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斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

刘倩 江世贵 邱丽华 黄建华 周发林 杨其彬 姜松 杨丽诗

引用本文:
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斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

    作者简介: 刘倩(1991-), 女, 硕士研究生, 从事水产动物遗传育种与分子生物学研究。E-mail:chalinsj@ 163.com;
    通讯作者: 杨丽诗, yangls2016@163.com
  • 基金项目: 现代农业(虾)产业体系建设专项资金 CARS-47
    国家自然科学基金项目 31202019
    广东省科技创新青年拔尖人才项目 2015TQ01N583
    广州市珠江科技新星专项 201506010054

  • 中图分类号: Q172

Immune function and expression of Toll9 receptor gene from Penaeus monodon

    Corresponding author: Lishi YANG, yangls2016@163.com
  • CLC number: Q172

  • 摘要: Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体, 在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(PmToll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型, 通过免疫印迹方法证实PmToll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处PmToll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。qRT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路, 促进通路下游髓样分化因子(MyD88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达, 同时酶联免疫吸附测定结果证明PmToll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活PmToll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达, 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制PmToll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过PmToll9激活Toll信号通路, 引起机体免疫防御反应, 而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。
  • 图 1  PmToll9在HEK293T细胞中的蛋白水平

    Figure 1.  PmToll9 protein level in HEK293T cells

    图 2  PmToll9梯度转染HEK293T细胞荧光值变化(100~500 ng)

    Figure 2.  Change of fluorescence value of HEK293T cells transfected with PmToll9 gradient

    图 3  PmToll9对HEK293T细胞TLR通路下游因子的激活表达

    Figure 3.  Expression of TLR pathway downstream factors in HEK293T cells after being activated by PmToll9

    图 4  微生物刺激后PmToll9在斑节对虾各组织中不同时间段的mRNA表达情况

    Figure 4.  Relative mRNA expression of PmToll9 in different tissues and at different time after being challenged with microorganism in P.monodon

    表 1  主要相关引物及引物序列

    Table 1.  Primers and sequences mainly used in the study

    引物名称primer 引物序列primer sequence
    ORF-F 5′-CCGGAATTCCATGAAAATGACGGACAACGG-3′
    ORF-R 5′-CCCAAGCTTGATTGGAAAAGGTTCTCACGGA-3′
    pCMV-PmToll9-F 5′-GCTTCTGCAGGAATTCATGAAAATGACGGACAACGG-3′
    pCMV-PmToll9-R 5′-GTTTCTGCTCTCTAGATAACTTCGTCGACGCTGCGA-3′
    MyD88-qF 5′-ACTGGAGAGGGTTGGCTGAA-3′
    MyD88-qR 5′-AGCGATCCATTGCTTCCAAGT-3′
    TNF-α-qF 5′-GGGGTGGAGCTGAGAGATAACC-3′
    TNF-α-qR 5′-ACGGCGATGCGGCTGATG-3′
    IL-10-qF 5′-GGGTTGCCAAGCCTTGTCTG-3′
    IL-10-qR 5′-CGCCGTAGCCTCAGCCTG-3′
    β-actin-F 5′-AATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′
    β-actin-R 5′-AACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′
    PmToll9-qF 5′-TATCCACGAGCGAGACTTCACA-3′
    PmToll9-qR 5′-AAGGACGGCGACAGAACCACTA-3′
    EF-F 5′-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3′
    EF-R 5′-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3′
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出版历程
  • 收稿日期:  2016-02-22
  • 录用日期:  2016-03-21
  • 刊出日期:  2017-10-05

斑节对虾Toll9受体基因免疫功能的研究与表达分析

    作者简介:刘倩(1991-), 女, 硕士研究生, 从事水产动物遗传育种与分子生物学研究。E-mail:chalinsj@ 163.com
    通讯作者: 杨丽诗, yangls2016@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所, 农业部南海渔业资源开发利用重点实验室, 广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306
基金项目:  现代农业(虾)产业体系建设专项资金 CARS-47国家自然科学基金项目 31202019广东省科技创新青年拔尖人才项目 2015TQ01N583广州市珠江科技新星专项 201506010054

摘要: Toll受体蛋白(Toll receptors)是一类重要的模式识别受体, 在无脊椎动物先天性免疫系统中发挥重要作用。文章对斑节对虾(Penaeus monodon)新型Toll9受体基因(PmToll9)进行了研究:以人源胚胎肾细胞(HEK293T)成功构建体外细胞免疫模型, 通过免疫印迹方法证实PmToll9重组真核蛋白可在HEK293T中成功表达。双荧光素酶报告系统检测发现在200 ng转染浓度处PmToll9对NF-κB报告基因的激活效果显著。qRT-PCR数据证明PmToll9成功激活HEK293T细胞Toll-like receptor(TLR)信号通路, 促进通路下游髓样分化因子(MyD88)、肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素(IL-10)的上调表达, 同时酶联免疫吸附测定结果证明PmToll9可促进TNF-α蛋白表达水平显著上调。斑节对虾体内细菌刺激实验结果显示无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)可激活PmToll9在肝胰腺、肠、淋巴和鳃中的表达, 哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)可显著抑制PmToll9在肝胰腺中的表达。提示无乳链球菌可通过PmToll9激活Toll信号通路, 引起机体免疫防御反应, 而哈维氏弧菌对此过程具有一定的抑制作用。

English Abstract

  • 先天性免疫是无脊椎动物对抗外源刺激的第一道防线, 可通过一套识别分子非特异地识别各种各样的外源物质。Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)是先天性免疫模式识别受体(pattern recognition receptor, PRR)中一类重要模式识别受体, 在抵御外源病原微生物入侵过程中发挥着重要作用[1]。Toll样受体通过特异性识别病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP)分子, 将病原入侵的信号通过胞内级联免疫反应传递到细胞核内, 促进各类免疫相关分子的转录、表达与释放, 从而激活先天性免疫系统[2]。Toll样受体最早在果蝇(Drosophila melanogaster)中发现(即Toll1), 调控果蝇生长发育并诱导合成抗菌肽, 参与免疫反应[3-4]。随后陆续在果蝇中发现9种Toll受体, Toll2主要通过Rho-GTPase信号通路介导果蝇胚胎上皮细胞的顶端收缩[5]; Toll7和Toll8可能参与果蝇的生长调控[6]; Toll9则通过细胞内过表达启动免疫基因的转录, 激活免疫反应[7]。在哺乳动物体内发现的与果蝇Toll样受体具有高度同源的蛋白被称为Toll样受体(TLRs)。迄今为止, 在人类体内发现11种TLRs, 小鼠(Mus musculus)中发现13种[8-9]。TLRs属于Ⅰ型跨膜蛋白, 在进化过程中高度保守, 主要由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。TLRs胞外区富含亮氨酸(Leu)重复, 主要介导细胞外配体的识别; 跨膜区富含半胱氨酸(Cys), 而胞内区Toll/IL-1受体同源区(Toll/IL-1-receptor homologous region, TIR)负责将信号传递到接头分子[2]。TIR区域活化后可引发胞内一系列免疫因子的产生和传导, 如髓样分化因子(MyD88)、NF-κB、前炎性细胞活素等Toll通路相关因子, 从而发挥免疫作用。

    斑节对虾(Penaeus monodon)是中国沿海地区重要的经济养殖品种。随着养殖环境恶化及各类病毒、细菌性疾病的爆发, 斑节对虾养殖业面临极大挑战。了解其先天性免疫防御机制、采取有效手段增强其抗病力是重要的解决方法[10-11]。对虾主要依靠先天性免疫途径来进行免疫调控与防御[12], 而Toll受体作为先天性免疫系统的重要部分, 也取得了极大的研究进展。2007年虾类首个Toll受体在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)中得到鉴定[13]。随后, 斑节对虾[14-16]、中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)[17]、日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)[18]、罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)[19]、克氏原螯虾(Procambium clarkii)[20]等多种对虾的Toll受体基因被克隆。对虾Toll受体在多个组织广泛分布, 在细菌侵染条件下表达上调, 对对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus, WSSV)的感染有一定的表达变化, 提示Toll受体在对虾先天性免疫系统中扮演着重要的角色[14, 17, 20-22]。文章根据斑节对虾新型Toll9受体基因(PmToll9, GenBank登录号为KY438975)对Toll/TLR信号通路的调控作用进行了研究, 从分子生物学角度阐述了PmToll9在斑节对虾天然免疫系统中的生物学机制, 以期为对虾病害控制提供必要的理论基础。

    • 实验用斑节对虾均来自于中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地, 体质量为(22±1)g, 实验前在海水盐度为33水泥池中暂养3 d, 温度(25±1)℃。取数尾斑节对虾肝胰腺组织用RNAlater保存, 其余健康对虾用于细菌感染实验。人源胚胎肾细胞HEK293T由上海海洋大学国家水生动物病原库吕利群教授馈赠, 用DMEM高糖培养液(含105 U ·L-1青霉素和100 mg · L-1链霉素)在含有5%二氧化碳(CO2)、37 ℃条件下进行培养。在转染前24 h, 将生长状态良好的细胞铺于24孔板, 待细胞密度达到60%~70%时再进行转染工作[23]

      真核表达载体pCMV-c-myc, RIPA buffer和myc-tag单抗购自碧云天生物有限公司; pNF-κB-luc和pRL-TK质粒, 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒, 质粒小提试剂盒和双荧光素酶报告系统检测试剂盒购自Promega公司; RNAlater、TRIzol试剂、Lipotamine 3000购自英潍捷基公司; HRP/DAB显色试剂盒, DNA Marker 5000和DH5α感受态细胞购自天根生物科技(北京)有限公司; 肿瘤坏死因子(TNF-α)ELISA检测试剂盒购自博士德生物公司; cDNA第一链合成试剂盒, pMD-19T载体连接体系, EcoR I和Xba I内切酶, SYBR Premix Ex TaqTMKit购自宝生物工程有限公司; DEPC、X-gal、IPTG和氨苄青霉素等购自广东普博生物有限公司。

    • 按TRIzol(Invitrogen, 美国)说明书提取不同组织的总RNA, 电泳检测RNA的完整性。取2 μg总RNA, 以Oligo(dT)18为引物, 用Primer ScriptTM 1st strand cDNA Synthesis Kit试剂盒合成cDNA第1条链, -20 ℃保存备用。

    • 以逆转录产物为模板, 使用ORF-F/R(表 1)扩增获得PmToll9开放阅读框全长, 反应程序为95 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s, 58~64 ℃退火30 s, 72 ℃延伸45 s, 30个循环; 72 ℃延伸10 min。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳后, 目的片段用PCR产物胶回收试剂盒回收并连入pMD19-T载体(PmToll9-T)。克隆测序正确后大量抽提, 用作后续实验模板。

      引物名称primer 引物序列primer sequence
      ORF-F 5′-CCGGAATTCCATGAAAATGACGGACAACGG-3′
      ORF-R 5′-CCCAAGCTTGATTGGAAAAGGTTCTCACGGA-3′
      pCMV-PmToll9-F 5′-GCTTCTGCAGGAATTCATGAAAATGACGGACAACGG-3′
      pCMV-PmToll9-R 5′-GTTTCTGCTCTCTAGATAACTTCGTCGACGCTGCGA-3′
      MyD88-qF 5′-ACTGGAGAGGGTTGGCTGAA-3′
      MyD88-qR 5′-AGCGATCCATTGCTTCCAAGT-3′
      TNF-α-qF 5′-GGGGTGGAGCTGAGAGATAACC-3′
      TNF-α-qR 5′-ACGGCGATGCGGCTGATG-3′
      IL-10-qF 5′-GGGTTGCCAAGCCTTGTCTG-3′
      IL-10-qR 5′-CGCCGTAGCCTCAGCCTG-3′
      β-actin-F 5′-AATCCTGTGGCATCCATGAAAC-3′
      β-actin-R 5′-AACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3′
      PmToll9-qF 5′-TATCCACGAGCGAGACTTCACA-3′
      PmToll9-qR 5′-AAGGACGGCGACAGAACCACTA-3′
      EF-F 5′-AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT-3′
      EF-R 5′-CGTGGTGCATCTCCACAGACT-3′

      表 1  主要相关引物及引物序列

      Table 1.  Primers and sequences mainly used in the study

      PmToll9-T为模板, 由特异性引物pCMV-PmToll9-F, pCMV-PmToll9-R进行扩增(表 1), 引物5′端加入EcoR I/Xba I酶切位点, 双酶切PmToll9和pCMV-c-myc, 用T4连接酶连接, 转化到DH5α感受态细胞并挑取阳性克隆进行测序。测序正确的阳性克隆根据Promega公司质粒小提试剂盒说明书提取质粒, 用紫外分光光度计检测浓度后置于-20 ℃保存备用。

    • 转染前24 h将HEK293T细胞扩大培养, 按每孔3×105个接种于6孔板中。用脂质体LipofectamineTM 3000进行转染, 分别转染空载pCMV-c-myc、重组质粒pCMV-PmToll9和不转入DNA的空白对照。6 h后更换为新鲜完全培养基继续培养至第24小时。用适量细胞蛋白裂解液提取总蛋白, 并进行10% SDS-PAGE凝胶电泳。将蛋白转至硝酸纤维素膜(NC, Millipore, 美国)。用PBST清洗1次, 5%脱脂牛奶室温下封闭2 h, PBST清洗3次, 每次5 min, 用NC膜孵育一抗(myc-Tag鼠抗, 1:1 000), 4 ℃过夜; PBST清洗3次, 每次10 min, 加入二抗(羊抗鼠IgG-HRP, 1:1 000)在37 ℃下孵育1 h, PBST清洗后即用HRP/DAB显色试剂盒避光显色。

    • 转染前24 h, HEK293T细胞铺于24孔板, 待细胞密度达到60%~70%进行转染工作。转染分为A、B两组, A组将pCMV-Toll9(100 ng、200 ng、500 ng)、pNF-κB-luc(100 ng)和pRL-TK(10 ng)共转染HEK293T细胞; B组(对照组)将空载pCMV-c-myc(100 ng、200 ng、500 ng)、pNF-κB-luc(100 ng)和pRL-TK(10 ng)共转染HEK293T细胞(以上各转染数均为单孔转染量)。每组3个重复, 转染24 h后, 用预冷的PBS清洗2次, 1×positive lysis buffer裂解细胞后用双荧光素酶报告系统检测试剂盒进行细胞荧光值检测。

    • 基于1.2.4, 使用PmToll9最适转染浓度转染HEK293T细胞(具体转染方法同1.2.4)。24 h后收集样品, RNA抽提后合成cDNA进行定量实验。特异性定量引物见表 1, β-acitn作为内参。以逆转录产物为模板, 按照SYBR Premix Ex TaqTM Kit说明书配制反应液。反应液总体积为12.5 μL, 含6.25 μL SYBR®Premix Ex Taq(2×), 上下游引物各0.5 μL, 1 μL cDNA模板和4.25 μL DEPC水。目的基因和内参基因各设置3个重复, 使用罗氏LC480定量仪器进行实验, 各因子相对表达量计算采用2-ΔΔCt法。

    • 将1.2.5的同批细胞用PBS清洗1次后, 每孔用100 μL预冷的RIPA buffer裂解细胞。高速离心后取上清进行蛋白定量, 加入到预包被抗人TNF-α抗体的96孔酶标板中, 同时添加重组人TNF-α梯度稀释液作为对照, 每组实验重复3次。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后, PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应, 经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色, 并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的TNF-α呈正相关。

    • 为验证不同微生物刺激对斑节对虾Toll免疫因子表达的激活作用, 实验中对健康斑节对虾进行微生物刺激。实验分为2组:1)注射无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)(革兰氏阳性菌); 2)注射哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)(革兰氏阴性菌), 同时以注射PBS和不注射组作为对照。刺激后分别在第0、第6、第12、第24、第36、第48、第72和第96小时取对虾肝胰腺、肠、淋巴和鳃等组织, 抽提RNA后合成cDNA进行定量实验, 延伸因子1ɑ(EF-1ɑ)作为内参基因(表 1)。样品处理参考史进选等[24]

    • 报告系统数据取检测的萤火虫荧光素酶荧光值(A)与海肾荧光素酶荧光值(B)的比值, 若实验组比值显著大于对照组, 则信号通路被激活, 反之则不具备激活作用。定量实验以SPSS 23.0进行数据单因素方差分析(One-Way ANOVA), 结果以“平均值±标准差(X ±SD)”表示, P <0.05为差异显著, P <0.01为差异极显著。

    • 由于对虾中未建立细胞系, 只能利用现有细胞系进行功能研究。此实验选用真核细胞HEK293T进行。PmToll9开放阅读框全长为3 045 bp, 预测蛋白大小为115.8 kD。Western Blot结果显示在HEK293T细胞中, pCMV-PmToll9表达产物在110 kD左右有单一条带(图 1), 符合预测蛋白的大小。说明pCMV-PmToll9重组质粒被成功转染到HEK293T细胞, 并成功表达真核蛋白。

      图  1  PmToll9在HEK293T细胞中的蛋白水平

      Figure 1.  PmToll9 protein level in HEK293T cells

    • 结果显示, 在100~200 ng转染梯度处, PmToll9显著激活NF-κB启动子并具有一定的浓度依赖效应(图 2)。在200 ng转染浓度时表达值最高, 相比对照组上调表达2.3倍(P <0.01)。转染量为500 ng时, PmToll9对NF-κB启动子的激活作用不明显, 仅1.4倍, 说明高浓度的重组质粒并不能显著增强NF-κB启动子的激活作用。200 ng PmToll9转染浓度能显著激活NF-κB, 故200 ng为HEK293T细胞模型中重组质粒最适转染浓度。

      图  2  PmToll9梯度转染HEK293T细胞荧光值变化(100~500 ng)

      Figure 2.  Change of fluorescence value of HEK293T cells transfected with PmToll9 gradient

    • PmToll9可活化NF-κB信号转导途径, 促进NF-κB相关因子的表达上调。定量结果表明PmToll9可激活HEK293T细胞TLR信号通路, 促进MyD88、TNF-α、白介素(IL-10)的上调表达, 相比对照组分别上升2.08倍、2.19倍和2.15倍(图 3-A)。

      图  3  PmToll9对HEK293T细胞TLR通路下游因子的激活表达

      Figure 3.  Expression of TLR pathway downstream factors in HEK293T cells after being activated by PmToll9

    • 基于该免疫功能研究模型, ELISA检测结果显示转染PmToll9后TNF-α表达水平显著上调, 为对照组的3.45倍(图 3-B, P <0.05), 说明PmToll9可通过激活TLRs信号通路, 从而促进下游免疫因子TNF-α的释放。

    • 通过向健康对虾体内注射无乳链球菌和哈维氏弧菌, 定量检测微生物刺激下PmToll9在斑节对虾肝胰腺、肠、淋巴和鳃4个组织中的表达, 发现在一定时间点显著变化, 并未随时间呈现规律性变化(图 4)。无乳链球菌注射后, PmToll9在肝胰腺(第12小时)、肠(第12、第24小时)、淋巴(第48小时)和鳃(第6、第24小时)组织呈现显著性表达上调, 其表达最高值分别是对照组的7.65倍、4.15倍、4.16倍和3.45倍(P < 0.01);而在肝胰腺(第36小时)、淋巴(第24、第72、第96小时)和鳃(第12小时)组织PmToll9表达水平则显著下降。哈维氏弧菌感染后, PmToll9在肝胰腺(第6~第72小时)表达被显著抑制, 第24小时处下调至最低(下调幅度为98%, P < 0.01), 至第96小时回复正常表达水平; 在肠组织(第72小时处)PmToll9表达被显著抑制(下调幅度为97%, P < 0.01);在淋巴器官中PmToll9的表达在第24、第48和第96小时均被显著抑制, 其中第72小时达到最低值, 下调幅度达99%(P < 0.01), 抑制表达效果明显; 鳃组织(第12小时)PmToll9的表达被显著抑制(下调幅度达98%, P < 0.01), 而在其他时间点抑制表达作用不明显。即革兰氏阳性菌能激活PmToll9表达, 在肝胰腺中PmToll9反应最为灵敏, 其次为鳃、肠、淋巴, 而革兰氏阴性菌的感染对PmToll9的表达具有一定的抑制作用, 在肝胰腺中抑制作用最为明显。

      图  4  微生物刺激后PmToll9在斑节对虾各组织中不同时间段的mRNA表达情况

      Figure 4.  Relative mRNA expression of PmToll9 in different tissues and at different time after being challenged with microorganism in P.monodon

    • 该研究首先利用HEK293T细胞构建了体外细胞免疫模型, 并成功表达出PmToll9的真核蛋白, 大小约为110 kD, 与软件预测的115.8 kD接近。该蛋白不含信号肽序列, 预测含有12个糖基化位点(数据未展示)。实验中PmToll9在不同转染浓度下呈现差异性表达, 在200 ng转染浓度时具有较高的激活表达作用。前期实验证明PmToll9未能激活ISRE和IFN-β启动子(数据未展示), 而该实验中PmToll9对NF-κB启动子具有明显激活作用, 说明NF-κB可作为PmToll9诱导TLR信号通路的典型报告基因。已有研究发现凡纳滨对虾LvToll2和克氏原螯虾PcToll受体均可激活NF-κB启动子, 而凡纳滨对虾Toll1和Toll3则在CpG ODN刺激后显著激活ISRE报告基因的活性[20, 22, 25]。由于NF-κB介导下游IL-10、TNF-α等炎症因子的激活, 而ISRE主要被IFN调控激发抗病毒反应, 因此PmToll9可能具有与LvToll2相似而异于LvToll1和LvToll3的功能。

      该研究定量结果显示PmToll9可诱发TLR通路MyD88、TNF-αIL-10表达上调, 同时ELISA方法进一步证实PmToll9可促进TNF-α蛋白水平上升, 提示该免疫模型中MyD88-NF-κB-TNF-α信号通路被激活。事实上, 哺乳动物TLR传递信号主要通过MyD88依赖性途径和MyD88非依赖性途径2种途径[26]。2种信号传递途径均可以启动下游3种转录因子NF-κB、干扰素调节因子3(IRF-3)和激活蛋白1(AP-1)的激活, 促进TNF-α、IL-10等炎症因子以及IFN-α/β等抗病毒因子的释放[27]。TNF-α是炎症反应中最早出现的炎症因子, 能激活淋巴细胞和提高中性粒细胞吞噬能力, 促进细胞增殖和其他细胞因子的合成和释放[28]; IL-10是一种抗炎性因子, 发挥下调炎症反应, 拮抗炎性介质的作用[29]。已有实验结果表明TNF-α、IL-6、IL-1β等因子的诱导产生依赖于NF-κB的激活, 而TNF-α被激活后, 可促进其下游因子IL-6、IL-8、IL-10的有效表达[30]。基于上述结果, 笔者猜想在该细胞免疫模型中, PmToll9可介导细胞模型中TLR-MyD88-NF-κB信号转导途径的激活, 诱导前炎症因子TNF-α-IL-6/IL-8/IL-10/IL-1β的释放, 从而发挥免疫功能。虾体中亦证明了可能存在Toll-MyD88-NF-κB信号转染通路, 并最终激活对虾抗菌肽。LvToll2可通过TLR/MyD88/Tube/Pelle/TRAF6/NF-κB信号级联反应, 显著激活抗菌肽启动子活性[22]; 克氏原螯虾PcToll则明显激活受NF-κB调控的多种抗菌肽启动子的表达, 如Attacin, Metchnikowin, Drosomycin和Penaeidin4[20]; 利用RNAi方法发现栉孔扇贝(Chlamys farreri)cfTLR可能存在MyD88依赖的信号转导途径[31]; 斑节对虾Toll上调伴随下游因子MyD88和TRAF6的上调[32]。因此PmToll9在体内可能具有LvToll2相似功能, 激活TLR/MyD88/Tube/Pelle/TRAF6/NF-kB信号级联反应, 启动抗菌肽合成。

      为确认PmToll9及其介导的信号通路在虾体中是否参与免疫反应, 笔者开展了斑节对虾体内微生物刺激实验。qPCR结果表明革兰氏阳性菌无乳链球菌能激活PmToll9表达, 在肝胰腺中表达变化最为显著; 革兰氏阴性菌哈维氏弧菌对PmToll9的表达具有一定抑制作用, 且在肝胰腺中抑制效果显著。肝胰腺是对虾的重要免疫器官, 淋巴、肠道和鳃也在虾类抵御病原侵袭免疫机制中发挥作用[32]。该研究中肝胰腺中PmToll9对外源刺激的变化灵敏, 说明PmToll9可能参与对革兰氏阳性菌的免疫防御, 可将其作为检测PmToll9的首选组织。无乳链球菌和哈维氏弧菌可激发斑节对虾免疫系统, 促进免疫相关转录因子的表达[33]。革兰氏阳性菌主要成分肽聚糖(PGN)能激活日本囊对虾MjToll表达上调[18]; 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)刺激克氏原螯虾血细胞和肝胰腺中PcToll表达上调[20], 这符合节肢动物Toll受体的基本特征。果蝇Toll受体可对革兰氏阳性菌和真菌的感染产生免疫应答, 通过调控NF-κB家族成员Dorsal/Dif入核启动Drosomycin等抗菌肽表达来抵御感染[34]。对虾和果蝇同属节肢动物门, PmToll9与果蝇DmToll9、冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)AgToll9亲缘关系较近, 推测PmToll9在免疫系统中可能发挥与果蝇Toll9通路相似的功能, 即通过激活经典Toll途径启动抗菌肽表达从而抵御细菌感染。目前也有革兰氏阴性菌调控Toll表达的相关报道。革兰氏阴性菌鳗弧菌(V.anguillarum)感染刺激肠道、肝胰腺、血细胞PcToll表达上调[20], 副溶血弧菌(V.parahemolyticus)能激活PcToll2的表达[35]。该研究中革兰氏阴性菌哈维氏弧菌对PmToll9在4种组织中的表达均有一定抑制效应, 不同的表达变化可能与使用的菌种和剂量有关。其次, 由于革兰氏阴性菌主要被IMD途径识别和防御[36-37], 哈维氏弧菌激发细胞内IMD通路相关因子的转录调控, 从而抑制Toll的转录表达及Toll信号通路的转导。

      综上, 文章基于真核细胞HEK293T成功构建了细胞免疫模型, 通过双荧光素酶报告系统、蛋白水平检测和定量实验得到斑节对虾Toll9基因对TLRs信号通路具有激活效应。微生物刺激实验证明了PmToll9可能参与革兰氏阳性菌的免疫防御。体外细胞免疫模型的构建为进一步在该模型中进行PmToll9过表达、沉默、突变等深入的功能研究提供了有效的技术手段。

参考文献 (37)

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