.68
      辛醛 octanal 2.50 2.27 6.09
      壬醛 1-nonanal 6.71 5.32
      癸醛 decanal 1.59 1.12
      苯甲醛 benzaldehyde 0.41 0.24
      反式-2-壬烯醛 (E)-2-nonenal
      2,3-辛二酮 2,3-octadione 0.80
      6-甲基-5-庚烯-2-酮 6-methyl-5-hepten-2-one 0.56
      3-羟基-2-丁酮 3-hydroxy-2-butanone 0.39
      香叶基丙酮 geranylacetone
      苯乙酮 acetophenone 0.18
      十二烷 dodecane 0.35
      十三烷 tridecane
      十四烷 tetradecane 0.57
      十五烷 pentadecane 0.17
      十六烷 hexadecane 5.09 1.15
      十七烷 heptadecane 3.20
      二十一烷 heneicosane 1.43 3.01
      二十八烷 octacosane 0.24 0.35
      2,6,10-三甲基-十五烷 2,6,10-trimethyl-pentadecan 3.25 0.61 2.24
      8-己基-十五烷 8-hexylpentadecane 0.30
      2,6,10,14-四甲基十五烷 2,6,10,14-tetramethylpentadecane 12.92 2.74 6.40
      2,6,10,14-四甲基十六烷 2,6,10,14-tetramethylhexadecane 16.53 2.72 6.63
      2-甲基十六烷 2-methylhexadecane 0.30

      表 5  不同腌制条件下罗非鱼的挥发性物质成分

      Table 5.  Volatile components of tilapia under different curing conditions

      醛类挥发性物质主要由PUFA氧化而成,是由一级氧化产生的氢过氧化物等降解产生,其阈值较低,对鱼制品的风味物质有明显的贡献[24-26]。5~9个碳的醛具有清香、油香、脂香等特殊风味,更多碳原子的醛虽然没有明显的风味芳香,但其中有大部分是芳香化合物的前体(如杂环化合物)[27]。检测到的5~9个碳的醛分别有己醛、庚醛、正辛醛、壬醛,上述醛类能产生明显的风味物质。其中具有明显风味贡献的醛类物质,加酶组相对含量最高(21.65%)。

      酮类物质可能由不饱和脂肪酸氧化产生,往往具有奶油味和果香味,如3-羟基-2-丁酮具有强烈的奶油味,对腥味有一定的增强作用[16]。新鲜鱼组中没有检测到酮类挥发性物质,而低盐腌制组、低盐加酶腌制组中均检测到2种酮类物质,说明通过腌制后的鱼肉其不饱和脂肪酸氧化产生了更多酮类挥发性物质,脂肪氧化程度增加(表5)。而加酶组检测到的酮类挥发性物质种类及含量相对较少,说明添加外源酶类对酮类风味物质的生成作用较小。

      烃类挥发性物质的产生主要原因是脂肪酸烷氧自由基的均裂[28]。各种烷烃(C6~C9)主要存在于甲壳类和鱼类挥发物中,由于其阈值较高,对挥发性的贡献相对较小[29]。而烯烃在一定条件下能合成醛和酮,是鱼腥味的潜在因素。3组产品检测到的烃类物质均为烷烃,无烯烃。由于烷烃的阈值较高,故对风味无明显影响[30]。同时也检测到多种胺类物质,如1,6-己内酰胺、苯甲酰胺等,但含量较少,低盐加酶组略微高于低盐组,这可能是由于氨基酸的脱羧作用形成的,此类物质具有腥臭味[31],对于风味物质的形成也具有一定的作用。

    • 不同种类及浓度的外源酶对罗非鱼腌制品质产生不同的影响。通过脂肪酸、氨基酸态氮和感官评定等指标进行分析。风味蛋白酶的最适添加量为0.010 0%,此时鱼肉的氨基酸态氮质量分数为0.75 mg·g–1,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为35.65%、23.78%和40.57%,感官评分为89;中性蛋白酶的最适添加量为0.010 0%,此时鱼肉的氨基酸态氮质量分数为0.81 mg·g–1,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为34.24%、24.82%和40.94%,感官评分为88.5;脂肪酶的最适添加量为0.010 0%,此时鱼肉的氨基酸态氮质量分数为0.67 mg·g–1,SFA、MUFA和PUFA相对含量分别为33.97%、22.20%和43.85%,感官评分为88.5。按照3种外源酶最适浓度混合腌制,实验证明能增加风味物质的生成(尤其是醇类、酮类),有效提高腌制效率,改善腌制罗非鱼的风味,具有广阔的研究及应用价值。

参考文献 (31)

目录

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