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斑节对虾2种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究

吴勉之 杨丽诗 周发林 黄建华 姜松 杨其彬 江世贵

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斑节对虾2种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究

    作者简介: 吴勉之(1992 — ),男,硕士研究生,从事甲壳动物高血糖家族激素研究。E-mail: 312781714@qq.com;
    通讯作者: 江世贵, jiangsg@scsfri.ac.cn
  • 中图分类号: S 917.4

Genome sequence analysis and expression of two CHH genes in tiger shrimp (Penaeus monodon)

    Corresponding author: Shigui JIANG, jiangsg@scsfri.ac.cn
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 在斑节对虾(Penaeus monodon)体内新发现了2种高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)家族基因PmCHHPmHHLPP。基因组分析结果显示,其均具有CHH-Ⅰ型基因基本的“信号肽-CPRP-KR/ER/RR-成熟肽”结构,且与已报道的CHHs基因的基因组结构相似;聚类分析结果显示,尽管PmCHHPmHHLPP与多个CHHs基因序列相似性超过50% (最高达99%),但与其聚为一支的基因均不是CHH-Ⅰ型基因;生物信息学分析结果显示,PmCHHPmHHLPP的转录起始位点“A”及其核心启动子区域分别位于开放阅读框(ORF)上游的99 bp和190 bp,同时在预测其空间结构后发现,两者的三维结构中均含有4个α螺旋构型;组织表达结果显示,2个基因均在肠中有较高的表达量,而PmCHH在鳃、PmHHLPP在眼柄中表达量也较高,但在肝胰腺和肌肉中表达量较低;幼体发育阶段表达结果显示,2个基因在无节幼体Ⅲ~Ⅳ期、溞状幼体Ⅰ期和糠虾幼体期表达量均有较大波动,与代谢强度呈弱相关关系。根据其一级结构的特征和相关表达情况,可推测PmCHHPmHHLPP均为CHHs家族基因。
  • 图 1  PmCHHPmHHLPP的基因组结构比较分析

    Figure 1.  Genomic structural analysis of PmCHH and PmHHLPP

    图 2  PmCHH (左) 和PmHHLPP (右) 的分子空间结构预测

    Figure 2.  Predicted molecular spatial structure of PmCHH (left) and PmHHLPP (right)

    图 3  基于NJ法构建的PmCHHPmHHLPP的系统进化树

    Figure 3.  Phylogenetic tree of PmCHH and PmHHLPP inferred using Neighbor-Joining method

    图 4  PmCHHPmHHLPP组织差异性表达

    Figure 4.  Expression levels of PmCHH and PmHHLPP in different tissues

    图 5  PmCHHPmHHLPP在幼体发育阶段表达分析

    Figure 5.  Expression levels of PmCHH and PmHHLPP at different larval developmental stages

    表 1  实验所用的引物及其序列

    Table 1.  Primers and their sequences used in this experiment

    引物
    primer
    引物序列
    primer sequence
    作用
    function
    产物长度/bp
    product size
    PmHHLPP-GF1 GAGTGAGAACGCAGTTACAGGT 基因组序列验证 3 785
    PmHHLPP-GR1 GACGAAGACGAGGACGACA
    PmHHLPP-GF2 CGACCACAGCGTGAACAA 基因组序列验证 246
    PmHHLPP-GR2 GAATAGCGGAGAAACATAGCC
    PmHHLPP-GF3 GGCTATGTTTCTCCGCTATTC 基因组序列验证 469
    PmHHLPP-GR3 GACTCCTGTCCTTTACTTCCCTA
    HHLPP-qPCR-F CTACAACCTGTACCGCAAGCCCTA Real-time RT-PCR 75
    HHLPP-qPCR-R TTACTGAACCTCTGATTCACGAAGC
    PmCHH-GF1 GGGAACTCTAGTATAACTGTAGCCA 基因组序列验证 457
    PmCHH-GR1 TTCGGGAACAACGGACC
    PmCHH-GF2 GCTTGGACTGCCAGAACAT 基因组序列验证 313
    PmCHH-GR2 GCATCCGTAGAAGACCTGTG
    PmCHH-GF3 CACAGGTCTTCTACGGATGC 基因组序列验证 269
    PmCHH-GR3 TCAGCTGTAACGATTTCTGTTC
    CHH-qPCR-F GTTCGCCGTCAGAAGAA Real-time RT-PCR 100
    CHH-qPCR-R GCAGTCCAAGCACACATTG
    EF-1α-qPCR-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT Real-time RT-PCR 73
    EF-1α-qPCR-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT
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  • [1] MONTAGNÉ N, DESDEVISES Y, SOYEZ D, et al. Molecular evolution of the crustacean hyperglycemic hormone family in ecdysozoans[J]. BMC Evol Biol, 2010, 10(1): 62
    [2] 蔡生力. 甲壳动物内分泌学研究与展望[J]. 水产学报, 1998, 22(2): 59-66
    [3] KELLER R. Crustacean neuropeptides: structures, functions and comparative aspects[J]. Experientia, 1992, 48(5): 439-448
    [4] BÖCKING D, DIRCKSEN H, KELLER R. The crustacean neuropeptides of the CHH/MIH/GIH family: structures and biological activities[J]. Springer Berlin Heidelberg, 2002, 13(1): 71-71
    [5] NAGAI C, MABASHI-ASAZUMA H, NAGASAWA H, et al. Identification and characterization of receptors for ion transport peptide (ITP) and ITP-like (ITPL) in the silkworm Bombyx mori[J]. J Biol Chem, 2014, 289(46): 32166-32177
    [6] DIRCKSEN H. Insect ion transport peptides are derived from alternatively spliced genes and differentially expressed in the central and peripheral nervous system[J]. J Exp Biol, 2009, 212(Pt 3): 401-412
    [7] 杨济芬, 朱冬发, 沈建明, 等. 甲壳动物高血糖激素家族生理功能研究进展[J]. 动物学杂志, 2009, 44(1): 151-158
    [8] 王雪惠, 孙金生, 杨卫军. 中华绒螯蟹眼柄神经多肽激素的分离纯化及活性鉴定[J]. 水产学报, 2006, 30(2): 151-155
    [9] OHIRA T. Crustacean hyperglycemic hormone, e53[M]. San Diego: Academic Press, 2016: 403-404.
    [10] DUANGPROM S, KORNTHONG N, SUWANSA-ARD S, et al. Distribution of crustacean hyperglycemic hormones (CHH) in the mud crab (Scylla olivacea) and their differential expression following serotonin stimulation[J]. Aquaculture, 2017, 468(1): 481-488
    [11] 舒妙安, 张龙韬, 周宇芳, 等. 拟穴青蟹(Scylla paramamosain)两种Ⅰ型高血糖激素基因全长cDNA的克隆及组织表达分析[J]. 海洋与湖沼, 2012, 43(4): 695-701
    [12] FANJUL-MOLES M L. Biochemical and functional aspects of crustacean hyperglycemic hormone in decapod crustaceans: review and update[J]. Comp Biochem Physiol C, 2006, 142(3/4): 390-400
    [13] FU C, HUANG X, GONG J, et al. Crustacean hyperglycaemic hormone gene from the mud crab, Scylla paramamosain: cloning, distribution and expression profiles during the moulting cycle and ovarian development[J]. Aquacult Res, 2016, 47(7): 2183-2194
    [14] LIU M Q, PAN L Q, LI L, et al. Molecular cloning, characterization and recombinant expression of crustacean hyperglycemic hormone in white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Peptides, 2014, 53: 115-124
    [15] 金舒博, 王宁, 乔慧, 等. 青虾高血糖激素基因全长cDNA序列的克隆及表达分析[J]. 中国水产科学, 2013, 37(1): 82-92
    [16] QIAN Y Q, DAI L, YANG J S, et al. CHH family peptides from an 'eyeless' deep-sea hydrothermal vent shrimp, Rimicaris kairei: characterization and sequence analysis[J]. Comp Biochem Physiol B, 2009, 154(1): 37-47
    [17] LI S H, LI F H, WANG B, et al. Cloning and expression profiles of two isoforms of a CHH-like gene specifically expressed in male Chinese shrimp, Fenneropenaeus chinensis[J]. Gen Comp Endocr, 2010, 167(2): 308-316
    [18] CAMACHO-JIMÉNEZ L, SÁNCHEZ-CASTREJÓN E, DÍAZ F, et al. Cloning and expression of the recombinant crustacean hyperglycemic hormone isoform B2 (rCHH-B2) and its effects on the metabolism and osmoregulation of the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Gen Comp Endocr, 2017, 253: 33-43
    [19] 王在照, 相建海. 甲壳动物CHH家族神经激素结构和功能研究进展[J]. 水产学报, 2001, 25(2): 175-180
    [20] De KLEIJN D P, van HERP F. Molecular biology of neurohormone precursors in the eyestalk of Crustacea[J]. Comp Biochem Physiol B, 1995, 112(4): 573-579
    [21] 王艳华, 张亦陈, 孙妍, 等. 中华绒螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子结构解析[J]. 水产学报, 2013, 37(7): 987-993
    [22] DAVEY M L, HALL M R, WILLIS R H, et al. Five crustacean hyperglycemic family hormones of Penaeus monodon: complementary DNA sequence and identification in single sinus glands by electrospray ionization-fourier transform mass spectrometry[J]. Mar Biotechnol, 2000, 2(1): 80-91
    [23] UDOMKIT A, CHOOLUCK S, SONTHAYANON B, et al. Molecular cloning of a cDNA encoding a member of CHH/MIH/GIH family from Penaeus monodon and analysis of its gene structure[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2000, 244(1): 145-156
    [24] TREERATTRAKOOL S, UDOMKIT A, EURWILAICHITR L, et al. Expression of biologically active crustacean hyperglycemic hormone (CHH) of Penaeus monodon in Pichia pastoris[J]. Mar Biotechnol, 2003, 5(4): 373-379
    [25] UDOMKIT A, TREERATTRAKOOL S, PANYIM S. Crustacean hyperglycemic hormones of Penaeus monodon: cloning, production of active recombinant hormones and their expression in various shrimp tissues[J]. J Exp Mar Biol Ecol, 2004, 298(1): 79-91
    [26] TREERATTRAKOOL S, PANYIM S, CHAN S M, et al. Molecular characterization of gonad-inhibiting hormone of Penaeus monodon and elucidation of its inhibitory role in vitellogenin expression by RNA interference[J]. FEBS J, 2008, 275(5): 970-980
    [27] WEBSTER S G, KELLER R, DIRCKSEN H. The CHH-superfamily of multifunctional peptide hormones controlling crustacean metabolism, osmoregulation, moulting, and reproduction[J]. Gen Comp Endocrinol, 2012, 175(2): 217-233
    [28] 江世贵. 斑节对虾种虾繁育技术[M]. 北京: 海洋出版社, 2013: 80-82
    [29] YANG L S, LI X L, JIANG S, et al. Characterization of Argonaute2 gene from black tiger shrimp (Penaeus monodon) and its responses to immune challenges[J]. Fish Shellfish Immunol, 2014, 36(1): 261-269
    [30] VENTURA-LÓPEZ C, GÓMEZ-ANDURO G, ARCOS F G, et al. A novel CHH gene from the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei was characterized and found highly expressed in gut and less in eyestalk and other extra-eyestalk tissues[J]. Gene, 2016, 582(2): 148-160
    [31] YAMANO K, UNUMA T. Expressed sequence tags from eyestalk of kuruma prawn, Marsupenaeus japonicus[J]. Comp Biochem Physiol A, 2006, 143(2): 155-161
    [32] GU P L, CHAN S M. The shrimp hyperglycemic hormone-like neuropeptide is encoded by multiple copies of genes arranged in a cluster[J]. FEBS Lett, 1998, 441(3): 397-403
    [33] DIRCKSEN H, BÖCKING D, HEYN U, et al. Crustacean hyperglycaemic hormone (CHH)-like peptides and CHH-precursor-related peptides from pericardial organ neurosecretory cells in the shore crab, Carcinus maenas, are putatively spliced and modified products of multiple genes[J]. Biochem J, 2001, 356(Pt 1): 159-170
    [34] DAI L, ZITNAN D, ADAMS M E. Strategic expression of ion transport peptide gene products in central and peripheral neurons of insects[J]. J Comp Neurol, 2007, 500(2): 353-367
    [35] DIRCKSEN H, TESFAI L K, ALBUS C, et al. Ion transport peptide splice forms in central and peripheral neurons throughout postembryogenesis of Drosophila melanogaster[J]. J Comp Neurol, 2008, 509(1): 23-41
    [36] 周凯敏, 江世贵, 黄建华, 等. 斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析[J]. 南方水产科学, 2017, 13(4): 59-68
    [37] 李运东, 周发林, 黄建华, 等. 斑节对虾组织蛋白酶L基因的克隆及其表达分析[J]. 南方水产科学, 2016, 12(3): 58-66
    [38] LI X G, XU Z Q, ZHOU G, et al. Molecular characterization and expression analysis of five chitinases associated with molting in the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis[J]. Comp Biochem Physiol B, 2015, 187: 110-120
    [39] LI W F, CHIU K H, TIEN Y C, et al. Differential effects of silencing crustacean hyperglycemic hormone gene expression on the metabolic profiles of the muscle and hepatopancreas in the crayfish Procambarus clarkii[J]. PLoS One, 2017, 12(2): e0172557
    [40] CAMACHO-JIMENEZ L, DIAZ F, MUNOZ-MARQUEZ M E, et al. Hyperglycemic and osmotic effects of dopamine and recombinant hormone CHH-B1 in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei[J]. Mar Freshw Behav Physiol, 2017, 50(1): 67-79
    [41] VRINDA S, RESHMI C, JOSE S, et al. Crustacean hyperglycemic hormone family gene silencing in Penaeus monodon mediated through dsRNA synthesized in vitro from genomic and cDNA[J]. Ind J Biotechnol, 2017, 16(1): 37-43
  • [1] 周凯敏江世贵黄建华杨其彬姜松邱丽华杨丽诗周发林 . 斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(4): 59-68. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.04.008
    [2] 何鹏江世贵李运东杨其彬姜松杨丽诗黄建华周发林 . 斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2019, 15(2): 72-82. doi: 10.12131/20180264
    [3] 郭松傅明骏赵超李伟杰江世贵杨其彬周发林邱丽华 . 斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(1): 59-66. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.01.009
    [4] 史进选傅明骏赵超周发林杨其彬邱丽华 . 斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析. 南方水产科学, 2016, 12(5): 61-70. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.05.008
    [5] 王艳傅明骏赵超周发林杨其彬邱丽华 . 斑节对虾GTF2H4基因的分子克隆及表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(2): 36-43. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.006
    [6] 戴文婷傅明骏赵超周发林杨其彬王艳史进选邱丽华 . 斑节对虾CDK2基因全长cDNA克隆及表达分析. 南方水产科学, 2015, 11(2): 1-11. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.02.001
    [7] 吴松唐蕾傅明骏杨丽诗黄建华周发林江世贵 . 斑节对虾泛素融合蛋白UbS27基因克隆与表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(1): 77-84. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.01.011
    [8] 刘倩江世贵邱丽华黄建华周发林杨其彬姜松杨丽诗 . 斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(5): 63-71. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.05.009
    [9] 傅明骏赵超周发林邱丽华江世贵 . 斑节对虾泛素结合酶PmUbc基因的克隆及表达分析. 南方水产科学, 2015, 11(6): 41-48. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.06.006
    [10] 刘恩瑞赵超王鹏飞范嗣刚闫路路邱丽华 . 斑节对虾TRIAP1基因的克隆、表达分析以及调控其表达的miRNAs的筛选. 南方水产科学, 2019, 15(4): 88-98. doi: 10.12131/20180285
    [11] 李丽丽赵超范嗣刚王鹏飞闫路路邱丽华 . 斑节对虾CDC42基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析. 南方水产科学, 2018, 14(4): 37-45. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.04.005
    [12] 傅明骏赵超杨其彬周发林江世贵邱丽华 . 斑节对虾过氧化氢酶基因全长cDNA克隆及表达分析. 南方水产科学, 2015, 11(6): 107-113. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.06.015
    [13] 丁阳阳江世贵李运东杨其彬姜松杨丽诗黄建华周发林 . 斑节对虾Pellino基因的克隆及其在不同胁迫条件下的表达分析. 南方水产科学, 2019, 15(3): 87-96. doi: 10.12131/20180216
    [14] 陈劲松江世贵黄建华杨其彬马振华周发林 . 斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(3): 73-82. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.03.010
    [15] 张文领牟希东胡隐昌宋红梅 . 福寿螺细胞色素P450基因CYP3192A1的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(1): 66-75. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.009
    [16] 何文耀范嗣刚刘宝锁张博周童苏家齐邓正华喻达辉 . 合浦珠母贝胸腺素β4 (thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究. 南方水产科学, 2018, 14(2): 66-74. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.02.009
    [17] 周童刘宝锁张博孟子豪何文耀喻达辉 . 类胡萝卜素对合浦珠母贝热休克蛋白基因HSP22表达的影响. 南方水产科学, 2018, 14(5): 60-69. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.05.008
    [18] 夏军红朱彩艳苏天凤周发林江世贵 . 斑节对虾基因组微卫星分离及其序列特征研究. 南方水产科学, 2006, 2(6): 1-7.
    [19] 马之明周发林黄建华叶乐江世贵 . 头孢氨苄对斑节对虾幼体发育及育苗水体细菌数量的影响. 南方水产科学, 2005, 1(4): 36-40.
    [20] 黄建华马之明周发林叶乐江世贵 . 南海北部野生斑节对虾卵巢解剖结构及组织学的研究. 南方水产科学, 2005, 1(3): 49-53.
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出版历程
  • 收稿日期:  2018-02-11
  • 录用日期:  2018-03-20
  • 刊出日期:  2018-08-01

斑节对虾2种高血糖激素家族基因的基因组序列分析和表达研究

    作者简介:吴勉之(1992 — ),男,硕士研究生,从事甲壳动物高血糖家族激素研究。E-mail: 312781714@qq.com
    通讯作者: 江世贵, jiangsg@scsfri.ac.cn
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306
  • 3. 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地农业部斑节对虾遗传育种中心,广东 深圳 518121

摘要: 在斑节对虾(Penaeus monodon)体内新发现了2种高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone, CHH)家族基因PmCHHPmHHLPP。基因组分析结果显示,其均具有CHH-Ⅰ型基因基本的“信号肽-CPRP-KR/ER/RR-成熟肽”结构,且与已报道的CHHs基因的基因组结构相似;聚类分析结果显示,尽管PmCHHPmHHLPP与多个CHHs基因序列相似性超过50% (最高达99%),但与其聚为一支的基因均不是CHH-Ⅰ型基因;生物信息学分析结果显示,PmCHHPmHHLPP的转录起始位点“A”及其核心启动子区域分别位于开放阅读框(ORF)上游的99 bp和190 bp,同时在预测其空间结构后发现,两者的三维结构中均含有4个α螺旋构型;组织表达结果显示,2个基因均在肠中有较高的表达量,而PmCHH在鳃、PmHHLPP在眼柄中表达量也较高,但在肝胰腺和肌肉中表达量较低;幼体发育阶段表达结果显示,2个基因在无节幼体Ⅲ~Ⅳ期、溞状幼体Ⅰ期和糠虾幼体期表达量均有较大波动,与代谢强度呈弱相关关系。根据其一级结构的特征和相关表达情况,可推测PmCHHPmHHLPP均为CHHs家族基因。

English Abstract

  • 甲壳动物高血糖激素家族(Crustacean hyperglycemic hormone,CHHs),是蜕皮动物尤其甲壳动物维持内稳态平衡的一类重要激素[1]。目前已探明位于眼柄处(无眼柄的等足类及部分有眼柄生物,窦腺位于头部近脑侧[2])的X器官窦腺复合体(X-organ-sinus gland,XO-SG)是该家族激素最主要的合成和分泌场所[3]。经XO-SG分泌后的神经肽,包括属于CHH-Ⅰ型[4]的CHH、ITP (ion transport peptide)和目前报道的几种基因同源产物[1,5-6],以及属于CHH-Ⅱ型的VIH/GIH (vitellogenesis-inhibiting hormone/gonad-inhibiting hormone)、MIH (molt-inhibiting hormone)和MOIH (mandibular organ-inhibiting hormone)等,经体液运输[3]作用到机体各处。作为甲壳动物眼柄中含量最丰富的激素[7-8],CHHs主要参与机体的血糖调节[3],并在肌肉和肝脏中发挥其“高血糖”功能[9],以满足机体需求,同时适应外界环境的刺激[10]。CHHs被发现在多种组织中普遍表达,包括眼柄神经、脑神经、胸腹神经、肝胰腺、肠、胃、肌肉等[3,8,11-15],同时在表皮[16]和精荚[17]中也有表达,这与其参与能量调节以外的多种功能相一致[18]

    目前普遍认为CHHs基因的最主要特征是其成熟肽上6个高度保守的半胱氨酸残基,以及由此形成的3个二硫键(Cys7-Cys43、Cys23-Cys39、Cys26-Cys52)[19-21]。此外,CHH-Ⅰ型基因的氨基酸序列还具有基本的“信号肽-CPRP (CHH precursor-related peptide,CHH序列相关前导肽)-KR/ER/RR-成熟肽”结构,其中CPRP结构是区分Ⅰ型和Ⅱ型基因的基本标志。

    目前在NCBI上公布的斑节对虾(Penaeus monodon) CHHs基因均为较早之前的报道[22-25],2005年后仅有1个[26],且其功能各不相同。Keller[3]、Böcking等[4]和Webster等[27]报道同物种内以及不同物种之间均可能含有多种结构和功能不完全相同的CHHs基因的情况。本研究在斑节对虾中新发现2个高血糖激素基因PmCHHPmHHLPP,进一步丰富了斑节对虾CHHs家族成员;另外,通过研究其基因组序列结构以及这2种基因在不同组织和幼体发育阶段的表达情况,并综合结构与功能同其他基因进行对比分析,也为研究这种多态多效性现象提供新的样本,从而为进一步了解CHH基因在斑节对虾体内的调控机制、丰富对CHHs家族的结构和功能的认识提供有益的借鉴。

    • 实验所需斑节对虾均来自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地农业部斑节对虾遗传育种中心,体质量为(45.20±4.62) g,体长为(15.90±1.37) cm,暂养于室内车间水泥池(1.84 m×1.70 m×1.73 m)中,养殖温度为27~30 ℃,盐度为25~30,溶氧充足,自然采光。从中挑选体质健康、无损伤的雌、雄对虾各3尾进行解剖取样,获得肝胰腺、肠、胃、眼柄神经、淋巴、肌肉、卵巢、精巢等组织样品(取3组平行样品),其中眼柄神经获取方法为,在眼柄伸展情况下自眼柄基部将其剪下,去掉眼球部分后用镊子将尖端内露出的白色条状部分夹出,此为眼柄神经。将组织置于RNAlater稳定剂(Ambion,美国)中保存;另取少量肌肉样品置于95%乙醇中常温保存备用。

      斑节对虾幼体发育不同时期的样品采集于基地夏季繁育过程中。将完成人工授精、卵巢发育成熟(暗绿色)的雌性斑节对虾单独放于50 m3黑桶中暂养,产卵后捞取部分受精卵作为样品保存,余下受精卵经10~12 h孵化(进入无节幼体期)以供后续取样。根据江世贵[28]所描述的斑节对虾幼体发育不同时期的特征,依次对无节幼体期6个时期、溞状幼体期3个时期、糠虾幼体期3个时期及仔虾期进行观察取样(取3组平行样品),并置于RNAlater稳定剂中保存。

    • 所有用于组织表达和幼体发育表达分析的样品均通过HiPure Fibrous RNA Plus Kit (Megan,中国)试剂盒提取总RNA。将溞状幼体期后可明显观察到幼体颗粒的样品经匀浆机研磨并加入试剂盒所提供的Proteinase K进行消化,而后与其他样品一同按照说明书进行抽提。琼脂糖凝胶电泳及NanoDrop Technologies检测仪检测RNA完整性。然后按照TaKaRa公司PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser所述方法进行定量模板cDNA合成,并储存于–20 ℃。

    • 基因组DNA提取按照Megan公司HiPure Tissue DNA Mini Kit组织DNA小量抽提试剂盒说明书进行,经琼脂糖凝胶电泳检测无误后储存于–20 ℃备用。

    • 在本斑节对虾转录组(暂未公开)中筛选得到斑节对虾高血糖神经肽PmCHHPmHHLPP的序列信息,将其与本实验室的斑节对虾基因组文库进行比对,获得这2个基因的基因组信息。使用Primer Premier 5.0软件设计基因组特异性引物(表1),对所获得的基因组进行分段验证。使用TaKaRa公司的Ex Taq酶,以抽提得到的基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为50 μL,反应条件为:1) 94 ℃ 3 min;2) 94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 90 s,35个循环;3) 72 ℃ 5 min。PCR产物经1.8%琼脂糖凝胶电泳检测后进行胶回收处理,并与pMD19-T载体(TaKaRa,中国)连接1 h。随后转入感受态大肠杆菌中,通过蓝白斑筛选获得阳性克隆,每个基因挑取8个菌落送往北京睿博兴科生物技术有限公司广州分公司进行测序,将所获得的测序结果与基因组信息进行比对,以进行序列验证。

      引物
      primer
      引物序列
      primer sequence
      作用
      function
      产物长度/bp
      product size
      PmHHLPP-GF1 GAGTGAGAACGCAGTTACAGGT 基因组序列验证 3 785
      PmHHLPP-GR1 GACGAAGACGAGGACGACA
      PmHHLPP-GF2 CGACCACAGCGTGAACAA 基因组序列验证 246
      PmHHLPP-GR2 GAATAGCGGAGAAACATAGCC
      PmHHLPP-GF3 GGCTATGTTTCTCCGCTATTC 基因组序列验证 469
      PmHHLPP-GR3 GACTCCTGTCCTTTACTTCCCTA
      HHLPP-qPCR-F CTACAACCTGTACCGCAAGCCCTA Real-time RT-PCR 75
      HHLPP-qPCR-R TTACTGAACCTCTGATTCACGAAGC
      PmCHH-GF1 GGGAACTCTAGTATAACTGTAGCCA 基因组序列验证 457
      PmCHH-GR1 TTCGGGAACAACGGACC
      PmCHH-GF2 GCTTGGACTGCCAGAACAT 基因组序列验证 313
      PmCHH-GR2 GCATCCGTAGAAGACCTGTG
      PmCHH-GF3 CACAGGTCTTCTACGGATGC 基因组序列验证 269
      PmCHH-GR3 TCAGCTGTAACGATTTCTGTTC
      CHH-qPCR-F GTTCGCCGTCAGAAGAA Real-time RT-PCR 100
      CHH-qPCR-R GCAGTCCAAGCACACATTG
      EF-1α-qPCR-F AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT Real-time RT-PCR 73
      EF-1α-qPCR-R CGTGGTGCATCTCCACAGACT

      表 1  实验所用的引物及其序列

      Table 1.  Primers and their sequences used in this experiment

    • 在NCBI网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上对PmCHHPmHHLPP进行BLAST比对,利用MEGA 7.0软件对所得结果进行进化树构建。

      利用SignalP 4.1 Server (www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测氨基酸序列是否具有一般CHHs家族基因的信号肽结构;通过IBS 1.0.1构建2个基因的基因组和其他已报道基因组的结构化模型;在SWISS-MODEL网站(https://swissmodel.expasy.org)上尝试虚拟出功能蛋白的三维结构模型;用在线NNPP 2.2服务器(http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)预测5′-非编码区 (UTR)结构中的核心启动子区域和转录起始位点。

    • 利用Beacon Designer 7.0软件设计表达分析所需的荧光定量引物PmCHH-qPCR-F/R和PmHHLPP-qPCR-F/R (表1),使用在斑节对虾组织表达过程中更稳定表达的EF-1α (elongation factor 1α,GenBank号为DQ021452)作为内参基因[29]。TaKaRa公司的TB GreenTM Premix Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)为主要试剂,通过Roche LightCycler® 480 Ⅱ (Roche,德国)完成PmCHHPmHHLPP的组织表达和幼体发育表达分析。反应体系为12.5 μL,包括上下游引物各0.5 μL,Super Mix 5.25 μL,ddH2O 4.25 μL,模板cDNA 1 μL (约40 ng),反应条件依照试剂推荐条件进行两步法扩增。每个组织的3个平行均进行检测,每个样品设置内参对照和3个孔作为重复,并设置了阳性和阴性对照。利用附带软件分析溶解曲线,以眼柄神经/受精卵中基因的平均表达强度(Ct值)作为单位1,用2–ΔΔCt法计算基因mRNA的相对表达量,在统计分析软件SPSS 24.0中对实验结果进行单因素方差(One-Way ANOVA)分析,并计算差异显著性 (Turkey),然后在Sigmaplot 7.0软件中绘制表达结果分析图。

    • 利用DNAMAN 8将测序结果进行拼接。结果显示,PmCHH基因组序列全长1 443 bp (GenBank登录号:MG888660),PmHHLPP基因组序列全长5 191 bp (GenBank登录号:MG888661),2个基因的编码区域内都包含了3个外显子和2个内含子,另外在3′-UTR中还另外包含了1个内含子。进一步对目前已报道的19个CHH-Ⅰ型基因(从NCBI上获得,GenBank号和物种名称详见图1)的基因组序列进行信号肽预测和结构域分析,可见PmCHHPmHHLPP同样包含CHH-Ⅰ基因基本的“信号肽-CPRP-KR/ER/RR-成熟肽”结构,且第一个内含子位于信号肽区域。

      图  1  PmCHHPmHHLPP的基因组结构比较分析

      Figure 1.  Genomic structural analysis of PmCHH and PmHHLPP

      目前所获得的PmCHH基因近端启动子序列,从翻译起始位点 (ATG) 起共527 bp,其预测的转录起始位点是位于开放阅读框(open reading frame, ORF)上游的第99个碱基“A”,核心启动子区覆盖了从“A”上游40 bp到下游10 bp共50 bp的区域;PmHHLPP基因近端启动子序列,从翻译起始位点 (ATG) 起共604 bp,其预测的转录起始位点是位于ORF上游的第190个碱基“A”,核心启动子区同样覆盖了50 bp的区域。2个基因的三维结构预测图 (图2) 显示,虽然都包含了4个α螺旋结构,但是PmCHH 第四个α螺旋结构更长。

      图  2  PmCHH (左) 和PmHHLPP (右) 的分子空间结构预测

      Figure 2.  Predicted molecular spatial structure of PmCHH (left) and PmHHLPP (right)

    • PmCHHPmHHLPP在NCBI上进行比对发现,PmCHH比对到的CHHs基因相似度普遍约50%,超过56%的仅有凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) (AJK31204.1)、欧洲龙螯虾(Homarus gammarus) (Q25154.2、Q25588.1和Q25589.1)、克氏原鳌虾 (Procambarus clarkii) (AFV95077.1、AIZ05252.1和AFV95083.1)和多齿新米虾(Neocaridina denticulata) (AIY69128.1)的部分序列,其中凡纳滨对虾CHH基因与PmCHH的相似度达到88%,远远超过其他物种。而PmHHLPP与凡纳滨对虾的2个hyperglycemic hormone-like peptide precursor基因 (AFV95080.1、AFV95081.1)、ITP基因(ABN11282.1)以及日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus) ion transport peptide基因(BAE78493.1)的序列覆盖度(query cover)均达99%,且具有80%以上的序列相似度(分别为87%、87%、86%和80%);虽然与凡纳滨对虾的另外几个基因CHH (AAN86054.1) 、MIH (AAK69346.1)、CHH (AAN86056.1)、MIH (P55322.1)和CHH (AAN86055.1)的序列覆盖度仅55% (主要分布于成熟肽区域),但其相似度仍达85%以上;70%以上相似度的还有克氏原鳌虾的MIH (BAA03462.1)、印度洋中脊盲虾(Rimicaris kairei) CHH (ACS35347.1)、细角刺虾(Oplophorus gracilirostris) CHH (ARN17955.1)和欧洲龙螯虾的CHH (AAX09331.1)基因。

      将2个基因以及和PmCHH超过53%序列相似性、与PmHHLPP超过70%序列相似性的基因(各17个)一起进行系统进化树构建,采用Bootstrap法重复计算1 000次(图3)。结果显示,PmCHH和相似度最高的凡纳滨对虾CHH基因(AJK31204.1)独立聚为一支,而与其他CHHs基因距离较远;排除部分序列Bootstrap值较低的问题,PmHHLPP与CHH-Ⅰ型的ITP基因和CHH-Ⅱ型的MIHMOIH等均距离较近。

      图  3  基于NJ法构建的PmCHHPmHHLPP的系统进化树

      Figure 3.  Phylogenetic tree of PmCHH and PmHHLPP inferred using Neighbor-Joining method

    • PmCHHPmHHLPP在不同组织中的表达呈现差异性(图4)。2个基因在眼柄、肝、肌肉等组织中均有分布;PmCHH在鳃中的相对表达水平最高,为眼柄神经中表达量的14倍,表达量第二的肠道也远高于眼柄(6倍),肝胰腺和肌肉中PmCHH的表达量仅是眼柄神经表达量的2倍,差异并不显著;PmHHLPP在肠中表达最高,是眼柄神经中表达量的2倍,其次为眼柄神经,而其他组织中的表达量相对较低,如肝胰腺、肌肉、淋巴、鳃和卵巢,在精巢中的表达量极低,仅为眼柄神经的1/77。

      图  4  PmCHHPmHHLPP组织差异性表达

      Figure 4.  Expression levels of PmCHH and PmHHLPP in different tissues

    • PmCHHPmHHLPP基因在幼体不同发育阶段的表达也存在差异(图5)。PmCHH在受精卵时表达量较低,在无节幼体Ⅰ、Ⅱ期逐渐上调,在Ⅲ期有一个明显回落,随后在Ⅳ期达到表达高峰(是受精卵时期表达量的约22倍,是无节幼体Ⅲ期表达量的12倍),随后回落到无节幼体前期水平;进入溞状幼体期后,在溞状幼体Ⅰ期有一个明显的下降,随后Ⅱ、Ⅲ期又逐步上升,并在糠虾幼体Ⅱ期达第二个表达高峰,随着发育阶段的推进,PmCHH基因的表达水平在仔虾阶段回落到溞状幼体Ⅰ期的表达水平。

      图  5  PmCHHPmHHLPP在幼体发育阶段表达分析

      Figure 5.  Expression levels of PmCHH and PmHHLPP at different larval developmental stages

      PmCHH相比,PmHHLPP的整体表达水平较低,同时在受精卵阶段表达量相对较高,在无节幼体时期下降,并在无节幼体Ⅲ期和糠虾幼体Ⅱ期出现表达高峰,分别为受精卵时期的1.4倍和1.3倍,无节幼体Ⅳ至Ⅵ期和糠虾幼体Ⅰ至Ⅲ期表达量均呈现下降趋势,在糠虾幼体期达到较高的表达水平,随后在仔虾阶段下降了约50%。

    • PmCHHPmHHLPP具有“信号肽-CPRP-KR/ER/RR-成熟肽”结构,这是CHHs基因尤其CHH-Ⅰ型基因最基本的特征;同时,除克氏原鳌虾和斑节对虾的个别已报道基因组序列以外,绝大多数基因组编码区包含3个外显子和2个内含子(其中1个内含子位于信号肽区域),且在3′-UTR区域内含有另一个内含子结构。同源比对和系统进化树分析结果显示,PmCHH与比对序列具有50%以上的相似性,而PmHHLPP的相似性更高,且集中体现在作为功能区的成熟肽区域,这足以证明PmCHHPmHHLPP是属于CHHs家族的基因。然而,值得注意的是,与PmCHH在序列上最相似的凡纳滨对虾CHH基因(AJK31204.1)并不是CHH-Ⅰ型基因:凡纳滨对虾该基因不具有CPRP结构,它在行使高血糖调控功能的肝胰腺和肌肉中不表达,且特异性的表达于精荚和输精管中[30];与PmHHLPP进化距离相近的多为MIHMOIH (包括MIH/MOIH-like)基因,而聚为一支的日本囊对虾的CHH基因(BAE78493.1)可能参与发育成熟和内分泌系统[31],这也是传统意义上认为的CHH-Ⅰ型基因所不具有的功能。此前报道的斑节对虾CHH基因(在NCBI上比对后相似度较低,未在本文结果中体现),虽然其结构上包含CPRP结构,被分为CHH-Ⅰ型基因,但是并不具有高血糖调节活性[23-24]或者表达基因结果不显著,难以确认其功能[23]。事实上,CHH-Ⅰ型包含的基因包括被认为行使高血糖调控的CHH,和后来在节肢动物中发现的、维持水盐平衡的姐妹基因ITP,无论结构上还是功能上均与属于CHH-Ⅱ型基因的MIH/MOIHVIH/GIH极为不同。另一个值得注意的现象是,已报道的基因组中可变剪接普遍存在,如在刀额新对虾(Metapenaeus ensis)的一个基因组序列中因为内含子的位置不同,使得成熟肽的序列发生了变化,其功能也发生了改变[32],乃至跨越了CHH-Ⅰ和CHH-Ⅱ的分界。近期有不少报道提到部分新发现的、结构上属于CHH-Ⅰ型的CHH-like基因存在组织特异性的情况[17,33-35]。显然单靠一个CPRP结构把CHH-Ⅰ型和CHH-Ⅱ型进行划分乃至以此作为基因功能的判断已不准确。应该建立新的分类和判断方法,在考虑可变剪接的基础上重新进行划分。Montagné等[1]认为,CHHs家族基因存在一个前体,它是甲壳动物CHHs和节肢动物ITPITP-like基因的共同祖先,而可变剪接过程的出现,将本来存储在非编码区的遗传信息释放出来,丰富了CHHs家族的结构与功能,使其变得更加多样化与专一化,这符合进化规律。

      进一步在定量表达结果中看到,虽然PmCHHPmHHLPP在眼柄神经、肝胰腺和肌肉中均有表达,但表达量并不高,而表达量最显著的肠和鳃是被认为与免疫功能相关的组织,由此看出这2个基因并不能被简单界定为高血糖调控的CHH-Ⅰ型基因。而在幼体发育阶段中,2个基因在无节幼体Ⅲ~Ⅳ期、溞状幼体Ⅰ期和糠虾幼体期前后表达量也出现了一定的波动:PmHHLPP基因在受精卵时期保持了一个较高的相对表达量,之后有短暂回落,在无节幼体Ⅲ~Ⅳ期时显著升高后回落,之后在溞状幼体Ⅰ期有一个小的反弹,但不显著,到糠虾幼体期又显著上升。PmCHHPmHHLPP最明显的不同是在溞状幼体阶段,尤其是在Ⅰ期表达量达到低谷,而后才缓慢上升。目前关于甲壳动物幼体发育阶段的基因表达情况研究报道的比较少,仅周凯敏等[36]、李运东等[37]、Li等[17]、Li等[38]有报道,且分期方式、物种、实验方法不尽相同。值得注意的是,无节幼体Ⅳ~Ⅳ期、溞状幼体Ⅰ期和糠虾幼体期是斑节对虾幼体变态的重要转折点[28]:无节幼体Ⅲ~Ⅳ期开始出现腹肢生长芽突,头胸甲雏形出现,在外观上与之前有一定的差异,这段时间主要是大量消耗卵黄促进机体生长;而进入溞状幼体期后,斑节对虾幼体脱离卵黄供能,正式进入浮游摄食阶段,这段时间里幼体的运动摄食能力有明显增强,头部和胸部开始分节,同时进化出口器和消化系统,这段时间PmCHHPmHHLPP的表达趋势相反;而到了糠虾幼体时期,步足和游泳足逐渐长成并开始分支分节,游泳能力在这段时间明显增强,机体内部也逐渐完善。这3个时期的共同特征是形态改变较大,需要提高代谢强度,这个过程中既可能包含能量的变化,也可能具有物质积累的过程。虽然目前对CHHs基因的功能一般定义为促进血糖升高,但也有报道其造成血糖浓度降低的情况[39-41],且前文也提到了这2个基因很有可能并不完全是具有高血糖调控功能的基因,那就不能简单地考虑基因表达和能量需求的关系;PmHHLPPMIH这个蜕皮抑制基因在序列结构和聚类上相似,而与PmCHH聚为一支的凡纳滨对虾CHH基因更多地表达于鳃和肠这样的免疫器官[30],本文的实验结果与其一致,因此也应该更多考虑它们在蜕皮和免疫上的功能。另外需要注意的是,2个基因预测的三维结构虽然都具有4个α螺旋,与报道的其他CHH基因近似[21],但这2个基因的结构并不完全相同,因此也需要对2个基因分别进行研究。

      本实验在斑节对虾中获得的基因PmCHHPmHHLPP属于CHHs家族基因,其与CHH-Ⅰ型基因在基因组结构上均具有很高的相似性,具有CHH-Ⅰ型基本的序列结构;其在组织中普遍表达,在幼体发育阶段发挥功能,但可能并不参与高血糖调控,猜测是在蜕皮与免疫方面发挥作用,这意味着不能将其简单定义为CHH-Ⅰ型基因,而应该属于新的类型。综上,新发现的PmCHHPmHHLPP基因,很有可能是具有CHH-Ⅰ型结构的新型CHHs基因。

参考文献 (41)

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