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小头鲔寄生鳍缨虫的分离及鉴定

马振华 周胜杰 杨蕊 赵旺 吴洽儿 于刚

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小头鲔寄生鳍缨虫的分离及鉴定

    作者简介: 马振华 (1981—),男,博士,副研究员,从事水产养殖研究。E-mail: zhenhua.ma@hotmail.com;
    通讯作者: 于刚, gyu0928@163.com
  • 中图分类号: S 941.5

Identification and isolation of parasite Branchiomma in ground-based culture of Euthynnus affinis

    Corresponding author: Gang YU, gyu0928@163.com
  • CLC number: S 941.5

  • 摘要: 海南陵水小型金枪鱼驯养基地在小头鲔 (Euthynnus affinis) 养殖过程中发现有寄生虫附着现象,文章对小头鲔寄生虫进行了分离、形态观察及18S、28S rRNA分子鉴定。结果显示,经18S rRNA分子鉴定,该寄生虫与Branchiomma sp.相似性为99.13%;而28S rRNA显示,该寄生虫与黑斑鳍缨虫B. nigromaculatum相似性为100%,与Branchiomma sp. (EF116223.1) 相似性为99.12%。形态观察发现,该寄生虫虫体呈墨绿色、棕黄色或红棕色,具鳃冠,全长30~90 mm,寄生于小头鲔鳃弓后缘的体表及胸鳍中后部。该寄生虫由鳃冠、胸区和腹区组成,无钙质管,其消化道包括口、口腔、咽、肠、肛门等,与黑斑鳍缨虫存在少许生活习性和形态差别。因此,该寄生虫是否为鳍缨虫属 (Branchiomma)、黑斑鳍缨虫 (B. nigromaculatum),仍需进一步验证。该虫附着于小头鲔体表后,小头鲔摄食量明显下降,游泳速度加快,易受惊吓。采用甲醛浸泡具有良好的去除效果,去除后小头鲔成活率为75.9%。
  • 图 1  小头鲔寄生虫外部观察

    Figure 1.  External observation of E. affinis

    图 2  小头鲔寄生虫切片

    Figure 2.  Parasite section of E. affinis

    图 3  基于18S和28S的小头鲔寄生虫发育树分析

    Figure 3.  Phylogenetic tree analysis of E. affinis parasite based on 18S and 28S marker

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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-24
  • 录用日期:  2020-01-30
  • 网络出版日期:  2020-02-12
  • 刊出日期:  2020-04-01

小头鲔寄生鳍缨虫的分离及鉴定

    作者简介:马振华 (1981—),男,博士,副研究员,从事水产养殖研究。E-mail: zhenhua.ma@hotmail.com
    通讯作者: 于刚, gyu0928@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心,海南 三亚 572018
  • 2. 三亚热带水产研究院,海南 三亚 572018
  • 3. 农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 4. 中国水产科学研究院南海水产研究所,广东 广州 510300

摘要: 海南陵水小型金枪鱼驯养基地在小头鲔 (Euthynnus affinis) 养殖过程中发现有寄生虫附着现象,文章对小头鲔寄生虫进行了分离、形态观察及18S、28S rRNA分子鉴定。结果显示,经18S rRNA分子鉴定,该寄生虫与Branchiomma sp.相似性为99.13%;而28S rRNA显示,该寄生虫与黑斑鳍缨虫B. nigromaculatum相似性为100%,与Branchiomma sp. (EF116223.1) 相似性为99.12%。形态观察发现,该寄生虫虫体呈墨绿色、棕黄色或红棕色,具鳃冠,全长30~90 mm,寄生于小头鲔鳃弓后缘的体表及胸鳍中后部。该寄生虫由鳃冠、胸区和腹区组成,无钙质管,其消化道包括口、口腔、咽、肠、肛门等,与黑斑鳍缨虫存在少许生活习性和形态差别。因此,该寄生虫是否为鳍缨虫属 (Branchiomma)、黑斑鳍缨虫 (B. nigromaculatum),仍需进一步验证。该虫附着于小头鲔体表后,小头鲔摄食量明显下降,游泳速度加快,易受惊吓。采用甲醛浸泡具有良好的去除效果,去除后小头鲔成活率为75.9%。

English Abstract

  • 小头鲔 (Euthynnus affinis) 属鲭科、鲔属,身体呈纺锤形,较粗壮,在海南地区称为“炮弹鱼”,在澳大利亚称为“东方蓝鳍金枪鱼”。该鱼主要在近海中上层水域活动,分布于印度洋、太平洋等热带水域,在中国南海、日本、越南、印度、澳大利亚、泰国等地均有捕捞[1]。小头鲔属于小型金枪鱼类,目前世界范围内尚未见小头鲔养殖的相关报道。笔者研究团队于2019年在海南陵水县新村镇中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心基地进行了小头鲔陆基驯化养殖试验,在养殖第4个月发现有寄生虫附着于小头鲔体表。经检查发现,该寄生虫属鳍缨虫属。

    鳍缨虫属为环节动物门、多毛纲、缨鳃虫目、缨鳃虫科。目前发现的鳍缨虫属约有30种,多栖息于较平静的海水水域中 (如港湾、海湾、潟湖等),主要在珊瑚缝隙、岩石、木柱、水泥桩和码头的结壳动物区系中[2]。鳍缨虫属在我国鲜有报道,在我国南海出现的有斑鳍缨虫 (B. cingulatum)、锯鳃鳍缨虫 (B. serratibranchis)、黑斑鳍缨虫 (B. nigromaculata) 和珠鳍缨虫 (B. pererai) 等[3]。目前报道发现鳍缨虫属仅生活于坚硬物体上,而寄生于鱼类体表尚属首次记录。

    • 小头鲔的养殖与管理

    • 小头鲔幼鱼来自于海南省陵水县新村镇近海,由人工捕捞并运输至中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心养殖车间进行驯化养殖。

    • 小头鲔29尾,体长 (40±5) cm,体质量 (500±100) g。养殖于相对独立的车间,对车间内温度 (水温和室温)、光照 (强度和时长)、水质 (溶解氧、pH、氨氮等)、盐度等进行调控,养殖环境控制水温 (30.6±0.5) ℃、ρ (溶解氧) >5.27 mg·L−1、pH 7.57±0.12、盐度33、ρ (氨氮) <0.1 mg·L−1、保持每天光照14 h。每天 (8:00) 测定溶解氧、氨氮、水温、室温、pH等水质因子并记录。每天8:30—9:00投喂1次,投喂量为鱼体质量的5%~10%,饵料主要为鲜杂鱼,采用水下摄像采集的数据进行测量,以计算的最优饵料粒径进行投喂。每天早、中、晚对小头鲔摄食、活动进行观察并记录。

    • 小头鲔养殖4个月后发现有寄生虫附着于体表,被寄生虫附着后的小头鲔在摄食过程中容易受惊吓而停止摄食,摄食量明显下降;小头鲔游泳速度极快,无法清楚地观察到体表的细微变化,排泄物正常;对水处理系统中过滤环节进行仔细观察,没有特殊物质或生物出现在过滤系统中。养殖系统换水时发现池底有黑色条状物;濒死小头鲔胸鳍附近有黑色物体;采集黑色条状物发现为寄生虫。用镊子小心采集鱼体表寄生虫,置于盛有少量海水的培养皿中,用于虫体观察。

    • 将寄生虫置于解剖镜下,观察虫体的形态特征;对鳃冠、躯体及尾部等结构进行压片,显微镜下观察并拍照。

    • 虫体使用4%多聚甲醛固定24 h以上,经自来水冲洗、75%乙醇4 h、85%乙醇2 h、90%乙醇1 h、无水乙醇I 30 min、无水乙醇II 30 min、醇苯10 min、二甲苯I 10 min、二甲苯II 10 min、石蜡I 1 h、石蜡II 1 h、石蜡III 1 h等步骤脱水、包埋、修块、切片,切片厚度4 μm;再经脱蜡、HE染色、中性树脂封片;显微镜观察。

    • 将整个寄生虫用液氮速冻后−80 ℃保存备用。用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒 (天根生化科技有限公司) 提取寄生虫基因组DNA,以18S和28S rRNA基因为分子标记来鉴定物种种类。18S的引物参考Giribet等[4]、Williams和Burreson[5],5R:5'-CTTGGCAAATGCTTTCGC-3' 和1F:5'-TACCTGGTTGATCCTGCCAGTAG-3';8R:5'-ACGGGCGGTGTGTAC-3' 和3F:5'-GTTCGATTCCGGAGAGGGA-3';9R:5'-GATCCTTCCGCAGGTTCACCTAC-3' 和A2.0 (5'-ATGGTTGCAAAGCTGAAAC-3')。28S的引物参考Brown等[6]的设计,F:5'-ACCCSCTGAAYTTAAGCAT-3',R:5'-AACTCTCTCMTTCARAGTTC-3'。PCR扩增采用2×Pfu PCR Mix TIANGEN试剂盒,25 μL PCR反应体系:正反引物 (10 μmol·L−1) 各1 μL,2×Pfu PCR Mix 12.5 μL,DNA模板1 μL (约15 ng),ddH2O 9.5 μL。反应程序为:94 ℃ 3 min;94 ℃ 30 s,48 ℃ 30 s,72 ℃ 2 min,共30个循环;72 ℃ 5 min。

      扩增产物由深圳华大基因股份有限公司测序。将测序结果与NCBI GenBank数据库 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) 中已报道的序列进行相似性比较,并用MEGA 5.2软件使用邻接方法[7]构建系统发育树,而所有序列均使用二参数距离法Clustal对齐,用于计算遗传差异[8]

    • 因活体小头鲔数量有限且珍贵,采用逐步增加甲醛浸泡浓度的方法进行寄生虫脱离,以达到清除体表寄生虫且尽量避免损伤小头鲔的目的。具体方法:将养殖池内水排放至水深50 cm,向养殖池中均匀泼洒一定体积分数为40%的甲醛溶液,使其初始体积分数达到51 mL·m−3,同时密切观察小头鲔及寄生虫的反应;然后每隔30 min再添加1次,每次150 mL,直至寄生虫开始脱落,继续浸泡至寄生虫基本全部脱落后开始排换水,同时打开进水口和排水口,在保证小头鲔能够正常游泳的情况下,尽快将甲醛和脱落的寄生虫排出。彻底换水后计算小头鲔的成活率。

    • 小头鲔在室内养殖,寄生虫附着后摄食量减少,游泳速度加快,易受惊吓,始终躲在远离养殖人员出现的区域,不利于观察。与其他养殖鱼类不同,基本不会出现蹭壁现象,因此体表并无明显鳞片掉落、皮肤破损等症状。根据死亡的小头鲔观察发现该寄生虫主要附着于小头鲔胸鳍基部至末端2/3处和胸鳍基部向上靠近鳃盖骨的位置。寄生虫附着于鱼表时,其鳃冠紧贴鱼体,身体可随水流摆动。同时具有很强的吸附能力,在从鱼体脱落后可附着在养殖池壁上,普通水流无法将其冲下,需要用高压水枪或者刷子才能使其脱落。

    • 寄生虫可分为3个部分:胸区、腹区和鳃冠 (图1-a)。鳃冠由2瓣鳃叶组成,每瓣鳃叶由16片鳃丝组成,鳃丝呈半圆形对称排列 (图1-b1-c);鳃丝基部有鳃膜相连;每片鳃丝腹面着生许多近似等长须状羽枝,羽枝上具黄棕色色斑;鳃丝背面不具有外突起,但具有8~10对复眼 (图1-d);在鳃冠中间具1对锥状唇,可刺破寄主的皮肤获取营养物质。胸区和腹区为墨绿色、棕黄色或红棕色;胸区具8个刚节,腹区具50余个刚节 (图1-e),均具伸缩性,缩短后附着器官与身体的比例约为1∶2,完全伸展后可达1∶3;成体体长可达20~90 mm,直径可达2 mm。胸区刚节的疣足位于躯体背面且渐斜向两侧排列,腹区刚节的疣足完全位于虫体两侧,每个刚节两侧均有刚毛,腹区末端开口为肛门 (图1-f)。

      图  1  小头鲔寄生虫外部观察

      Figure 1.  External observation of E. affinis

    • 寄生虫鳃冠基部中央有一纵向裂口消化道,具有一定的伸缩性;鳃冠基部组织紧密,可为鳃冠提供支撑 (图2)。消化道包括口、口腔、咽、肠、肛门。消化道纵向排列,其形态与刚节延伸相应,即消化道在刚节中段膨大,而在刚节间的结合处收缩,因此消化道呈现连续性的念珠状膨大与收缩。肠道结构由外到内分为外膜层、肌层、黏膜下层和黏膜层。外膜层为浆膜,肌层由平滑肌组成,内为环肌,外为纵肌,黏膜层由排列紧密的柱状上皮细胞组成,且向肠内部凸出形成肠绒毛,大大增加了消化与吸收面积。每两个刚节之间均有隔膜将虫体隔开,该构造有利于其在受伤时及时阻断伤口,防止体液流失及伤口恶化的同时有利于伤愈。

      图  2  小头鲔寄生虫切片

      Figure 2.  Parasite section of E. affinis

    • 寄生虫18S rRNA基因测序后经NCBI数据库比对发现,该寄生虫与Branchiomma sp.相似性为99.13%。所得寄生虫28S rRNA基因则与黑斑鳍缨虫B. nigromaculatum相似性为100%,与Branchiomma sp. (EF116223.1) 相似性为99.12%。以邻接法构建系统进化树 (图3),寄生虫样品均被划分为鳍缨虫属 (Branchiomma),可能为黑斑鳍缨虫,但仍需进一步的证据证明。

      图  3  基于18S和28S的小头鲔寄生虫发育树分析

      Figure 3.  Phylogenetic tree analysis of E. affinis parasite based on 18S and 28S marker

    • 养殖池内共有小头鲔29尾,通过仔细观察水下摄像机视频发现50%以上的小头鲔体表附着1条或多条寄生虫。当甲醛浸泡的初始体积分数为51 mL·m−3时,小头鲔未见明显异常反应,同时鱼体体表及池壁寄生虫未见脱落;然后添加2次每次150 mL甲醛溶液后寄生虫开始脱落,此时甲醛体积分数为57 mL·m−3;维持该浓度继续浸泡90 min后,鱼体体表及池壁寄生虫基本脱落,此时开始排换水。脱落后的寄生虫活力很弱或死亡。浸泡结束后1 h发现,有7尾寄生虫侵害较重的小头鲔死亡,其余恢复正常,总体死亡率为24.1%。后经多次复查,均未发现此寄生虫。

    • 由于小头鲔的陆基室内养殖在国内是首例,在国际上也未见报道,因此养殖过程中寄生虫暴发没有先例借鉴。目前研究表明,海水养殖鱼类寄生虫大部分是鱼蛭 (Piscicola sp.),形态与淡水水蛭相似,体扁而细长,具环节,能游泳;身体前后各具一吸盘,可吸附于宿主、石块及水草等物体上[9]。在海水鱼类养殖过程中,大型条状寄生虫以鱼蛭为主,且此前并未见鳍缨虫属营寄生生活的报道,因此笔者对海水鱼蛭与本文中寄生虫进行了较为详细的对比研究。通过外形对比发现,本研究发现的寄生虫与鱼蛭存在相同之处,两者均营寄生生活,长条状,身体分节,均可附着于鱼体表面。但也存在明显不同,鱼蛭体型较小 (体长2~40 mm,体宽0.7~1.2 mm),没有头部膨胀夸张的附着器官 (鳃冠),但身体前后均有吸盘,同一环境体色较单一,喜附着于鳍基部,尤其是腹鳍鳍基,能游泳;本研究中寄生虫体型较大 (体长20~90 mm),头部有膨大的附着器官 (鳃冠),同一环境具有多种体色,喜附着于胸鳍基部至末端2/3处和胸鳍基部向上靠近鳃盖骨的位置。鱼蛭的宿主主要有石斑鱼 (Epinephelus sp.)、波纹唇鱼 (Cheilinus undulatus)、豹纹鳃棘鲈 (Plectropomus leopardus)、驼背鲈 (Chromileptes altivelis)、六斑刺鲀 (Diodon holocanthus) 等。鱼蛭吸附后吸食宿主血液,可导致宿主贫血衰弱;可引起疼痛导致宿主焦躁,从而将身体与池壁摩擦,造成鳞片脱落、皮肤破损,伤口易继发细菌感染而死亡。我国南方地区常见的鱼蛭与 Silva[10-11]、Cruz-Lacierda和Toledo[9]、Nagasawa和Uyeno[12]、Bengchu等[13] 在东南亚国家 (如菲律宾、马来西亚等) 的海水鱼体表采集到的Zeylanicobdella arugamensis的形态特征一致。杨潼[14-15]、雷霁霖[16]、德渐[17]、吴宝铃[18]、宋大祥[19]、谭恩光[20]对我国蛭类的形态特征、生态分布、种系分类等开展了大量的基础研究工作,而有关鱼蛭科种类的报道却较少,目前仅发现6个属11个种,其中寄生在海水鱼体上的有6种[14-16]。本研究中小头鲔寄生虫经分子鉴定为环节动物门、多毛纲、缨鳃虫目、缨鳃虫科、鳍缨虫属。就附着物体而言,鳍缨虫与鱼蛭明显不同。1980年吴宝铃[18]对西沙群岛海域多毛类动物的研究涉及到缨鳃虫目的相关介绍,1988年杨德渐[17]对中国近海多毛类环节动物做了相关描述,均表明鳍缨虫属大部分生存于坚硬物品 (如石块、木头等) 表面,尚未见有营寄生生活的报道。

      2007年孙瑞平和类彦立[3]对我国近海缨鳃虫科的4个物种进行了详细介绍,为后续的研究提供了很大的帮助。本研究中发现的寄生虫与孙瑞平和类彦立描述的黑斑鳍缨虫相似度很高,这种虫在海南新盈、新村 (1992年3月)、三亚 (潮间带和潮下带约10 m、底质珊瑚礁沙石,1957年6月)、南海 (水深20~57 m、底质泥质沙或沙软泥) 均有发现[3],仅存少数不同点,孙瑞平和类彦立描述的黑斑鳍缨虫见于海底坚硬物品表面,具钙质管,且鳃丝背面具有成对等长的8~14对细指状外突起,并且突起间还具有带状色斑[2];而本研究中的鳍缨虫发现于小头鲔体表,未发现钙质管,鳃丝背面光滑无指状突起,可营寄生生活,并可对鱼体有较大的伤害。是否属同一物种有待进一步研究,关于其寄生范围仍有待进一步探索。Kupriyanova和Rouse[21]运用18S和28S对缨鳃虫科的两种生物进行种类鉴定,两种缨鳃虫均具有钙质管,其中鉴定为鳍缨虫属的一例 (未确定种名) 与本研究中寄生虫外形及18S基因鉴定结果具有高度一致性。与本研究发现的鳍缨虫外形的主要差别在于未发现钙质管。

      由于金枪鱼的高营养、高价值导致市场需求量逐年增大,野生捕获量逐年增加,野生资源逐年减少。目前金枪鱼养殖技术开发正在进一步完善中,主要养殖国家有日本、美国、澳大利亚、西班牙、巴拿马、印尼等。关于海水鱼类的体表大型寄生虫在金枪鱼上的报道较少,寄生虫暴发经常在石斑鱼、大菱鲆 (Scophthalmus maximus) 等出现。目前关于海水鱼类鱼蛭类暴发的常规治疗方法为甲醛、硫酸铜等浸泡,其中甲醛的效果最好[20]。鱼蛭的寄主种类很多,如豹纹鳃棘鲈、尖吻鲈 (Lates calcarifer)、军曹鱼 (Rachycentron canadum)、红鳍笛鲷 (Lutjanus erythropterus)[12, 22]。在金枪鱼养殖过程中寄生虫病的发生亦会对其生长及存活产生较大影响,例如盾纤虫病暴发会对金枪鱼类 (南方蓝鳍金枪鱼、北方蓝鳍金枪鱼) 养殖生产造成极其严重的危害[23-24]。本研究中鳍缨虫的有效治疗方法与其他养殖海水鱼类相似,可通过甲醛浸泡脱离。

      目前金枪鱼的养殖苗种多来自海捕,野外幼鱼可能携带细菌、病毒及寄生虫等病原,导致后续养殖过程中病害暴发,因此,采捕后的幼鱼需经过检验检疫以确保无明显疾病带入养殖车间;加强饵料管理,制定科学日常饵料投喂策略,对鲜杂鱼进行减菌化、除虫化处理,以确保饵料安全;进行水质因子监测与调控,保持良好的养殖环境;定期筛分,保持养殖池内个体规格相近,维持合理密度,降低病害暴发的风险;开展金枪鱼行为学研究,探明鱼体行为活动与生理状态间的联系。

    • 本次陆基室内小头鲔养殖过程中鱼体体表有寄生虫附着现象,其形态与鱼蛭存在差异。经组织切片观察发现,该虫与鱼蛭 (Piscicola sp.) 有较大差别,该寄生虫由鳃冠、胸区和腹区组成;无钙质管;其消化道包括口、口腔、咽、肠、肛门等;经18S rRNA分子鉴定,该寄生虫与Branchiomma sp.相似性为99.13%;而28S rRNA则显示,该寄生虫与黑斑鳍缨虫相似性为100%,与Branchiomma sp. (EF116223.1) 相似性为99.12%。因此,该寄生虫可能为鳍缨虫属、黑斑鳍缨虫,但因外部形态和生活习性的细微差别仍需进一步验证。该虫附着于小头鲔体表后,小头鲔摄食量明显下降,游泳速度加快,易受惊吓。采用甲醛浸泡具有良好的去除效果,去除后小头鲔成活率为75.9%。

参考文献 (24)

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