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合浦珠母贝胸腺素β4 (thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究

何文耀 范嗣刚 刘宝锁 张博 周童 苏家齐 邓正华 喻达辉

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合浦珠母贝胸腺素β4 (thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究

    作者简介: 何文耀(1993 — ),男,硕士研究生,从事水产生物功能基因研究。E-mail: 619150609@qq.com;
    通讯作者: 喻达辉, pearlydh@163.com
  • 中图分类号: S 917.4

Surgical injury and developmental stage expression of thymosin β4 gene in pearl oyster (Pinctada fucata)

    Corresponding author: Dahui YU, pearlydh@163.com
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 胸腺素β4 (thymosin β4)具有抗菌、抑制炎症和促进伤口愈合等作用。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)胸腺素β4 (Pfthymosin β4)的基因序列。该基因长261 bp,其中开放阅读框(open reading frame, ORF) 126 bp,编码42个氨基酸。生物信息学分析发现,胸腺素β4的蛋白理论分子量为4.78 ku;具有典型的“THY”特征模体和胸腺素β家族的特征序列;氨基酸序列保守性很高,与其他物种相似性达90%以上。荧光定量PCR结果表明,Pfthymosin β4在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高,其次是足与鳃。插核手术后取血细胞和伤口组织,Pfthymosin β4在血细胞和伤口组织的表达量显著升高,第6小时达到最高,推测表达量升高的原因是Pfthymosin β4促进血细胞向伤口处移动来参与合浦珠母贝伤口的前期修复。在各个发育时期中Pfthymosin β4均有表达,在变态期的表达量突然升高,推测其可能参与了合浦珠母贝的变态附着过程。
  • 图 1  Pfthymosin β4基因cDNA序列展示

    Figure 1.  Exhibition of Pfthymosin β4 cDNA

    图 4  Pfthymosin β4 基因蛋白三级结构的模型

    Figure 4.  Protein tertiary structure model of Pfthymosin β4

    图 2  Pfthymosin β4与其他物种胸腺素β氨基酸序列的多重比对

    Figure 2.  Multiple alignment of amino acid sequences of thymosin β from P.fucata and others species

    图 3  基于Pfthymosin β4 氨基酸序列构建的NJ系统进化树

    Figure 3.  NJ phylogenetic tree based on amino acid sequences of Pfthymosin β4

    图 5  Pfthymosin β4基因在不同组织中的表达

    Figure 5.  Relative expression level of Pfthymosin β4 in different tissues

    图 6  Pfthymosin β4基因在不同发育时期的表达

    Figure 6.  Relative expression level of Pfthymosin β4 at different developmental stages

    图 7  Pfthymosin β4基因在手术处理后不同时间的表达

    Figure 7.  Relative expression level of Pfthymosin β4 in different time after mantle-translate operation

    表 1  进化树和多重序列比对所用物种

    Table 1.  Species used in phylogenetic trees and multiple sequences

    物种名
    species
    基因
    gene
    一致性/%
    identity
    相似性/%
    positive
    登录号
    accession No.
    海葵 Exaiptasia pallida thymosin beta-12 88 95 KXJ22858.1
    花溪鳉Kryptolebias marmoratus thymosin beta-12 88 95 XP_017290006.1
    南极岩斑鳕鱼 Notothenia coriiceps thymosin beta-like 83 95 XP_010773615.1
    智人 Homo sapiens TMSB4X 83 92 AAH83509.1
    白颊长臂猴 Nomascus leucogenys thymosin beta-4 85 95 XP_012356370.1
    双团刺胸蛙 Nanorana yunnanensis thymosin beta4 85 95 ABQ12775.1
    绵羊 Ovis aries thymosin beta-4 83 92 XP_014959023.1
    剑尾鱼 Xiphophorus maculatus thymosin beta-4 85 92 XP_005812264.1
    眼斑雀鳝 Lepisosteus oculatus thymosin beta-4 83 95 XP_006637965.1
    海蜗牛 Aplysia californica thymosin beta 90 94 NP_001191437.1
    杂色鳉Cyprinodon variegatus thymosin beta-4 85 90 XP_015247492.1
    褐家鼠 Rattus norvegicus thymosin beta-4 83 92 AAA42246.1
    灰短尾负鼠 Monodelphis domestica thymosin beta-4 83 92 XP_001364937.1
    野骆驼 Camelus ferus thymosin beta-4 83 92 XP_006195381.1
    短嘴鸦 Corvus brachyrhynchos thymosin beta-4 83 92 KFO55790.1
    原鸡 Gallus gallus thymosin beta-4 83 92 NP_001001315.1
    长牡蛎 Crassostrea gigas Thymosin beta 85 92 AKC01246.1
    斑马鱼 Danio rerio thymosin beta-4 80 95 NP_001124169.1
    Bos taurus thymosin beta-4 80 92 DAA33518.1
    非洲爪蛙 Xenopus laevis thymosin beta-4 80 92 NP_001084321.1
    西部锦龟 Chrysemys picta bellii thymosin beta-4 80 92 XP_005287825.1
    布氏鼠耳蝠 Myotis brandtii thymosin beta-4 83 92 XP_014400899.1
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出版历程
  • 收稿日期:  2017-09-12
  • 录用日期:  2017-11-17
  • 刊出日期:  2018-04-01

合浦珠母贝胸腺素β4 (thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究

    作者简介:何文耀(1993 — ),男,硕士研究生,从事水产生物功能基因研究。E-mail: 619150609@qq.com
    通讯作者: 喻达辉, pearlydh@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学,水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306
  • 3. 钦州学院,广西北部湾海洋生物多样性养护重点实验室,广西 钦州 535011

摘要: 胸腺素β4 (thymosin β4)具有抗菌、抑制炎症和促进伤口愈合等作用。该研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)胸腺素β4 (Pfthymosin β4)的基因序列。该基因长261 bp,其中开放阅读框(open reading frame, ORF) 126 bp,编码42个氨基酸。生物信息学分析发现,胸腺素β4的蛋白理论分子量为4.78 ku;具有典型的“THY”特征模体和胸腺素β家族的特征序列;氨基酸序列保守性很高,与其他物种相似性达90%以上。荧光定量PCR结果表明,Pfthymosin β4在各组织中均有表达,其中在血细胞中表达量最高,其次是足与鳃。插核手术后取血细胞和伤口组织,Pfthymosin β4在血细胞和伤口组织的表达量显著升高,第6小时达到最高,推测表达量升高的原因是Pfthymosin β4促进血细胞向伤口处移动来参与合浦珠母贝伤口的前期修复。在各个发育时期中Pfthymosin β4均有表达,在变态期的表达量突然升高,推测其可能参与了合浦珠母贝的变态附着过程。

English Abstract

  • 胸腺素是一类小分子多肽,由Goldstein等[1]于1966年在胎牛胸腺蛋白中首次发现。根据蛋白等电点(PI)的不同,可以把胸腺素分成α、β、γ三个家族,其等电点分别为PI<5、5<PI<7、PI>7[1-3]。其中胸腺素β是一段含有40~44个氨基酸且保守性很高的多肽,至今为止发现了15种,广泛存在于脊椎动物和无脊椎动物之中[4]。胸腺素β的功能很广,具有一个能与肌动蛋白结合的结构域(LKKTET),与肌动蛋白结合后,使得肌动蛋白能以单体的形式存在于细胞内[3]。除此之外,胸腺素β4还有促进血管生成[5-6]、创伤愈合[7-8]、抑制炎症[9]、修复心肌损伤[10]、促进角膜修复[11]、调节肿瘤转移和细胞迁移[7,12]、参与机体免疫和抗菌[13-14]、降低体内活性氧[15]和促进毛囊生长[16]等作用。胸腺素β4的研究主要集中在癌症、血管修复、角膜修复和心肌损失修复等医学研究方面,在水生生物中的研究有机体免疫和抗菌、文昌鱼(Branchiostoma belcheri)的发育[17]、斑马鱼(Barchydanio rerio)的脑[18]和心脏[19]等,尚未见合浦珠母贝(Pinctada fucata)中的研究。

    合浦珠母贝又称马氏珠母贝,属于软体动物门、双壳纲、珍珠贝科,是中国用于海水珍珠人工培育的主要贝类。在珍珠培育过程中会出现育珠贝死亡率高、留核率低等问题。为了解决这些问题,在养殖过程中一般会对育珠贝进行术前处理和术后暂养。术前处理是通过促进育珠贝排精产卵或抑制性腺发育和降低生理机能使得其处于一个适合插核手术的状态,为珍珠囊发育提供空间和降低育珠贝对插核小片的拮抗作用[20],而术后暂养同样是为了降低育珠贝对插核小片的排异能力,增加留核率[21]。虽然这些措施会明显降低死亡率和提高留核率,但如果能对育珠贝伤口修复的分子机制进行研究,了解伤口修复过程各种分子的变化及其所起的作用,且找到一些比较重要的基因并加以利用,使伤口恢复更快或珍珠囊形成更快,将对进一步降低死亡率和提高留核率有积极作用。胸腺素β4具有抑制炎症,促进创伤愈合,参与免疫反应等功能,研究其在合浦珠母贝伤口修复过程中所起的作用具有很大的意义。本文通过荧光定量实验对胸腺素β4在合浦珠母贝的不同组织和插核手术后(血细胞和伤口组织)不同的时间点进行表达分析,对其在伤口修复分子机制中所起到的作用进行初步研究,以丰富合浦珠母贝伤口修复分子机制的研究资料。另外,有报道[17]指出胸腺素β4在文昌鱼的胚胎中可能发挥了保护的作用,因此同时开展了胸腺素β4在合浦珠母贝的5个不同发育时期的表达分析,为进一步探讨其功能奠定基础。

    • 实验于2016年12月在海南省陵水县新村热带水产研究开发中心进行。随机取10只合浦珠母贝[(47±1.25) mm,12月龄] 的性腺、消化盲囊、闭壳肌、鳃、外套膜、足、肠和血细胞用于基因克隆与各组织表达分析。合浦珠母贝不同发育时期的样品参照王珍珍等[22]的实验方法,在合浦珠母贝卵细胞受精后第8小时、第24小时、第14天、第20天和第24天取5个不同发育时期(担轮期、D型期、壳顶期、眼点期、变态期)的样品,每个时期收集3管,每管不少于500个幼虫[育苗时温度(27±3) ℃,盐度30]。取70只贝进行插核手术,但只插入小片不插入珠核,并于第0、第2、第4、第6、第12、第24和第48小时各取10只贝的血细胞(6 000 g离心5 min收集血细胞)和伤口组织(伤口周围2 mm)用于基因在插核手术后各小时血细胞和伤口组织上的表达分析。组织样品中加入Sample Protector for RNA/DNA (TaKaRa)后,置于液氮中保存。

    • 用RNAiso Plus (TaKaRa)提取以上样品的总RNA,具体过程同说明书所述。用核酸微量定量仪NanoDrop-2000检测总RNA的浓度、纯度和A260/A280值。用M-MLV (TaKaRa)反转录酶进行反转录,合成cDNA链,用于cDNA序列扩增;用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)试剂盒得到cDNA链,用于实时定量PCR实验。

    • 在合浦珠母贝转录组数据库中筛选出胸腺素β4序列。用Primer Premier 5设计引物Tβ4-1F (AAACCCATTACCGACCAAAGAAA)和Tβ4-1R (TTGCTGGTTCACTCCACTGTCATAC),以cDNA为模板进行PCR,反应总体系20 μL,内含引物各0.8 μL,cDNA模板1 μL。反应程序是94 ℃,3 min;94 ℃ 30 s,53 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,32个循环;72 ℃ 10 min。把目的片段进行胶回收(上海生工),用pMDTM18-T (TaKaRa)克隆试剂盒进行连接,转化进DH5α (全式金)并挑取单克隆。菌液PCR筛选出阳性克隆并送至上海生工生物工程股份有限公司测序。

    • BLASTX对基因序列进行注释;用ORF Finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)预测开放阅读框;用BLASTN进行基因的相似性分析,下载其他物种的胸腺素序列用于进化树分析和多重序列比对;用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)进行信号肽预测;用ExPASy的Protparam功能(http://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白性质;TMpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)预测跨膜螺旋;跨膜结构域的预测用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);用SWISSMODEL (http://swissmodel.expasy.org/)进行三维结构预测;用SMART (http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?GENOMIC=1)进行功能域预测;使用DNAstar进行蛋白的二级结构预测;运用PROSITE (http://prosite.expasy.org/)进行功能位点预测;磷酸化位点预测用Netphos 3.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/);糖基化位点用NetNGlyc 1.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测;使用Clustal X和Texmaker进行多序列比对;用MEGA 5.0的邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建进化树。

    • 用胸腺素β4的Tβ4-1F和Tβ4-1R引物,以合浦珠母贝的18S [18S-F(GAGAAACGGCTAC CACATCC)、18S-R(CACCAGACTTGCCCTCCAA)]作为内参基因,进行实时qPCR。按照TaKaRa的SYBR PremixEx TaqTM Kit (Perfect Real Time)说明书配制反应体系,反应程序是95 ℃ 2 min;95 ℃ 15 s,53 ℃ 15 s,68 ℃ 20 s,40个循环。每个样品3次重复,每次设置3个复孔。实验数据使用△CT法(2–△△CT)进行分析,最后用SPSS Statistic 17.0进行数据统计分析。

    • 验证片段的测序结果与合浦珠母贝转录组数据中得到的胸腺素β4序列相同,将其命名为Pfthymosin β4(图1)。基因核苷酸序列已提交到NCBI,获得的基因序列号为MF807225。Pfthymosin β4的5'非编码区(UTR) 41 bp,3'UTR 94 bp,开放阅读框126 bp,共编码41个氨基酸。Protparam预测得知Pfthymosin β4的蛋白理论分子量为4 781.43 u,理论等电点(PI)是6.19,由14种氨基酸组成,其中赖氨酸(24.4%)和谷氨酸(14.6%)占比较大,半衰期为30 h,不稳定系数为31.58。经TMHMM、SignalP 4.1、NetNGlyc 1.0和TMpred预测,Pfthymosin β4没有跨膜结构域、信号肽、糖基化位点和跨膜螺旋区。Netphos 3.1预测发现基因有7个磷酸化位点(2个丝氨酸、5个苏氨酸)。DNAstar软件预测蛋白二级结构有3个a-螺旋,4个β-转角和无规则卷曲。蛋白三维结构预测模型如图4所示。利用SMART和PROSITE预测发现,Pfthymosin β4蛋白序列中的第7和第40个氨基酸之间是典型的“THY”特征模体,第18和第29个氨基酸之间(LKKTETQEKNPL)的氨基酸序列是胸腺素β家族的特征序列。

      图  1  Pfthymosin β4基因cDNA序列展示

      Figure 1.  Exhibition of Pfthymosin β4 cDNA

      图  4  Pfthymosin β4 基因蛋白三级结构的模型

      Figure 4.  Protein tertiary structure model of Pfthymosin β4

    • 多重序列比对表明,胸腺素β的保守性非常高(图2)。从氨基酸序列来看,胸腺素β家族的特征序列(LKKTETQEKNPL)和MSDKPD序列的保守性高;而从物种方面看,与其他物种相似性达到了90%以上(表1),相似性最高是眼斑雀鳝(Lepisosteus oculatus)、双团刺胸蛙(Nanorana yunnanensis)、白颊长臂猴(Nomascus leucogenys)、南极岩斑鳕鱼(Notothenia coriiceps)、花溪鳉(Kryptolebias marmoratus)、海葵(Exaiptasia pallida),相似性为95%;而一致性达到80%以上,最高是一致性90%的海蜗牛(Aplysia californica),其次是88%的海葵和花溪鳉。从NJ系统进化树(图3) 中可以看到,Pfthymosin β4先与长牡蛎(Crassostrea gigas)的thymosin β聚为一支,再与南极岩斑鳕鱼聚为一支,最后与陆生动物、两栖类动物聚为群组。

      物种名
      species
      基因
      gene
      一致性/%
      identity
      相似性/%
      positive
      登录号
      accession No.
      海葵 Exaiptasia pallida thymosin beta-12 88 95 KXJ22858.1
      花溪鳉Kryptolebias marmoratus thymosin beta-12 88 95 XP_017290006.1
      南极岩斑鳕鱼 Notothenia coriiceps thymosin beta-like 83 95 XP_010773615.1
      智人 Homo sapiens TMSB4X 83 92 AAH83509.1
      白颊长臂猴 Nomascus leucogenys thymosin beta-4 85 95 XP_012356370.1
      双团刺胸蛙 Nanorana yunnanensis thymosin beta4 85 95 ABQ12775.1
      绵羊 Ovis aries thymosin beta-4 83 92 XP_014959023.1
      剑尾鱼 Xiphophorus maculatus thymosin beta-4 85 92 XP_005812264.1
      眼斑雀鳝 Lepisosteus oculatus thymosin beta-4 83 95 XP_006637965.1
      海蜗牛 Aplysia californica thymosin beta 90 94 NP_001191437.1
      杂色鳉Cyprinodon variegatus thymosin beta-4 85 90 XP_015247492.1
      褐家鼠 Rattus norvegicus thymosin beta-4 83 92 AAA42246.1
      灰短尾负鼠 Monodelphis domestica thymosin beta-4 83 92 XP_001364937.1
      野骆驼 Camelus ferus thymosin beta-4 83 92 XP_006195381.1
      短嘴鸦 Corvus brachyrhynchos thymosin beta-4 83 92 KFO55790.1
      原鸡 Gallus gallus thymosin beta-4 83 92 NP_001001315.1
      长牡蛎 Crassostrea gigas Thymosin beta 85 92 AKC01246.1
      斑马鱼 Danio rerio thymosin beta-4 80 95 NP_001124169.1
      Bos taurus thymosin beta-4 80 92 DAA33518.1
      非洲爪蛙 Xenopus laevis thymosin beta-4 80 92 NP_001084321.1
      西部锦龟 Chrysemys picta bellii thymosin beta-4 80 92 XP_005287825.1
      布氏鼠耳蝠 Myotis brandtii thymosin beta-4 83 92 XP_014400899.1

      表 1  进化树和多重序列比对所用物种

      Table 1.  Species used in phylogenetic trees and multiple sequences

      图  2  Pfthymosin β4与其他物种胸腺素β氨基酸序列的多重比对

      Figure 2.  Multiple alignment of amino acid sequences of thymosin β from P.fucata and others species

      图  3  基于Pfthymosin β4 氨基酸序列构建的NJ系统进化树

      Figure 3.  NJ phylogenetic tree based on amino acid sequences of Pfthymosin β4

    • Pfthymosin β4在合浦珠母贝的血细胞中的表达量最高,其次是足和鳃,性腺、消化盲囊、闭壳肌、外套膜和肠表达量最低,没有显著差异(图5)。在不同发育阶段中Pfthymosin β4均有表达(图6),担轮期、壳顶期和眼点期的相对表达量没有统计学上的差异,D型期与之相比下调了约40%,相对表达量在变态期时达到最高,是眼点期的2.2倍(相对表达量均用平均值±标准误表示,n=4)。

      图  5  Pfthymosin β4基因在不同组织中的表达

      Figure 5.  Relative expression level of Pfthymosin β4 in different tissues

      图  6  Pfthymosin β4基因在不同发育时期的表达

      Figure 6.  Relative expression level of Pfthymosin β4 at different developmental stages

      在插核手术后,血细胞的Pfthymosin β4相对表达量在第2、第4和第6小时持续升高,并在第6小时达到高峰后下降,第24小时回复正常水平,第48小时升高1倍(图7–A);而伤口组织的相对表达量开始时稍有下调,到第6小时突然上调达到最高,第12小时稍有下调,第24小时回复正常,第48小时下调,相对表达量最低(图7–B)。

      图  7  Pfthymosin β4基因在手术处理后不同时间的表达

      Figure 7.  Relative expression level of Pfthymosin β4 in different time after mantle-translate operation

    • 生物信息学分析显示所克隆的Pfthymosin β4含有“THY”特征模体和胸腺素β家族的特征序列,表明所获得基因为胸腺素β家族成员之一。“THY”是胸腺素β家族成员特有的特征模体;特征序列LKKTETQEKNPL是一段在胸腺素β4家族中高度保守的氨基酸序列,涉及与肌动蛋白的结合[23]。胸腺素β4与肌动蛋白结合是胸腺素β4发挥作用的一个重要过程。经预测Pfthymosin β4缺少跨膜结构域、信号肽、糖基化位点和跨膜螺旋区,是一个结构简单的小分子蛋白。Pfthymosin β4的不稳定系数为31.58,可以推测出Pfthymosinβ4能稳定存在于水溶液中。多重序列比对结果显示,合浦珠母贝胸腺素β4与其他物种相比一致性在80%以上,且与海蜗牛的一致性更是达到90%,说明胸腺素β4是一个保守性很高的蛋白。基于Pfthymosin β4较高的保守性可推测胸腺素β4在合浦珠母贝体内发挥的功能可能与它在其他物种体内相似,具有促进伤口愈合、血管生成、参与机体抗菌和降低体内活性氧等功能。从进化树中得出,Pfthymosin β4先与长牡蛎的thymosin β聚为一支,再与南极岩斑鳕鱼聚为一支,最后与陆生动物、两栖类动物聚为群组,这个趋势与生物学分类相符合。在已报道的文献中存在着相似的结果[24-25],其所研究的基因都先与亲缘相近的贝类聚为一支,然后再与鱼类、两栖类和陆生生物聚为一支,但是在合浦珠母贝的OAR基因构建的进化树中,其与贝类聚类后先与节肢动物聚合后再与鱼类聚合,最后再与两栖类和陆生生物聚为一支[26]

      本实验通过实时荧光定量发现Pfthymosin β4在血细胞表达量最高,其次是足与鳃,而性腺、消化盲囊、闭壳肌、外套膜和肠的相对表达量与血细胞相比相差很大,所以其低表达的原因可能是由于组织中存在少量的血细胞,也可能是上述组织的Pfthymosin β4表达量相对于血细胞低很多。对皱纹盘鲍 (Haliotis discus discus)[27]、中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)[28]、九孔鲍 (H.diversicolor supertexta)[29]等研究结果与本研究相似,血细胞在各组织中表达量最高;且在免疫刺激后对组织进行荧光定量PCR实验发现其在免疫刺激后上调,表明参与了机体免疫反应;研究人员对香港牡蛎 (C.hongkongensis)注射胸腺素β4和溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的混合物后发现其具有加速清除溶藻弧菌的功能[15]。合浦珠母贝属于软体动物,只有先天免疫,缺乏特异性免疫,机体发挥免疫功能主要依赖血细胞,通过Pfthymosin β4在血细胞里高表达的现象和之前报道过的现象,可以推测胸腺素β4在合浦珠母贝中很可能也参与了免疫反应。

      在合浦珠母贝各个发育时期实时定量的结果中发现,Pfthymosin β4在担轮期、壳顶期和眼点期之间的表达量无明显变化,与之相比D型期发生了下调,而变态期突然上调2.23倍。变态期是贝类幼苗发育的关键时期,在这个时期幼苗的生活习性会发生改变,从浮游生活转为附着生活。贝类附着变态过程受到物理因子、化学因子和生物因子的影响。其中蛋白激酶属于能影响贝类附着变态的一种影响因子,蛋白激酶A和C通过打开离子通道,使细胞发生去极化,使得幼虫对外界诱导物的敏感性增强,从而参与幼苗变态过程中的形态发生途径和调控途径[30-31]。对于胸腺素β4与蛋白激酶A和C的关系暂时还未见有报道,但是有人报道过胸腺素β4能增强蛋白激酶B的活性和促进其磷酸化[32-33],而蛋白激酶家族成员存在着一段相似的约270个氨基酸构成的催化结构域,所以胸腺素β4也可能存在着增强蛋白激酶A和C的活性和促使其磷酸化的能力,从而参与幼苗的变态附着。

      在插核手术后,Pfthymosin β4在血细胞的相对表达量在第0~第6小时持续升高,并达到顶峰然后开始下降恢复到正常水平;而在伤口组织中相对表达量与在血细胞中相似,在第6小时上调达到最高。Bodendorf等[34]的研究证明,机体受到损伤后的伤口液里会存在大量的胸腺素β4,且在短时间内,细胞内的胸腺素β4会大量的减少。他推测胸腺素β4是转谷氨酰胺酶的底物,参与了胶原蛋白和纤维蛋白的交联,且因子Ⅺ Ⅱ会将胸腺素β4掺入到纤维蛋白的αC结构中。所以合浦珠母贝在受到创伤后的第0~第6小时相对表达量升高可能是因为血液和伤口组织在受到创伤后释放出了大量的胸腺素β4,导致细胞内的胸腺素β4减少。胸腺素β4的减少可能会引起细胞内与胸腺素β4结合的肌动蛋白单体和装配的肌动蛋白之间的平衡发生紊乱,导致了Pfthymosin β4的表达量升高,以恢复细胞内的胸腺素β4水平,维持肌动蛋白单体的平衡。另外,贝类的伤口修复包括发炎、细胞增殖和组织重塑3个过程[35],伤口修复前期血细胞会清除伤口组织处受损的细胞,发生炎症,而胸腺素β4具有促进细胞迁移、细胞增殖、减低炎症等功能,所以Pfthymosin β4在插核手术后表达量升高可能是因为Pfthymosin β4增加了血细胞的迁移速度,使得血液中的血细胞数量增多且血细胞能更快地聚集在伤口处清除受损细胞,抑制或者防止过激的炎症。而且有学者研究发现,在香港牡蛎中注射重组的胸腺素β4后,血液中的血细胞在第6小时有所增加,而在第12小时达到最高,与空白组相比血液中增加了约1倍的血细胞,得出了胸腺素β4能增加香港牡蛎血液中的血细胞数量的结论[15]

参考文献 (35)

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