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孔雀石绿降解菌Enterobacter sp. B-20的分离、鉴定和降解特性研究

刘单单 李春生 杨贤庆 陈胜军 邓建朝 王悦齐 李来好

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孔雀石绿降解菌Enterobacter sp. B-20的分离、鉴定和降解特性研究

    作者简介: 刘单单(1990 — ),女,硕士研究生,从事水产品加工及贮藏研究。E-mail: DANWAWJ2011@163.com;
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 中图分类号: X 172

Isolation, identification and degradation characteristics of Enterobacter sp. B-20 from malachite green degradation bacteria

    Corresponding author: Xianqing YANG, yxqgd@163.com ;
  • CLC number: X 172

  • 摘要: 从受孔雀石绿污染的淡水鱼养殖池塘底泥中,筛选到一株孔雀石绿(C23H25ClN2,malachite green,MG)高效降解菌,经16S rRNA基因序列及系统进化树分析,初步鉴定为Enterobacter sp. B-20。采用硼氢化钾(KBH4)还原-高效液相色谱法对Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解特性进行研究。结果显示,孔雀石绿对菌株的生长有一定抑制作用,24 h内菌株对5~20 mg·L–1孔雀石绿降解率超过97%,12 h内对1~40 mg·L–1孔雀石绿降解率超过82%。菌株的孔雀石绿降解能力随着pH的增加而显著提高,最适降解pH为9。Enterobacter sp. B-20具有较强的耐盐性,在10~40 g·L–1 的氯化钠(NaCl)质量浓度下具有稳定的孔雀石绿降解特性。在高浓度金属离子条件下,Enterobacter sp. B-20表现出较强的耐性及稳定的孔雀石绿降解能力,0.1~1 mmol·L–1铁离子(Fe3+)、0.1~0.5 mmol·L–1铜离子(Cu2+)、0.1 mmol·L–1锰离子(Mn2+)、0.1~1 mmol·L–1铅离子(Pb2+)均能显著提高菌株的孔雀石绿降解率。结果表明,Enterobacter sp. B-20具有在复杂养殖水环境下降解孔雀石绿的应用潜力。
  • 图 1  隐性孔雀石绿高效液相色图谱 (a) 和孔雀石绿的质量浓度与峰面积的相关曲线 (b)

    Figure 1.  HPLC chromatogram of leucomalachite green (a) and curve of relativity of mass concentration of malachite green and peak area (b)

    图 2  利用最大似然法构建的菌株B-20的系统进化树

    Figure 2.  Systemic phylogenetic tree of strain B-20 constructed by method of maximum likelihood

    图 3  Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解动力学曲线

    Figure 3.  Dynamic curve of malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    图 4  孔雀石绿初始质量浓度对Enterobacter sp. B-20生长和降解的影响

    Figure 4.  Effect of mass concentration of malachite green on growth and malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    图 5  初始pH对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响

    Figure 5.  Effect of initial pH on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    图 6  氯化钠质量浓度对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响

    Figure 6.  Effect of NaCl concentration on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    图 7  温度对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响

    Figure 7.  Effect of temperature on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    图 8  金属离子对Enterobacter sp. B-20孔雀石绿降解的影响

    Figure 8.  Effect of metal ions on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

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出版历程
  • 收稿日期:  2017-06-23
  • 录用日期:  2017-08-03
  • 网络出版日期:  2018-01-01
  • 刊出日期:  2018-02-01

孔雀石绿降解菌Enterobacter sp. B-20的分离、鉴定和降解特性研究

    作者简介:刘单单(1990 — ),女,硕士研究生,从事水产品加工及贮藏研究。E-mail: DANWAWJ2011@163.com
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 1. 大连海洋大学,辽宁 大连 116023
  • 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300

摘要: 从受孔雀石绿污染的淡水鱼养殖池塘底泥中,筛选到一株孔雀石绿(C23H25ClN2,malachite green,MG)高效降解菌,经16S rRNA基因序列及系统进化树分析,初步鉴定为Enterobacter sp. B-20。采用硼氢化钾(KBH4)还原-高效液相色谱法对Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解特性进行研究。结果显示,孔雀石绿对菌株的生长有一定抑制作用,24 h内菌株对5~20 mg·L–1孔雀石绿降解率超过97%,12 h内对1~40 mg·L–1孔雀石绿降解率超过82%。菌株的孔雀石绿降解能力随着pH的增加而显著提高,最适降解pH为9。Enterobacter sp. B-20具有较强的耐盐性,在10~40 g·L–1 的氯化钠(NaCl)质量浓度下具有稳定的孔雀石绿降解特性。在高浓度金属离子条件下,Enterobacter sp. B-20表现出较强的耐性及稳定的孔雀石绿降解能力,0.1~1 mmol·L–1铁离子(Fe3+)、0.1~0.5 mmol·L–1铜离子(Cu2+)、0.1 mmol·L–1锰离子(Mn2+)、0.1~1 mmol·L–1铅离子(Pb2+)均能显著提高菌株的孔雀石绿降解率。结果表明,Enterobacter sp. B-20具有在复杂养殖水环境下降解孔雀石绿的应用潜力。

English Abstract

  • 孔雀石绿(C23H25ClN2,malachite green,MG)是一种广泛用于印染、造纸、医药行业中的人工合成化合物,曾被作为杀虫剂、杀菌剂用于防治鱼类细菌、真菌和原生动物病害,如水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等[1-2]。孔雀石绿作为一种三苯甲烷类染料,具有潜在的致癌、致畸、致突变作用,成为科研学者关注的焦点[3]。隐性孔雀石绿(C23H26N2,leucomalachite green,LMG)是孔雀石绿在生物体中易转化产生的代谢产物,具有更高的稳定性和毒性,容易在生物体组织中积累,对自然环境和人类健康具有潜在的危害,许多国家都将孔雀石绿及隐性孔雀石绿列为水产养殖禁用药物[4-5]。早在2002年中国农业部已经颁布禁令,禁止孔雀石绿用于所有水产养殖动物,但是由于孔雀石绿的生产和使用成本低、易获得且没有合适的替代药而屡禁不止,对国内外水产品市场造成巨大的经济损失。而且由于孔雀石绿代谢周期缓慢,在养殖环境中使用多年后仍难以完全消除,因此如何安全有效地去除养殖环境中的孔雀石绿已成为目前水产养殖行业亟待解决的问题。

    传统的三苯甲烷类染料处理方法主要包括吸附、膜分离、萃取法、絮凝沉淀、电化学、光降解等物理化学方法[6]。这些方法大多数存在成本高、耗时长、容易形成二次污染或需要再生等问题,并没有得到广泛的应用。以微生物絮凝、吸附或降解为基础的生物法是一种新型孔雀石绿处理方法,因其环境友好、易操作、成本低等优点,具有在水产养殖环境中应用的潜力。目前,已报道的能够脱除孔雀石绿的微生物包括细菌、真菌、放线菌、酵母菌和藻类等,其中大多为细菌,主要包括肠杆菌属(Enterobater)[7]、气单胞菌属(Aeromonas)[8]、假单胞菌属(Pseudomonas)[6,9-10]、芽孢杆菌属(Bacillus)[11]等。有关微生物脱除三苯甲烷类染料的机理研究主要集中在脱色和降解相关酶类和基因上,这些酶主要包括漆酶(laccase)[12-13]、锰过氧化物酶(manganese peroxidase)[14-15]、木质素过氧化物酶(lignin peroxidase)[16]和三苯甲烷还原酶(triphenylmethane reductase)[17-18]等;在基因研究方面,主要为三苯甲烷还原酶基因tmr的克隆和表达[17-20]

    目前,在微生物孔雀石绿脱色研究方面,大部分选用紫外-可见分光光度计法,但此方法只能检测孔雀石绿,对于孔雀石绿的代谢产物,毒性更高、性质更稳定的隐性孔雀石绿却无法检测。而且孔雀石绿在水溶液中能够向结构更为稳定的隐性孔雀石绿转化,为孔雀石绿的研究增加了难度。本研究采用硼氢化钾还原-高效液相色谱法[21]对孔雀石绿进行检测,本方法不同于以往液相方法具有的复杂前处理,仅需将孔雀石绿用硼氢化钾完全还原为隐性孔雀石绿,再利用液相色谱检测即可。

    为了获得适用于在复杂养殖环境中降解孔雀石绿的菌株,本研究从受孔雀石绿污染的水产养殖池塘底泥中筛选高效孔雀石绿降解菌,并对菌株的形态特征及16S rRNA基因序列进行分析,初步确定该菌的分类学地位,同时系统研究不同时间、孔雀石绿质量浓度、pH、NaCl质量浓度、温度、金属离子等对菌株孔雀石绿降解能力的影响,为菌株在复杂养殖水环境降解孔雀石绿的应用提供重要的理论基础。

    • 菌株B-20,分离自佛山顺德某受孔雀石绿污染的淡水鱼养殖池塘底泥中。

    • LB培养基(g·L–1):蛋白胨10,酵母粉5,氯化钠(NaCl) 10,pH 7.0。

    • 孔雀石绿为分析纯,购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit购于TaKaRa公司。

    • 称取1 g底泥置于孔雀石绿终质量浓度为40 mg·L–1的100 mL液体LB培养基中,在恒温振荡培养箱中,37 ℃、180 r·min–1培养3 d,取2%培养液转接到含有80 mg·L–1孔雀石绿的LB培养基中,相同条件继续培养,然后继续转接至孔雀石绿质量浓度分别为100 mg·L–1、200 mg·L–1、300 mg·L–1的培养基中待颜色变浅,在孔雀质量浓度为300 mg·L–1的LB平板上稀释涂布筛选,待出现透明圈后挑取透明圈最大的菌落,经过多次划线,最终筛选得到高效孔雀石绿降解菌株B-20,保存到LB斜面中于4 ℃存放。

    • 根据细菌分类鉴定标准,从菌株个体形态特征、菌落特征等方面进行初步鉴定。16S rRNA基因的克隆采用TaKaRa的16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit,琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的大小(1.5 kb),条带切胶回收后,利用正向测序引物、反向测序引物和中间测序引物分别对16S rRNA基因进行测序。利用Lasergene SeqMan Pro软件对序列进行拼接,获得完整的16S rRNA基因序列。将菌株B-20的16S rRNA基因序列在NCBI上进行比对分析。选择属内标准菌株的16S rRNA基因序列,使用Clustal W进行多序列对比。使用MEGA 5.10进行系统发生分析,采用最大似然法(maximum-likelihood)构建系统进化树,并使用基于1 000次重复的自展值分析进化树的可靠性。

    • 将4 ℃保藏的菌株接种到新鲜的LB斜面培养基,37 ℃恒温培养箱中培养24 h,然后刮取斜面上少量菌体接种到LB液体培养基中,恒温振荡培养箱中37 ℃、180 r·min–1培养24 h。

    • 1)孔雀石绿降解动力学曲线。将活化好的菌株按终质量浓度为0.1 g·L–1干质量的接种量接种到孔雀石绿终质量浓度分别为5 mg·L–1、10 mg·L–1、20 mg·L–1的LB液体培养基中,初始pH为7,在37 ℃、180 r·min–1的恒温振荡培养箱中培养,分别在第1、第2、第4、第6、第8、第10、第12和第24小时取样分析,测定菌株孔雀石绿降解率。2)孔雀石绿质量浓度对菌株孔雀石绿降解的影响。将活化好的菌株按终质量浓度为0.1 g·L–1干质量的接种量接种到孔雀石绿终质量浓度分别为1 mg·L–1、5 mg·L–1、10 mg·L–1、20 mg·L–1和40 mg·L–1的LB液体培养基中,初始pH为7,在37 ℃、180 r·min–1的恒温振荡培养箱中培养12 h后取样分析,测定菌株生物量和孔雀石绿降解率。3)初始pH对菌株孔雀石绿降解的影响。将活化好的菌株按终质量浓度为0.1 g·L–1干质量的接种量接种到孔雀石绿终质量浓度为20 mg·L–1的LB液体培养基中,用氢氧化钠(NaOH)和盐酸(HCl)溶液调pH分别至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0,在37 ℃、180 r·min–1的恒温振荡培养箱中培养12 h后取样分析,测定菌株生物量和孔雀石绿降解率。4)盐度对菌株孔雀石绿降解的影响。将活化好的菌株按终质量浓度为0.1 g·L–1干质量的接种量接种到孔雀石绿终质量浓度为20 mg·L–1和NaCl终质量浓度分别为10 g·L–1、20 g·L–1、30 g·L–1、40 g·L–1、60 g·L–1和80 g·L–1的LB液体培养基中,初始pH为7,在37 ℃、180 r·min–1的恒温振荡培养箱中培养12 h后取样分析,测定菌株生物量和孔雀石绿降解率。5)温度对菌株孔雀石绿降解的影响。将活化好的菌株按终质量浓度为0.1 g·L–1干质量的接种量接种到含有孔雀石绿终质量浓度为20 mg·L–1的LB液体培养基中,分别置于15 ℃、25 ℃、37 ℃和40 ℃恒温震荡培养箱中,转速180 r·min-1培养12 h后取样分析。6)金属离子对菌株孔雀石绿降解的影响。将活化好的菌株按终质量浓度为0.1 g·L–1干质量的接种量接种到孔雀石绿终质量浓度为20 mg·L–1的LB液体培养基中,分别加入氯化铜(CuCl2)、氯化铅(PbCl2)、氯化铁(FeCl3)、氯化钙(CaCl2)、氯化锌(ZnCl2)、氯化镁(MgCl2)和氯化锰(MnCl2),使金属离子的终浓度分别为0.1 mmol·L–1、0.2 mmol·L–1、0.5 mmol·L–1、1 mmol·L–1和2 mmol·L–1,初始pH为7,在37 ℃、180 r·min–1的恒温振荡培养箱中培养12 h后取样分析,测定菌株生物量和孔雀石绿降解率。

    • 采用硼氢化钾还原-高效液相色谱法对孔雀石绿进行检测。准确称取孔雀石绿标准品,乙腈溶解,配制成质量浓度为1 g·L–1的储备液,加入硼氢化钾充分还原,用乙腈稀释至0.002 5 mg·L–1、0.01 mg·L–1、0.05 mg·L–1、0.125 mg·L–1、0.25 mg·L–1、0.5 mg·L–1、1 mg·L–1、2 mg·L–1和4 mg·L–1等质量浓度的工作溶液,0.22 μm膜过滤,高效液相色谱检测。根据孔雀石绿质量浓度和峰面积绘制孔雀石绿标准曲线。

      将在不同实验条件下取样后的培养液8 000 r·min–1离心 5 min,取0.8 mL上清液于10 mL离心管中,加入0.2 mol·L–1硼氢化钾溶液40 μL,涡旋振荡充分还原,加入7.16 mL乙腈溶液,振荡混匀;上样前先过0.22 μm滤膜,根据孔雀石绿标准曲线计算不同处理后培养液的孔雀石绿质量浓度。

      液相色谱的色谱柱为C18柱,250 mm×4.6 mm(内径),粒度5 μm;流动相为V乙腈+V乙酸铵缓冲溶液=80+20 (0.125 mol·L–1,pH 4.5);柱温为38 ℃;激发波长为265 nm,发射波长为360 nm;流速为1.5 mL·min–1;进样量为50 μL。

      孔雀石绿降解率的计算:

      式中R为菌株孔雀石绿降解率(%),C0为不接菌液的LB培养基中孔雀石绿质量浓度(mg·L–1),Ct为接入菌液的LB培养基中孔雀石绿质量浓度(mg·L–1)。

    • 本实验采用干质量法测定菌株的生物量,将在不同实验条件下取样后的培养液8 000 r·min–1离心5 min,菌体用蒸馏水洗涤2次,80 ℃烘至恒重后称质量,计算生物量。

    • 每个实验处理重复3次,实验结果均以平均值±标准偏差表示。采用SPSS 18.0软件对数据进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),应用多重比较Tukey检测对各个实验组数据之间的差异性进行检验,每个图中数据之间无相同字母为差异显著,P<0.05。

    • 孔雀石绿标准品经硼氢化钾还原后的高效液相色谱图见图1-a,峰形对称尖锐,而且具有较好的分离度;图1-b为孔雀石绿的质量浓度与峰面积的相关曲线,0.002 5~4 mg·L–1孔雀石绿质量浓度与峰面积具有良好的线性关系,相关系数R2=0.999 95。

      图  1  隐性孔雀石绿高效液相色图谱 (a) 和孔雀石绿的质量浓度与峰面积的相关曲线 (b)

      Figure 1.  HPLC chromatogram of leucomalachite green (a) and curve of relativity of mass concentration of malachite green and peak area (b)

    • 菌株B-20经革兰氏染色显微镜观察为革兰阴性菌,在LB固体培养基上培养,菌落呈圆形,中间凸起,凸起中心有核,直径为2~5 mm,表面光滑湿润柔软,结合紧密。将菌株B-20的16S rRNA基因序列在NCBI中比对分析后发现,其与多种肠杆菌属(Enterobacter)的菌株相似度较高。选择到目前为止合格发表的全部Enterobacter标准菌株的16S rRNA基因序列与B-20的16S rRNA基因序列构建系统进化树(图2)。经计算,菌株B-20 16S rRNA基因序列与Enterobacter muelleri JM-458 KP345900的距离最近,两者同源性为99%,由此初步确定所分离的孔雀石绿降解菌株B-20为Enterobacter sp. B-20。

      图  2  利用最大似然法构建的菌株B-20的系统进化树

      Figure 2.  Systemic phylogenetic tree of strain B-20 constructed by method of maximum likelihood

    • Enterobacter sp. B-20对不同质量浓度孔雀石绿(5~20 mg·L–1)的降解动力学曲线见图3。结果发现,随着时间的增加,菌株Enterobacter sp. B-20对不同质量浓度孔雀石绿的降解率均呈逐渐上升的趋势;相同时间条件下孔雀石绿的质量浓度越低,菌株的孔雀石绿降解率越高。菌株在第1~第4小时内对孔雀石绿降解相对缓慢,推测菌体生长可能处于延滞期,第4小时之后菌体适应了生长环境,其生物量迅速积累,孔雀石绿降解也随之加快,随着培养时间达到第24小时,培养环境中的孔雀石绿几乎完全降解,菌株对不同质量浓度孔雀石绿(5~20 mg·L–1)的降解率均超过97%。这比报道的黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)[22]Raoultella sp.[18]对低质量浓度孔雀石绿降解能力都要强。结果表明,菌株Enterobacter sp. B-20具有在低质量浓度孔雀石绿条件下降解孔雀石绿的应用前景。

      图  3  Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解动力学曲线

      Figure 3.  Dynamic curve of malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    • 不同孔雀石绿质量浓度(1~40 mg·L–1)对Enterobacter sp. B-20的生长和孔雀石绿降解的影响见图4。随着孔雀石绿质量浓度的升高,菌株的生物量逐渐下降。与正常培养组相比,孔雀石绿(5~40 mg·L–1)的添加显著抑制了菌株的生长,表明孔雀石绿对菌株有一定毒害作用。与菌株生物量变化相似,菌株的孔雀石绿降解率随着孔雀石绿质量浓度的升高呈逐渐下降的趋势。孔雀石绿质量浓度为1 mg·L–1时菌株的降解效果最好(92.2%);孔雀石绿质量浓度升高到40 mg·L–1时,孔雀石绿的降解效果相对较低,但降解率仍达到82.4%。

      图  4  孔雀石绿初始质量浓度对Enterobacter sp. B-20生长和降解的影响

      Figure 4.  Effect of mass concentration of malachite green on growth and malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    • 养殖环境水质复杂,pH是微生物降解染料的重要环境影响因素之一,环境pH既能影响菌株的生长繁殖又能影响孔雀石绿降解相关酶活性。不同pH (4~9)对Enterobacter sp. B-20在含有20 mg·L–1孔雀石绿培养基中的生长和孔雀石绿降解的影响见图5。随着pH的增高,菌株的生物量呈现先增加后下降的趋势,并在pH为6的条件下菌株的生物量达到最大(1.27 g·L–1干质量)。与生物量的变化趋势不同,菌株孔雀石绿降解率随着pH的增加而显著提高,最适降解pH为9,孔雀石绿降解率达到95.8%。这与孔雀石绿降解菌Sphingomonas paucimobilis[23]Ceriporia lacerata P2[24]的最适降解pH一致。这可能与高pH环境更利于孔雀石绿降解相关酶发挥作用有关。有报道称,三苯甲烷类还原酶在pH 9.0和60 ℃具有最大活力[19]。本研究中菌株对酸性环境非常敏感,pH为4时,菌株的孔雀石绿降解能力受到显著抑制,这可能与此条件下菌株生长受到显著抑制有很大关系。结果表明,Enterobacter sp. B-20具有较强的酸碱适应性并能够在较宽的pH (5~9)范围内降解孔雀石绿。

      图  5  初始pH对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响

      Figure 5.  Effect of initial pH on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    • 养殖环境水中往往含有大量的盐,高盐环境会影响微生物细胞的渗透压,从而使微生物降低或丧失脱色染料的能力[25]。不同NaCl质量浓度10~80 g·L–1Enterobacter sp. B-20在含有20 mg·L–1孔雀石绿培养基中的生长和孔雀石绿降解的影响见图6。随着NaCl质量浓度的增高,菌株在含孔雀石绿培养基中的生物量呈现逐渐下降的趋势。菌株在10~40 g·L–1的NaCl质量浓度内表现出稳定的孔雀石绿降解能力,随着NaCl质量浓度超过60 g·L–1,菌株孔雀石绿降解率显著下降,但降解率仍超过56%,生物量的下降可能是孔雀石绿降解率显著下降的重要原因。这与何兴兵等[26]发现的高浓度NaCl抑制孔雀石绿降解的研究结果相似。微生物耐盐性是影响其能否正常应用的重要因素之一[24,27],在本研究中,Enterobacter sp. B-20表现出较强的耐盐性,具有在高盐环境下降解孔雀石绿的应用潜力。

      图  6  氯化钠质量浓度对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响

      Figure 6.  Effect of NaCl concentration on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    • 养殖环境受外部环境影响明显,不同养殖环境的温度往往差别较大,而温度能够明显影响微生物的生长和代谢,进而影响其孔雀石绿的降解能力。不同温度(15~40 ℃)对Enterobacter sp. B-20在含有20 mg·L–1孔雀石绿培养基中的生长和孔雀石绿降解的影响见图7。结果显示,温度15~40 ℃ Enterobacter sp. B-20的生物量和孔雀石绿降解率随着温度的升高而呈现上升的趋势。菌株在15 ℃的孔雀石绿降解率显著下降,这可能与低温不利于该菌生长有关。Enterobacter sp. B-20在40 ℃时的生物量和孔雀石绿降解率都达到最大,分别为1.47 g·L–1干质量和88.67%。Enterobacter sp. B-20在25~40 ℃的孔雀石绿降解率均在75%以上,表明该菌具有在广阔温度范围内降解孔雀石绿的应用潜力。

      图  7  温度对Enterobacter sp. B-20降解孔雀石绿的影响

      Figure 7.  Effect of temperature on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    • 金属离子在微生物降解染料的过程中具有重要的作用,同时大多养殖环境中含有各种各样的金属离子,其可通过不同途径影响微生物的降解过程。不同浓度(0~2 mmol·L–1)锌离子(Zn2+)、铁离子(Fe3+)、铜离子(Cu2+)、锰离子(Mn2+)、镁离子(Mg2+)、铅离子(Pb2+)和钙离子 (Ca2+) 对Enterobacter sp. B-20在含有20 mg·L–1孔雀石绿培养基中的生长和降解的影响见图8。随着Zn2+浓度的增加,Enterobacter sp. B-20的生物量逐渐下降。与不添加Zn2+相比,Zn2+浓度在0.1~1 mmol·L–1Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解没有显著性影响,这与房桂华[28]所选用的菌株Arthrobacter sp.在0.5 mmol·L–1 Zn2+环境下的降解特性一致。Enterobacter sp. B-20的生物量在0~1 mmol·L–1Fe3+没有显著性变化,但是在2 mmol·L–1 Fe3+作用下显著下降。与Zn2+对孔雀石绿降解率的影响不同,添加0.1~1 mmol·L–1的Fe3+显著提高菌株的孔雀石绿降解率。这个结果与Xu等[29]的报道一致。Fe3+的添加能引起孔雀石绿降解率的提高,可能由于Fe是微生物体内细胞色素、水解酶、氧化酶、氢化酶以及歧化酶等的主要成分[30],这些酶可能与孔雀石绿的降解有关。但是随着Fe3+浓度增加到2 mmol·L–1,孔雀石绿降解率显著下降。与不添加Cu2+相比,Enterobacter sp. B-20的生物量在添加0.1~1 mmol·L–1 Cu2+后没有显著性变化,但是在添加2 mmol·L–1 Cu2+后显著下降到0.78 g·L–1。与Zn2+对孔雀石绿降解率的影响相似,添加0.1~0.5 mmol·L–1的Cu2+显著提高菌株的孔雀石绿降解率。漆酶是一类含铜(Cu)的多酚氧化酶,有报道称漆酶在孔雀石绿降解上发挥着重要作用[31]。本研究中Cu2+的添加可能促进漆酶的合成,从而促进孔雀石绿降解。但是随着Cu2+浓度增加到2 mmol·L–1,菌株的孔雀石绿降解率显著下降,这可能与菌株的生长受到显著抑制有关。与不添加Mn2+相比,添加0.1~2 mmol·L–1 Mn2+Enterobacter sp. B-20的生物量没有显著性影响。0.1 mmol·L–1 Mn2+能够显著提高菌株孔雀石绿降解率,添加0.2~1 mmol·L–1 Mn2+对菌株孔雀石绿降解率影响不大,而Mn2+浓度增加到2 mmol·L–1则起到显著抑制孔雀石绿降解的作用。有报道称,锰过氧化物酶的表达受培养基中Mn2+的调节[32],而锰过氧化物酶与孔雀石绿降解有关。李旭东等[33]研究发现锰过氧化物酶的活性在孔雀石绿脱色后升高,并且锰离子添加能够促进孔雀石绿脱色。本研究中Mn2+的添加可能促进浓度依赖型锰过氧化物酶基因的表达,从而促进菌株的孔雀石绿降解作用。与Mn2+Enterobacter sp. B-20的生物量变化影响相似,添加0.1~2 mmol·L–1Mg2+与不添加Mg2+菌株的生物量没有显著性差异。随着Mg2+浓度的增加,菌株孔雀石绿降解率逐渐下降,但Mg2+浓度达到2 mmol·L–1时,菌株孔雀石绿降解率仍能达到85.64%。Pb2+Enterobacter sp. B-20的生物量和孔雀石降解的影响与Fe3+的影响相似,菌株的生物量在0~1 mmol·L–1 Pb2+没有显著性变化,但在2 mmol·L–1 Pb2+作用下显著下降,添加0.1~1 mmol·L–1的Pb2+显著提高菌株的孔雀石绿降解率。这与梅嬛等[34]的研究结果相似,添加0.5 mmol·L–1 Pb2+提高菌株Raoultella sp.的孔雀石绿脱色能力。添加0.1~2 mmol·L–1Ca2+与不添加Ca2+Enterobacter sp. B-20的生物量没有显著性差异,高浓度Ca2+对菌株的生长有促进作用。添加0.1~1 mmol·L–1 Ca2+对菌株的孔雀石绿降解率没有显著性影响,但是当Ca2+浓度超过2 mmol·L–1时,孔雀石绿降解率显著下降。

      图  8  金属离子对Enterobacter sp. B-20孔雀石绿降解的影响

      Figure 8.  Effect of metal ions on malachite green degradation of Enterobacter sp. B-20

    • 从受孔雀石绿污染的淡水鱼养殖池塘底泥中,筛选到一株高效降解孔雀石绿的菌株,经16S rRNA基因序列及系统进化树分析,初步鉴定为Enterobacter sp. B-20。Enterobacter sp. B-20对1~40 mg·L–1孔雀石绿有较强的降解能力,12 h内对1 mg·L–1孔雀石绿降解率达到92.2%,对其他高浓度组的降解率超过82%,24 h内对5~20 mg·L–1孔雀石绿降解率均超过97%。Enterobacter sp. B-20的孔雀石绿降解率随着pH的增加而显著提高,最适降解pH为9。Enterobacter sp. B-20具有较强的耐盐性,在10~40 g·L–1的NaCl质量浓度具有稳定的孔雀石绿降解特性。在高浓度Zn2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+、Mg2+、Pb2+和Ca2+等金属离子条件下,Enterobacter sp. B-20表现出较强的耐性及稳定的孔雀石绿降解能力,而且0.1~1 mmol·L–1 Fe3+、0.1~0.5 mmol·L–1Cu2+、0.1 mmol·L–1 Mn2+、0.1~1 mmol·L–1 Pb2+均能显著提高菌株的孔雀石绿降解率。

参考文献 (34)

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