留言板

尊敬的读者、作者、审稿人, 关于本刊的投稿、审稿、编辑和出版的任何问题, 您可以本页添加留言。我们将尽快给您答复。谢谢您的支持!

姓名
邮箱
手机号码
标题
留言内容
验证码

合浦珠母贝matrilin-1基因的克隆和表达分析

王珍珍 黄桂菊 范嗣刚 刘宝锁 张博 苏家齐 喻达辉

引用本文:
Citation:

合浦珠母贝matrilin-1基因的克隆和表达分析

    作者简介: 王珍珍(1989-),女,硕士研究生,从事水产养殖与生物技术研究。E-mail:360415358@qq.com;
    通讯作者: 喻达辉, pearlydh@163.com
  • 基金项目: 广东省海洋与渔业局科技推广专项 Z2014003
    广东省海洋与渔业局科技推广专项 Z2015009
    广东省海洋与渔业局科技推广专项 A20130102
    现代农业产业技术体系建设专项资金 CARS-48
    国家自然科学基金项目 31372525
    广东省海洋与渔业局科技推广专项 Z2014006
    广东省海洋与渔业局科技推广专项 A201301A08

  • 中图分类号: S917.4

Molecular cloning and expression profiles of matrilin-1 in pearl oyster (Pinctada fucata)

    Corresponding author: Dahui YU, pearlydh@163.com
  • CLC number: S917.4

  • 摘要: 以合浦珠母贝(Pinctada fucata)转录组中的matrilin-1基因片段为基础,开展了matrilin-1的cDNA全长(Pfmatrilin-1)克隆和定量表达分析。Pfmatrilin-1基因cDNA全长2 036 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 194 bp,编码397个氨基酸,包括1个信号肽序列和2个血管性血友病因子A(von Willebrand factor A,VWA)样结构域。系统进化分析显示无脊椎动物的matrilins与脊椎动物的matrilins进化关系较远。荧光定量PCR表达分析结果显示,Pfmatrilin-1 mRNA在合浦珠母贝各个组织中均有表达,其中在血液中表达量最高(P < 0.05);Pfmatrilin-1从担轮幼虫期至变态期均有表达,眼点期表达量最高(P < 0.05),而贝类幼虫发育到眼点期就会开始附着,眼点期幼虫原壳生长停滞,次生壳形成,因此推测其可能与次生壳的形成有关。这些结果表明Pfmatrilin-1在合浦珠母贝生物矿化中发挥重要作用。
  • 图 1  合浦珠母贝Pfmatrilin-1基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列

    Figure 1.  Full-length cDNA and protein sequence of Pfmatrilin-1 gene of the P.fucata

    图 2  Pfmatrilin-1与其他物种matrilin-1氨基酸序列比对

    Figure 2.  Multiple sequence alignment of amino acid sequence of Pfmatrilin-1 with matrilin-1 from other organisms

    图 3  基于matrilin-1基因编码的氨基酸序列构建的NJ系统进化树

    Figure 3.  NJ phylogenetic tree of based on amino acid sequences of matrilin-1

    图 4  合浦珠母贝Pfmatrilin-1 mRNA在不同组织中的表达

    Figure 4.  Relative expression level of Pfmatrilin-1 mRNA in different tissues of P.fucata

    图 5  合浦珠母贝Pfmatrilin-1 mRNA在不同发育时期的表达情况

    Figure 5.  Relative expression level of Pfmatrilin-1 mRNA at different developmental stages of P.fucata

    表 1  实验中所用引物

    Table 1.  Primers used in this study

    引物名称
    primer name
    引物序列(5′→3′)
    primer sequence
    用途
    application
    matrilin-1-F GCTTCGTGTCCTCTTTGGTC cDNA克隆
    matrilin-1-R AGTGGTTTCTGCATCGGTTG cDNA克隆
    matrilin-1-3′-GSP1 GGTATTTGCGAACAACAGTGTGGGTG 3′RACE
    matrilin-1-3′-GSP2 CAACAGTGTGGGTGTCAGAAGCGG 3′RACE
    matrilin-1-5′-GSP1 ATAGGCTGATCCGCTTCTGACACCC 5′RACE
    matrilin-1-5′-GSP2 ATCCGCTTCTGACACCCACACTG 5′RACE
    UPM CATGGCTACATGCTGACAGCCTA RACE
    UPM-short CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG RACE
    matrilin-1-qF1 GGCTCTCGCTGCTGATTAT qRT-PCR
    matrilin-1-qR1 CCGTCGTGTGAAGAATAGT qRT-PCR
    18S-f GAGAAACGGCTACCACATCC qRT-PCR
    18S-r CACCAGACTTGCCCTCCAA qRT-PCR
    下载: 导出CSV

    表 2  进化树构建所用物种

    Table 2.  Species used in phylogenetic tree

    物种名
    species
    氨基酸序列名称
    amino acid name
    登录号
    Accession No.(NCBI)
    合浦珠母贝Pinctada fucata   matrilin-1   KU553226
    长牡蛎Crassostrea gigas   matrilin-1   EKC38360.1
    犬弓蛔虫Toxocara canis   matrilin-1   KHN84166.1
    斑马贻贝Dreissena polymorpha   matrilin-like   AM503947
    光滑双绮螺Biomphalaria glabrata   matrilin   AAN61407.1
    非洲爪蟾Xenopus laevis   matrilin-1   NP_001079801.1
    斑马鱼Danio rerio   matrilin-1   NP_001093210.1
    绿头鸭Anas platyrhynchos   matrilin-1   EOB04374.1
    眼睛王蛇Ophiophagus hannah   matrilin-1   ETE70549.1
    原鸡Gallus gallus   matrilin-1   NP_001025546.2
    小家鼠Mus musculus   matrilin-1   AAH47140.1
    非洲爪蟾Xenopus laevis   matrilin-1   NP_001079801.1
    褐家鼠Rattus norvegicus   matrilin-1   EDL80602.1
    Bos taurus   matrilin-1   NP_001137338.1
    大黄鱼Larimichthys crocea   matrilin-1   KKF25140.1
    绿海龟Chelonia mydas   matrilin-1   EMP29967.1
    Homo sapiens   matrilin-1   NP_002370.1
    下载: 导出CSV
  • [1] ZHANG Y, WANG Z K, LUO J M, et al.Multiple functions of the von Willebrand Factor A domain in matrilins:secretion, assembly, and proteolysis[J].J Orthop Surg Res, 2008, 3(1):21. doi: 10.1186/1749-799X-3-21
    [2] PAULSSON M, KLATT A R, KOBBE B, et al. The matrilins:a novel family of extracellular adaptor proteins[M]//HASCALL V C, KUETTNER K E.The many faces of osteoarthritis. Basel:Birkhäuser, 2002:151-158.
    [3] LUO J M, WANG Y C, YUAN X, et al. Matrilins family and cartilage diseases[J].Precision Med, 2016, 2:e1233.
    [4] FRESQUET M, JOWITT T A, STEPHEN L A, et al. Structural and functional investigations of Matrilin-1 A-domains reveal insights into their role in cartilage ECM assembly[J].J Biol Chem, 2010, 285(44):34048-34061. doi: 10.1074/jbc.M110.154443
    [5] PAULSSON M, HEINEGÅRD D. Matrix proteins bound to associatively prepared proteoglycans from bovine cartilage[J].Biochem J, 1979, 183(3):539-545. doi: 10.1042/bj1830539
    [6] WIBERG C, KLATT A R, WAGENER R, et al.Complexes of matrilin-1 and biglycan or decorin connect collagen Ⅵ microfibrils to both collagen Ⅱ and aggrecan[J].J Biol Chem, 2003, 278(39):37698-37704. doi: 10.1074/jbc.M304638200
    [7] FORADORI M J, CHEN Q, FERNANDEZ C A, et al.Matrilin-1 is an inhibitor of neovascularization[J].J Biol Chem, 2014, 289(20):14301-14309. doi: 10.1074/jbc.M113.529982
    [8] NEACSU C D, KO Y P, TAGARIELLO A, et al.Matrilin-1 is essential for zebrafish development by facilitating collagen Ⅱ secretion[J].J Biol Chem, 2014, 289(3):1505-1518. doi: 10.1074/jbc.M113.529933
    [9] JENKINS R N, OSBORNE-LAWRENCE S L, SINCLAIR A K, et al.Structure and chromosomal location of the human gene encoding cartilage matrix protein[J].J Biol Chem, 1990, 265(32):19624-19631.
    [10] KO Y P, KOBBE B, PAULSSON M, et al.Zebrafish (Danio rerio) matrilins:shared and divergent characteristics with their mammalian counterparts[J].Biochem J, 2005, 386(Pt 2):367-379.
    [11] PEDERSEN M E, TAKLE H, YTTEBORG E, et al.Matrilin-1 expression is increased in the vertebral column of Atlantic salmon (Salmo salar L.) individuals displaying spinal fusions[J].Fish Physiol Biochem, 2011, 37(4):821-831. doi: 10.1007/s10695-011-9480-5
    [12] 李鑫. Matrilin-1在小鼠胫骨闭合骨折模型愈合过程中的作用研究[D]. 长春: 吉林大学, 2011: 4-7.
    [13] MONTANARO L, PARISINI P, GREGGI T, et al.Evidence of a linkage between matrilin-1 gene (MATN1) and idiopathic scoliosis[J].Scoliosis, 2006, 1(1):21. doi: 10.1186/1748-7161-1-21
    [14] ZHANG H, ZHAO S, ZHAO Z, et al.The association of rs1149048 polymorphism in matrilin-1(MATN1) gene with adolescent idiopathic scoliosis susceptibility:a meta-analysis[J].Mol Biol Rep, 2014, 41(4):2543-2549. doi: 10.1007/s11033-014-3112-y
    [15] BAE J W, CHO C H, MIN W K, et al.Associations between matrilin-1 gene polymorphisms and adolescent idiopathic scoliosis curve patterns in a Korean population[J].Mol Biol Rep, 2012, 39(5):5561-5567. doi: 10.1007/s11033-011-1360-7
    [16] 刘晓敏, 陈银河, 申才良.Matrilin-1基因rs1149048单核苷酸多态性与青少年特发性脊柱侧凸易感性的Meta分析[J].安徽医药, 2015, 19(10):1933-1936. doi: 10.3969/j.issn.1009-6469.2015.10.026
    [17] ZHANG G, FANG X, GUO X, et al.The oyster genome reveals stress adaptation and complexity of shell formation[J].Nature, 2012, 490(7418):49-54. doi: 10.1038/nature11413
    [18] BOUCHUT A, ROGER E, COUSTAU C, et al.Compatibility in the Biomphalaria glabrata/Echinostoma caproni model:potential involvement of adhesion genes[J].Int J Parasitol, 2006, 36(2):175-184. doi: 10.1016/j.ijpara.2005.09.009
    [19] XU W, FAISAL M.Matrilin-like molecules produced by circulating hemocytes of the zebra mussel (Dreissena polymorpha) upon stimulation[J].Dev Comp Immunol, 2007, 31(12):1205-1210. doi: 10.1016/j.dci.2007.04.005
    [20] 龙敏明, 黄桂菊, 邹记兴, 等.育珠对合浦珠母贝N19和Prismalin-14基因表达水平的影响[J].南方水产科学, 2013, 9(5):58-63.
    [21] 刘晓军, 李家乐.养殖珍珠贝贝壳基质蛋白研究进展[J].上海海洋大学学报, 2013, 22(2):200-205.
    [22] 王小玉, 喻达辉, 黄桂菊, 等.合浦珠母贝3个家系的AFLP标记分离与遗传多样性研究[J].南方水产, 2007, 3(5):54-60.
    [23] 毕晓敏, 黄桂菊, 范嗣刚, 等.合浦珠母贝矿化基因Pearlin重组蛋白的表达条件优化[J].南方水产科学, 2015, 11(6):100-106.
    [24] MARIN F, LUQUET G, MARIE B, et al.Molluscan shell proteins:primary structure, origin, and evolution[J].Curr Top Dev Biol, 2008, 80(3):209-276.
    [25] 罗会. 合浦珠母贝经济性状的遗传分析[D]. 上海: 上海海洋大学, 2013: 1-52.
    [26] 王琦, 何毛贤.合浦珠母贝实时定量PCR内参基因的稳定性比较[J].南方水产科学, 2013, 9(6):33-40.
    [27] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method[J].Methods, 2001, 25(4):402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262
    [28] ZHANG Y, CHEN Q.Changes of matrilin forms during endochondral ossification. Molecular basis of oligomeric assembly[J].J Biol Chem, 2000, 275(42):32628-32634. doi: 10.1074/jbc.M002594200
    [29] KLATT A R, PAULSSON M, WAGENER R.Expression of matrilins during maturation of mouse skeletal tissues[J].Matrix Biol, 2002, 21(3):289-296. doi: 10.1016/S0945-053X(02)00006-9
    [30] HUANG X, BIRK D E, GOETINCK P F.Mice lacking matrilin-1 (cartilage matrix protein) have alterations in type Ⅱ collagen fibrillogenesis and fibril organization[J].Dev Dyn, 1999, 216(4/5):434-441. doi: 10.1002/(ISSN)1097-0177
    [31] 张岑. 合浦珠母贝贝壳形成相关蛋白及基因的研究[D]. 北京: 清华大学, 2006: 61-75.
    [32] 闫芳. 马氏珠母贝珍珠层形成相关基因的克隆与功能研究[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2014: 9-28.
    [33] 薛桂英, 郭奕惠, 黄桂菊, 等.合浦珠母贝不同壳基质蛋白基因的表达水平比较[J].广东农业科学, 2013, 40(17):140-142, 145. doi: 10.3969/j.issn.1004-874X.2013.17.043
  • [1] 范嗣刚周代志刘宝锁邓正华郭奕惠喻达辉 . 合浦珠母贝BMP7b基因的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2018, 14(1): 121-126. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.01.016
    [2] 王德清李海梅黄桂菊张博范嗣刚刘宝锁苏家齐喻达辉 . 合浦珠母贝章鱼胺受体(OAR)基因的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(1): 58-65. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.008
    [3] 毕晓敏黄桂菊范嗣刚朱文杰喻达辉 . 合浦珠母贝矿化基因Pearlin重组蛋白的表达条件优化. 南方水产科学, 2015, 11(6): 100-106. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.06.014
    [4] 周代志黄桂菊刘宝锁张博姜松邓正华喻达辉 . 合浦珠母贝骨形态发生蛋白10(BMP10)基因的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(6): 83-90. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.06.011
    [5] 周童刘宝锁张博孟子豪何文耀喻达辉 . 类胡萝卜素对合浦珠母贝热休克蛋白基因HSP22表达的影响. 南方水产科学, 2018, 14(5): 60-69. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.05.008
    [6] 何鹏江世贵李运东杨其彬姜松杨丽诗黄建华周发林 . 斑节对虾GLUT1基因cDNA的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2019, 15(2): 72-82. doi: 10.12131/20180264
    [7] 陈诏徐鸿飞赵何勇刘康李华何金钊韦玲静 . 佛罗里达红罗非鱼黑色素浓集激素1基因的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2018, 14(3): 73-82. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.03.009
    [8] 邱萤黄桂菊刘宝锁范嗣刚李有宁陈明强喻达辉 . 企鹅珍珠贝GLUT1 基因全长cDNA 克隆及其对葡萄糖的表达响应. 南方水产科学, 2016, 12(5): 81-89. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.05.010
    [9] 何文耀范嗣刚刘宝锁张博周童苏家齐邓正华喻达辉 . 合浦珠母贝胸腺素β4 (thymosin beta4)插核损伤和发育时期的表达研究. 南方水产科学, 2018, 14(2): 66-74. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.02.009
    [10] 史进选傅明骏赵超周发林杨其彬邱丽华 . 斑节对虾GRP94基因的克隆及其在不同应激条件下的表达与分析. 南方水产科学, 2016, 12(5): 61-70. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.05.008
    [11] 王艳傅明骏赵超周发林杨其彬邱丽华 . 斑节对虾GTF2H4基因的分子克隆及表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(2): 36-43. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.006
    [12] 章琼孙盛明李冰蒋高中朱健戈贤平 . 团头鲂g型溶菌酶基因全长cDNA的克隆与表达分析. 南方水产科学, 2015, 11(2): 41-49. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2015.02.006
    [13] 周卫军刘振兴柯浩马艳平郝乐徐明芳 . 鲢抗菌肽Hepcidin的基因克隆和表达及抑菌活性分析. 南方水产科学, 2014, 10(3): 58-64. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.03.009
    [14] 郭松傅明骏赵超李伟杰江世贵杨其彬周发林邱丽华 . 斑节对虾细胞周期蛋白T基因的克隆和表达分析. 南方水产科学, 2016, 12(1): 59-66. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.01.009
    [15] 林权卓陈奕彬胡娟王树启杨宪宽沈卓坤赵会宏 . 双棘黄姑鱼IGF3 基因克隆及表达模式分析. 南方水产科学, 2016, 12(1): 50-58. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.01.008
    [16] 栗志民钱佳慧刘建勇艾加林檀克勤 . 九孔鲍α-淀粉酶基因克隆、表达分析及与生长性状相关性. 南方水产科学, 2017, 13(6): 14-21. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.06.002
    [17] 周凯敏江世贵黄建华杨其彬姜松邱丽华杨丽诗周发林 . 斑节对虾Chitinase-2基因的克隆及其在蜕皮和幼体发育过程中的表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(4): 59-68. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.04.008
    [18] 陈劲松江世贵黄建华杨其彬马振华周发林 . 斑节对虾天门冬氨酸转氨酶基因的克隆及氨氮胁迫条件下的表达分析. 南方水产科学, 2017, 13(3): 73-82. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.03.010
    [19] 陈治光李冉李树蕾杨立彬蒋然然钟海霞陈恩1蒋光阳1李树红 . 草鱼Stefin 克隆表达、纯化及活性特征鉴定. 南方水产科学, 2016, 12(5): 97-104. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.05.012
    [20] 姚托卢洁叶灵通陈华生王江勇 . 杂色鲍防御素HdDef1的分子特征和表达分析. 南方水产科学, 2019, 15(6): 1-8. doi: 10.12131/20190045
  • 加载中
图(5)表(2)
计量
  • 文章访问数:  1655
  • HTML全文浏览量:  457
  • PDF下载量:  762
  • 被引次数: 0
出版历程
  • 收稿日期:  2016-03-25
  • 录用日期:  2016-05-06
  • 刊出日期:  2017-02-05

合浦珠母贝matrilin-1基因的克隆和表达分析

    作者简介:王珍珍(1989-),女,硕士研究生,从事水产养殖与生物技术研究。E-mail:360415358@qq.com
    通讯作者: 喻达辉, pearlydh@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,农业部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306
基金项目:  广东省海洋与渔业局科技推广专项 Z2014003广东省海洋与渔业局科技推广专项 Z2015009广东省海洋与渔业局科技推广专项 A20130102现代农业产业技术体系建设专项资金 CARS-48国家自然科学基金项目 31372525广东省海洋与渔业局科技推广专项 Z2014006广东省海洋与渔业局科技推广专项 A201301A08

摘要: 以合浦珠母贝(Pinctada fucata)转录组中的matrilin-1基因片段为基础,开展了matrilin-1的cDNA全长(Pfmatrilin-1)克隆和定量表达分析。Pfmatrilin-1基因cDNA全长2 036 bp,开放阅读框(open reading frame,ORF)1 194 bp,编码397个氨基酸,包括1个信号肽序列和2个血管性血友病因子A(von Willebrand factor A,VWA)样结构域。系统进化分析显示无脊椎动物的matrilins与脊椎动物的matrilins进化关系较远。荧光定量PCR表达分析结果显示,Pfmatrilin-1 mRNA在合浦珠母贝各个组织中均有表达,其中在血液中表达量最高(P < 0.05);Pfmatrilin-1从担轮幼虫期至变态期均有表达,眼点期表达量最高(P < 0.05),而贝类幼虫发育到眼点期就会开始附着,眼点期幼虫原壳生长停滞,次生壳形成,因此推测其可能与次生壳的形成有关。这些结果表明Pfmatrilin-1在合浦珠母贝生物矿化中发挥重要作用。

English Abstract

  • 在软骨中,细胞基质(extracellular matrix,ECM)分子介导细胞-基质、基质-基质相互作用,维持组织完整性[1]。母系蛋白(matrilins)家族是一种新的细胞外基质蛋白家族,其包括至少4个成员(1、2、3和4)。Matrilins的分子结构相似,均含有1~2个血管假性血友病因子A(von Willebrand factor A,VWA)样结构域、连接2个VWA结构域的EGF-like结构域和C端的α-螺旋结构域[1-2]。VWA结构域具有调节蛋白结合、分泌以及通过矩阵蛋白酶水解蛋白质等多重功能[1, 3]。此外VWA还具有调控matrilin齐聚、保护matrilin-1不被蛋白水解的功能,如果VWA缺失会导致三聚体matrilin-1转变为二聚体和三聚体的混合物[2, 4]。Matrilin-1又称软骨基质蛋白(cartilage matrix protein,CMP),Matrilin-1是该家族第一个被发现的[5]。其作为细胞外基质蛋白,主要与细胞外基质(ECM)的形成与稳定有关。Matrilin-1通过绑定Ⅱ型胶原蛋白[6]、aggrecan[6]等发挥作用。

    Matrilin-1主要在骨和软骨组织中表达[7-8]Matrilin-1基因在脊椎动物中研究广泛,在人(Homo sapiens)[9]、斑马鱼(Danio rerio)[10]和大西洋鲑(Salmo salar)[11]中已经克隆出matrilin-1基因。李鑫[12]matrilin-1敲除鼠和野生鼠为研究对象,研究matrilin-1在小鼠骨折愈合过程中的作用,结果显示matrilin-1对小鼠骨折愈合过程起负调控作用。目前国内外研究最广的是关于matrilin-1基因多态性与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)易感性的相关性[13-15],刘晓敏等[16]采用Meta分析对相关文献进行分析后,明确G和A等位基因与AIS的易感性相关联。在体内外实验中,Matrilin-1能抑制血管再生[7]。近年来,对无脊椎动物matrilin-1的研究也陆续见到报道,如matrin-1基因已经在长牡蛎(Crassostrea gigas)中克隆出来[17]。BOUCHUT等[18]从淡水光滑双绮螺(Biomphalaria glabrata)中克隆出matrilin同源基因matrilin-like,并推测其与光滑双绮螺抗棘口吸虫感染相关。XU和FAISAL[19]从斑马贻贝(Dreissena polymorpha)的cDNA文库中筛选出了matrilin的同源基因matrilin-like,并且发现用脂多糖-肽聚糖-酵母聚糖的混合物刺激斑马贻贝的血细胞,会诱导matrilin-like基因表达量升高。虽然matrilin-1基因在无脊椎动物中已经开始研究,但其作用尚不清楚。

    合浦珠母贝(Pinctada fucata)隶属于软体动物门,瓣鳃纲,珍珠目,为暖水性贝类,在中国主要分布在广东、广西、海南等地[20-23]。合浦珠母贝是目前中国海水珍珠养殖的主要珍珠贝,具有极高的经济价值。贝壳是生物矿化的主要产物,是在外套膜分泌的基质蛋白的调控下,由碳酸钙晶体有序沉积而成[24]。而matrilin-1是否参与贝壳的矿化过程,尚未见有研究报道。此研究首次从合浦珠母贝中克隆得到matrilin-1基因,观察了该基因在不同组织和幼体发育各阶段的表达情况,并利用生物信息学软件对其基因结构、功能进行了初步探究,旨在探讨该基因在合浦珠母贝生长发育中的作用,为进一步研究生长调控和优化育珠提供参考。

    • 实验用合浦珠母贝为12月龄,壳高为(50±1.45)mm,湿质量为(45±2.1)g,取自海南省陵水县新村热带水产研究开发中心基地,取10个合浦珠母贝的肝胰腺、性腺、闭壳肌、鳃、珍珠囊和外套膜组织,于液氮速冻。根据幼虫形态[25]收集人工培育获得的合浦珠母贝担轮期(受精后8 h)、D型期(受精后24 h)、壳顶期(受精后14 d)、眼点期(受精后20 d)和变态期(受精后24 d)的样品,每个时期收集3个试管,每试管至少包含500个幼虫。收集后分别加入样品保护液,液氮速冻。

    • 根据Trizol(Invitrogen,美国)说明书提取合浦珠母贝外套膜总RNA,取1 μL在紫外分光光度计上检测RNA的光密度(OD),并使用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。以总RNA(2 μL)为模板,按照M-MLV(RNase H-)逆转录酶(TaKaRa,大连)说明书合成cDNA第一条链;按照SMARTer® RACE 5′/3′Kit User Manual(Clontech)说明书进行逆转录,分别合成3′RACE-cDNA和5′RACE-cDNA,保存于-20 ℃备用。

    • 根据合浦珠母贝外套膜转录组数据,筛选得到与matrilin-1相似性较高的unigene片段,拼接后获得合浦珠母贝matrilin-1基因的中间片段。根据基因片段序列设计特异性引物matrilin-1-F和matrilin-1-R克隆cDNA片段(表 1)。PCR反应体系为ddH2O 13.8 μL,10×PCR Ex Buffer(Mg2+ Plus)2.0 μL,dNTP Mixture(各2.5 mmol· L-1)1.6 μL,正/反向引物(F/R)各0.8 μL,cDNA模板0.8 μL,TaKaRa ExTaq(5 U·μL-1)0.2 μL。PCR反应条件为94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30个循环;72 ℃ 10 min。按照纯化回收试剂盒(Meagn,广州)说明书回收PCR产物。琼脂糖凝胶电泳检测片段长度及完整程度,紫外分光光度计检测其OD。PCR产物纯化按照pEASY-T1 Cloning Kit(全士金,北京)说明书进行操作,筛选阳性克隆送上海英潍捷基生物公司测序。根据获得的matrilin-1序列,用Primer Premier 5.0分别设计3′及5′RACE特异性引物(表 1),进行RACE-PCR以获得基因cDNA全长。

      引物名称
      primer name
      引物序列(5′→3′)
      primer sequence
      用途
      application
      matrilin-1-F GCTTCGTGTCCTCTTTGGTC cDNA克隆
      matrilin-1-R AGTGGTTTCTGCATCGGTTG cDNA克隆
      matrilin-1-3′-GSP1 GGTATTTGCGAACAACAGTGTGGGTG 3′RACE
      matrilin-1-3′-GSP2 CAACAGTGTGGGTGTCAGAAGCGG 3′RACE
      matrilin-1-5′-GSP1 ATAGGCTGATCCGCTTCTGACACCC 5′RACE
      matrilin-1-5′-GSP2 ATCCGCTTCTGACACCCACACTG 5′RACE
      UPM CATGGCTACATGCTGACAGCCTA RACE
      UPM-short CGCGGATCCACAGCCTACTGATGATCAGTCGATG RACE
      matrilin-1-qF1 GGCTCTCGCTGCTGATTAT qRT-PCR
      matrilin-1-qR1 CCGTCGTGTGAAGAATAGT qRT-PCR
      18S-f GAGAAACGGCTACCACATCC qRT-PCR
      18S-r CACCAGACTTGCCCTCCAA qRT-PCR

      表 1  实验中所用引物

      Table 1.  Primers used in this study

    • 使用NCBI网站上的BLASTX(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast/)程序分析开放阅读框(ORF)、进行序列同源性比对和相似性检索,ORF Finder寻找ORF;用ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白的理化特性;采用NetPhos 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测蛋白磷酸化位点;信号肽预测采用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/);跨膜结构域预测采用TMHMM server 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/);用SMART 4.0(http://smart.embl-heidelberg.de/)在线程序进行蛋白结构域分析;用NetNGIys 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测糖基化位点;用Bioedit软件和在线软件Clustal Omega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)进行多重序列比对;采用MEGA 6.0软件以邻位相连法(neighbor-joining,NJ)构建进化树。

    • 提取健康的成年合浦珠母贝不同组织(肝胰腺、肠、珍珠囊、闭壳肌、鳃和外套膜)和不同发育时期(担轮期、D型期、壳顶期、眼点期和变态期)幼体的总RNA,用PrimerScript TM 1st strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa,大连)逆转录成cDNA备用。根据合浦珠母贝matrilin-1的cDNA序列设计特异性引物matrilin-1-qF1和matrilin-1-qR1(表 1),采用18S rRNA基因作为内参[26]。按照SYBR Real-time PCR Master Mix试剂盒(TaKaRa,大连)说明书进行qRT-PCR,以去离子水为模板作为阴性对照,样品和内参均设3个重复。采用相对ΔCT法(2-ΔΔCT法)分析Pfmatrilin-1基因在合浦珠母贝不同组织和不同发育时期中的相对表达量[27]。目的基因表达水平由“平均值±标准差”(X+SD)表示,运用统计学分析软件SPSS 19.0进行单因素方差分析(One-Way ANOVA),P < 0.05为差异显著。

    • 根据合浦珠母贝外套膜转录组测序的matrilin-1序列片段,使用基因特异性引物进行5′-和3′-RACE扩增,经拼接获得2 036 bp全长cDNA,命名为Pfmatrilin-1(GenBank:KU553226),开放阅读框1 194 bp,5′非编码区(UTR)为670 bp,3′UTR为172 bp(图 1)。预测Pfmatrilin-1基因编码397个氨基酸,理论分子量约为43.71 kD,理论等电点(pI)为4.7。SingalP 4.1软件预测Pfmatrilin-1有1个N-端信号肽(1~19)。分别采用NetPhos 2.0和NetNGIys 1.0预测Pfmatrilin-1的翻译后修饰情况,发现Pfmatrilin-1可能有5个N-糖基化位点(N84、N93、N116、N288和N350)和38个磷酸化位点(包括22个丝氨酸,8个苏氨酸和8个酪氨酸位点)。Pfmatrilin-1氨基酸序列有2个典型的VWA结构域(23~199 aa和211~374 aa)(图 1),缺失EGF-like结构域,这与matrilin家族及其相关蛋白存在差异。利用在线软件Clustal Omega将Pfmatrilin-1基因与其他物种的matrilin-1氨基酸序列进行多重序列比对,结果显示Pfmatrilin-1与其他物种matrilin-1的2个VWA区域相对保守,而连接2个VWA结构域的EGF-like结构域及C-端的α-螺旋结构域缺失(图 2)。Blast结果显示Pfmatrilin-1与人、小家鼠(Mus musculus)、斑马鱼、非洲爪蟾(Xenopus laevis)的相似性均为42%,而与长牡蛎的同源性达到了60%,远高于脊椎动物。

      图  1  合浦珠母贝Pfmatrilin-1基因cDNA序列及其编码的氨基酸序列

      Figure 1.  Full-length cDNA and protein sequence of Pfmatrilin-1 gene of the P.fucata

      图  2  Pfmatrilin-1与其他物种matrilin-1氨基酸序列比对

      Figure 2.  Multiple sequence alignment of amino acid sequence of Pfmatrilin-1 with matrilin-1 from other organisms

      采用表 2中所列物种matrilin-1序列构建进化树。以犬弓蛔虫(Toxocara canis)的matrilin-like为外群,系统进化分析显示matrilin-1在脊椎动物和无脊椎动物中分别聚为群组。Pfmatrilin-1与长牡蛎matrilin-1聚为一支,然后与其他无脊椎动物光滑双绮螺matrilin、斑马贻贝matrilin-like、犬弓蛔虫matrilin-1聚为一支,最后与脊椎动物matrilin-1聚为群组(图 3)。这表明软体动物与脊椎动物的matrilin-1遗传距离较远。

      物种名
      species
      氨基酸序列名称
      amino acid name
      登录号
      Accession No.(NCBI)
      合浦珠母贝Pinctada fucata   matrilin-1   KU553226
      长牡蛎Crassostrea gigas   matrilin-1   EKC38360.1
      犬弓蛔虫Toxocara canis   matrilin-1   KHN84166.1
      斑马贻贝Dreissena polymorpha   matrilin-like   AM503947
      光滑双绮螺Biomphalaria glabrata   matrilin   AAN61407.1
      非洲爪蟾Xenopus laevis   matrilin-1   NP_001079801.1
      斑马鱼Danio rerio   matrilin-1   NP_001093210.1
      绿头鸭Anas platyrhynchos   matrilin-1   EOB04374.1
      眼睛王蛇Ophiophagus hannah   matrilin-1   ETE70549.1
      原鸡Gallus gallus   matrilin-1   NP_001025546.2
      小家鼠Mus musculus   matrilin-1   AAH47140.1
      非洲爪蟾Xenopus laevis   matrilin-1   NP_001079801.1
      褐家鼠Rattus norvegicus   matrilin-1   EDL80602.1
      Bos taurus   matrilin-1   NP_001137338.1
      大黄鱼Larimichthys crocea   matrilin-1   KKF25140.1
      绿海龟Chelonia mydas   matrilin-1   EMP29967.1
      Homo sapiens   matrilin-1   NP_002370.1

      表 2  进化树构建所用物种

      Table 2.  Species used in phylogenetic tree

      图  3  基于matrilin-1基因编码的氨基酸序列构建的NJ系统进化树

      Figure 3.  NJ phylogenetic tree of based on amino acid sequences of matrilin-1

    • Pfmatrilin-1 mRNA在肝胰腺、肠、珍珠囊、闭壳肌、鳃和外套膜中均有表达,其中血液表达量最高,其次是外套膜、鳃和闭壳肌,在肝胰腺和肠中表达量最低(图 4)。Pfmatrilin-1 mRNA在所检测的合浦珠母贝不同发育时期均有表达,其中在幼虫眼点期表达量最高,担轮期表达量最低(图 5)(P < 0.05)。

      图  4  合浦珠母贝Pfmatrilin-1 mRNA在不同组织中的表达

      Figure 4.  Relative expression level of Pfmatrilin-1 mRNA in different tissues of P.fucata

      图  5  合浦珠母贝Pfmatrilin-1 mRNA在不同发育时期的表达情况

      Figure 5.  Relative expression level of Pfmatrilin-1 mRNA at different developmental stages of P.fucata

    • Matrilin-1的VWA结构域具有调节蛋白结合、分泌以及通过矩阵蛋白酶水解蛋白质等多重功能[1, 3]。此外,VWA还具有调控matrilin齐聚、保护matrilin-1不被蛋白水解的功能,如果VWA缺失会导致三聚体matrilin-1转变为二聚体和三聚体的混合物[2, 4]。ZHANG等[1]发现matrilin-1的VWA基序介导通过域中的金属离子依赖性粘附位点形成丝状矩阵网络。Matrilin-1的vWF A结构域或金属离子依赖性粘附位点缺失或突变都会影响其蜂窝状丝状网络的形成,这表明vWF A具有粘合位点的作用,该位点可以粘合它的基质配体包括胶原和蛋白聚糖,由于vWF A具有多种功能,因此该结构域的缺失或突变都可能导致不同的病理机制[1]。EGF-like的个数并不影响matrilins的组装[28]Pfmatrilin-1基因的cDNA全长序列结构域分析发现,Pfmatrilin-1包含2个VWA结构域,但是缺少连接2个VWA结构域的EGF-like结构域和C端的α-螺旋结构域。其他无脊椎动物如光滑双绮螺[18]和斑马贻贝[19]的matrilin只包含了1个VWA结构域,并且也缺少EGF-like结构域和C端的α-螺旋结构域。氨基酸序列分析表明,Pfmatrilin-1的2个VWA结构域与其他物种matrilin-1的VWA结构域相对保守。无脊椎动物和脊椎动物matrilin-1氨基酸结构上的差异是否影响其功能还有待深入探究。

      利用qRT-PCR技术发现Pfmatrilin-1在合浦珠母贝各组织(肝胰腺、肠、血淋巴、闭壳肌、鳃和外套膜)中均有表达,在血淋巴、外套膜、鳃和闭壳肌中相对表达量显著高于其他组织。在哺乳动物中,matrilin-1主要分布在长骨的脊柱和生长板软骨组织[29]。研究表明matrilin-1多态性与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)易感性相关[13-16]。在斑马鱼的脊索中也发现了matrilin-1[10]。PEDERSEN等[11]利用双向电泳和统计学分析首次发现matrilin-1在融合的椎骨中表达量上调,并且发现在大西洋鲑中,matrilin-1在脊椎融合的个体中表达量显著高于脊椎未变形的个体,因此matriin-1也可能是脊椎变形的标志物。但是matrilin-1基因敲除小鼠显示,该基因并不是骨结构和功能所必须的[30]。敲除matrilin-1虽然对骨骼发育没有明显的影响,但是敲除matrilin-1基因的小鼠Ⅱ型胶原原纤维和纤维组织形成出现异常[30],所以matrilin-1在骨、软骨发育和生物矿化中的作用有待进一步研究。Pfmatrilin-1在合浦珠母贝的外套膜和鳃中的表达量相对较高,外套膜是发生生物矿化的主要组织。许多与贝壳形成相关的基因,如KRMP[31]BMP7[32]msi31和nacrein[33]都在外套膜高表达,因此推测Pfmatrilin-1基因也可能参与贝壳形成的调控。此外,BOUCHUT等[18]发现matrilin在抗棘口吸虫感染的光滑双绮螺与易感染棘口吸虫的光滑双绮螺中表达量不同,但是其具体功能还未确定。而XU和FAISAL[19]也发现使用脂多糖-肽聚糖-酵母聚糖的混合物刺激斑马贻贝的血细胞,会诱导matrilin-like基因表达量升高,因此推测matrilin-like与宿主防御机制有关。Pfmatrilin-1在合浦珠母贝血淋巴中高表达,是否与合浦珠母贝的防御机制有关,以及该基因在合浦珠母贝中的具体功能还需进一步研究。

      Matrilin-1在生物体胚胎发育及其成熟的过程中发挥着不同的作用。在斑马鱼受精15 h之后,matrilin-1开始表达,此时该基因在整个胚胎中(除了脊索)都有表达,随着斑马鱼骨骼的发育,matrilin-1主要在软骨表达。采用Morpholino knockdown技术检测斑马鱼胚胎的matrilin-1基因表达,结果造成整体生长缺陷,尤其是干扰颅面软骨形成,并且Ⅱ型胶原蛋白分泌显著降低[8]。因此matrilin-1是斑马鱼软骨发育中不可或缺的,并且在早期Ⅱ型胶原蛋白沉积过程中也发挥了作用[8]。此研究中,Pfmatrilin-1在合浦珠母贝幼虫的各个时期均有表达,并且在眼点期表达量最高,且差异显著(P<0.05)。海产贝类在生活史的早期要经历一个浮游幼体阶段,当贝类幼虫发育到眼点期就从浮游生活转变为匍匐生活,眼点期幼虫原壳生长停滞,次生壳形成,面盘逐渐消失并在后方出现足部[25]。合浦珠母贝幼虫附着后开始形成棱柱层。因此笔者推测Pfmatrilin-1在眼点期高表达可能与合浦珠母贝幼虫次生壳的形成有关。

      此研究克隆得到了Pfmatrilin-1基因cDNA全长,并进行了生物信息学分析。qRT-PCR表明Pfmatrilin-1在合浦珠母贝不同组织和幼虫发育各时期均有表达,在血淋巴和眼点期表达量最高,推测其功能可能与生物矿化相关,为进一步研究Pfmatrilin-1在合浦珠母贝中的功能奠定了基础。

参考文献 (33)

目录

    /

    返回文章
    返回