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环境DNA在水生生态系统生物量评估中的研究进展

秦传新 左涛 于刚 周文礼 李纯厚

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环境DNA在水生生态系统生物量评估中的研究进展

    作者简介: 秦传新 (1978—),男,博士,副研究员,从事渔业资源保护和环境修复研究。E-mail: qincx@scsfri.ac.cn;
  • 中图分类号: S 932.2

Advances in research of environmental DNA (eDNA) in biomass assessment of aquatic ecosystems

  • CLC number: S 932.2

  • 摘要: 环境DNA (Environment DNA, eDNA) 技术因其无创、高效、经济、灵敏等特点在水生生态系统生物评价中愈来愈引起人们的重视。文章围绕eDNA技术的内容、应用现状和面临的挑战3个方面,系统综述了该技术在实验室环境和野外环境水生生态系统生物量评估中的应用进展,探讨其优劣势、生态过程、评估错误等内容,展望了该技术在水生生物量评估领域的应用前景,以期为eDNA技术的相关应用研究提供参考。
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-12-19
  • 录用日期:  2020-05-10
  • 网络出版日期:  2020-10-09
  • 刊出日期:  2020-10-05

环境DNA在水生生态系统生物量评估中的研究进展

    作者简介:秦传新 (1978—),男,博士,副研究员,从事渔业资源保护和环境修复研究。E-mail: qincx@scsfri.ac.cn
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所/国家渔业资源环境大鹏观测实验站/广东省渔业生态环境重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 南方海洋广东省实验室,广东 广州 511458
  • 3. 天津农学院水产学院,天津 300384

摘要: 环境DNA (Environment DNA, eDNA) 技术因其无创、高效、经济、灵敏等特点在水生生态系统生物评价中愈来愈引起人们的重视。文章围绕eDNA技术的内容、应用现状和面临的挑战3个方面,系统综述了该技术在实验室环境和野外环境水生生态系统生物量评估中的应用进展,探讨其优劣势、生态过程、评估错误等内容,展望了该技术在水生生物量评估领域的应用前景,以期为eDNA技术的相关应用研究提供参考。

English Abstract

  • 由于受过度捕捞、栖息地退化等压力影响,水生生态系统不堪重负,渔业资源持续下降,生物多样性锐减。目前缺乏有效可靠的工具来记录现存物种和评估生物多样性的变动趋势。传统渔业评估依赖于使用渔网、捕集器、电钓、垂钓、水声和目测等方法对鱼类捕获物进行观察[1],这些方法具有一定的局限性,如:1) 鉴定错误性:物种丰富的多样性和复杂性要求专家具备多年的鉴别经验和知识储备,由此带来的困难也造成了许多分类群体鉴别错误[1];2) 生态破坏性:传统的电捕鱼和刺网捕鱼法会造成水生生物大面积非自然死亡,破坏像珊瑚礁这样的自然生态系统,造成不可逆的伤害;3) 观察困难性:游泳性生物游动的不可测性需要传统方法投入大量人力物力进行观察,丰富度低的珍稀生物较难获取,需要引进专门设备[2];4) 成本高昂性:由于水生生态系统的特殊性,需要更多的人力和高昂的设备开展调查工作,从而需要大量的科研经费投入[3]。鉴于此,亟需一种可靠技术进行补充调查,以更好地监测生态系统。

    环境DNA (Environment DNA, eDNA) 技术是指从环境样品 (土壤、沉积物和水体等) 中直接提取目的基因片段后利用各种分子技术进行定性或定量分析的方法[4]。eDNA技术因其具备的众多优点逐渐被科研工作者重视,如:1) 创伤性低:eDNA的采样方法不会破坏生态环境,可以在没有直接观察的情况下进行检测;2) 灵敏度高:生物个体的活动令传统调查方法费时耗力,但eDNA技术结合分子手段可简便地检测出广阔范围的物种;3) 应用广泛:eDNA检测技术的应用是多样化的[5-7],包括监测入侵物种和濒危物种,评估生物量和评价物种多样性。这些优势使得利用eDNA技术可以更好地掌握整个水生生态系统的情况,为开展渔业评估等工作提供技术参考。Takahara等[8]率先尝试利用eDNA技术对日本淡水湖Ibanaiko湖中的鲤 (Cyprinus carpio) 进行资源量评估。然而,国内应用eDNA技术开展各种水生生态系统生物量评估的研究尚较少。

    本文以eDNA技术在水生生物生态系统生物量定量评估中的应用为重点,综述了其工作内容、在水生生态系统生物量评估中的应用和面临的挑战等,并展望了该技术未来发展的趋势,以期为今后eDNA技术在水生生态系统生物量评估的应用提供参考。

    • eDNA技术于1987年出现在环境微生物学领域,2000年后得到广泛应用,2003年Willerslev等[9]的研究标志着eDNA分析从低等微生物扩展至高等动植物。早前的研究均用于分析沉积物中DNA,而水样中DNA的首次研究则是利用从水样中提取的DNA去监测水域中是否存在入侵物种美国牛蛙 (Rana catesbeiana)[4]

      eDNA样品制备一般分为3个步骤,即样品采集、样品处理和eDNA提取。1) 样品采集。根据研究需求的不同,采集水样的体积和方法等也不同,最常用的水样体积为1~2 L[6]。为了尽可能获取生物体释放在环境中的eDNA,通常从同一水体中采集多个样本,以确保资源调查等研究工作的顺利开展。2) 样品处理。根据采样情况选择是否立即过滤水样,不直接过滤需放置于低温环境,及时运送到过滤场所进行过滤[10]。目前,对于滤膜规格和类型的选择并没有统一的标准。一般来说,过滤水样的滤膜直径越小,收集的eDNA量越大,Turner等[11]建议用直径为0.2~10 μm的滤膜进行过滤以免阻塞,影响实验进度。滤膜的材质有玻璃纤维膜、硝酸纤维膜、聚碳酸酯膜和尼龙膜等[6]。3) eDNA提取。水样浓缩后需及时放置于−20 ℃的低温环境,直至进行DNA提取工作。大多数研究者采用商业试剂盒与传统方法相结合的方式提取eDNA。方法主要有酒精沉淀法、过滤法及酚-氯仿-异戊醇法等[12]

      开展实验室和野外采样等工作时,应设置阴性对照避免污染,操作人员需佩戴一次性无菌手套,相关仪器均用10%的次氯酸钠漂洗消毒。

    • eDNA检测方法主要依赖分子技术,如多聚酶链反应 (Polymerase chain reaction, PCR)、实时定量聚合酶链反应 (Real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)、数字PCR (Digital PCR, dPCR)、环境DNA宏条形码 (eDNA metabarcoding) 等[13]。这些检测方法的主要原理是通过扩增水样中含有的基因序列片段,从而对目标物种进行监测。研究者可根据研究需求选择相应的分子技术开展水生生态系统生物量评估和多样性监测等工作。

      在研究单一物种时,PCR凝胶电泳结果以阳性、阴性进行记录[4],结果为阳性表明eDNA样品中包含目标物种DNA,说明取样水域中有该物种生存,结果为阴性则没有。在研究多物种时,PCR凝胶电泳结果不能单纯以阳性和阴性进行记录,需结合传统资源调查以及高通量测序的方法进行推断。

      除了单纯判断存在情况,还可以利用eDNA浓度和生物量之间的关系,具体量化物种存在的实时情况[14]。用于定量分析最常见的分子技术为qPCR技术[6],该技术通过Ct值和标准曲线对环境样本的起始模板进行定量,用荧光信号的变化反映PCR扩增中每个循环扩增产物量的变化。与传统PCR相比,qPCR敏感性更高,已被用于快速检测环境样本中水生生物DNA。此外,dPCR技术也能精准定量eDNA的浓度,该技术的原理是根据泊松分布和荧光信号阳性的反应单元占所有反应单元的比例来计算目的核酸序列的拷贝数。相比qPCR,dPCR技术更适合检测微量的DNA,同时对抑制剂耐受性好,对大量的样本可能更具成本效益[15]。qPCR的结果以扩增量是否超过荧光阈值为依据,当扩增量超过荧光阈值时,表明样品中含有一定量的eDNA;当扩增量低于荧光阈值时,表明样品中没有eDNA或eDNA浓度太低导致检测失败。

      根据研究目的不同,引物的设计原则也不同。研究单一物种,需设计特异性引物进行扩增;研究多个物种,需设计通用性引物进行扩增。而eDNA metabarcoding技术是通过设计通用引物扩增eDNA,得到的PCR产物结合第二代测序等分子技术,在短时间内获得可操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTUs),并与具有可靠物种分类信息的DNA条形码参照序列进行比对,从而实现对目标物种的信息获取及大量样本的物种鉴定[16]

    • 利用上述分子方法检测水样中的eDNA,根据扩增和测序结果在GeneBank等数据库进行BLAST序列比对,找到对应物种,进行下一步的结果分析。eDNA的结果分析围绕3个方面进行,即定性研究、定量研究、生物多样性研究。

    • 2008年Ficetola等[4]利用eDNA技术开启了监测水生生物的实时应用研究,越来越多的学者也利用该技术对多个水生物种展开应用,为渔业评估奠定了扎实的基础[17],如长江江豚 (Neophocaena asiaeorientalis)[10]、中国明对虾 (Fenneropenaeus chinensis)[6]、曼氏无针乌贼 (Sepiella maindroni)[18]和枝角类[19]等。

    • Takahara等[8]率先利用qPCR技术在实验室条件和野外池塘对鲤进行生物量评估,得出eDNA浓度与其生物量呈正相关关系,该研究为渔业资源调查评估提供了新的研究思路。Mauvisseau等[20]使用qPCR检测和量化评估了难捕获的章鱼 (Cotyledon octopus),在实验室条件下检测的总生物量与捕获到的章鱼数量呈显著正相关。Nathan等[15]比较了PCR、qPCR和dPCR这3种平台对eDNA的检测效果,发现均能可靠地检测出eDNA的存在,2个定量平台 (qPCR和dPCR) 估计的eDNA浓度结果相似,但使用dPCR完成分析的速度更快且费用更低,表明ddPCR是一种分析eDNA结果的经济有效方法。

    • 利用高通量测序 (High-throughput sequencing, HTS) 和生物信息学筛选含有eDNA的水样以反映水生物种的状况,对于研究保护濒危物种、预防入侵物种和评估物种生物量等工作是一个革命性的进步。越来越多的学者为此开展了相关研究[19, 21-22],Miya等[23]开发了一套通用引物,并用其检测出了180种鱼,其中168种分布在59科123属,这些鱼类不仅在分类上多样化,而且在生态上也有很大的变化。Lacoursière-Roussel等[16]用eDNA metabarcoding方法分析了北极海洋生物多样性,在2个采样点共鉴定了181个物种,这与历史北极调查数据有74.0%的高度一致性。Yamamoto等[24]比较了视觉观察和eDNA metabarcoding检测物种的方法,后者共检测出128种鱼类,其中40种鱼类也能通过视觉观察方法在14年间被检测,有23种本地鱼类不能被视觉观察方法检测到。这些研究表明eDNA技术在分析生物多样性方面具有无限的潜力,应重视相关生态监测工作的开展,从而为保护生态系统提供理论基础。

    • 越来越多的研究将eDNA浓度与生物量联系起来,但由于不同生物类群、相同生物的不同个体间的差异,其释放的eDNA总量和速度各不相同,因而难以实现跨类群的定量分析[25-26]。因此,eDNA量化可以提供栖息地使用和偏好的线索,从而为建设栖息地提供理论基础,也为保护生态系统提供技术支撑。本文把水生生态系统分为实验室可控环境和野外环境两种,详细讨论了eDNA技术生物量评估的工作。

    • 在实验室条件下模拟生态实验,可以更直观地探讨生物和非生物因素 (如pH、光照和微生物等) 对eDNA释放和降解等生态过程的影响[25],这些生态过程的改变会影响eDNA浓度变化,从而导致生物量评估的结果不同。为了更科学地将该技术应用到野外环境中,许多研究者先搭建模拟实验,研究这些因素与生物量之间的关系,从而对生物量进行相应评估。例如Takahara等[8]率先利用eDNA技术开展了生物量评估工作,得出水温是影响鲤eDNA浓度分布的主要因素,而eDNA浓度与鲤生物量呈正相关,可以将eDNA技术用于反映自然界中生物的分布。Eichmiller等[27]比较了不同温度条件下eDNA的降解速率,发现随着温度升高,eDNA呈指数衰减。而Klymus等[28]发现虽然eDNA的量与鱼的生物量呈正相关,摄食可以使eDNA的脱落量增加10倍,水温却对其没有影响。影响eDNA释放和降解的因素有很多,但这些因素带来的作用仍存在一定争议,需要进一步探究这些因素间的相关性,从而为生物量评估工作提供参考。不同个体及其不同的发育阶段释放eDNA的速率不同。Sassoubre等[29]在5 200 L的中生态系统中检测了3种海洋鱼类eDNA的脱落率和降解率,得出eDNA的脱落速率为每克生物量每小时165~3 368 pg DNA,一阶衰变速率常数介于每小时0.055~0.070。Maruyama等[26]研究了蓝鳃太阳鱼 (Lepomis macrochirus) 不同发育时期对eDNA释放速率的影响,发现成年鱼组 (体质量30~75 g) 的eDNA释放速率是幼鱼组 (体质量0.5~2.0 g) 的3~4倍。这些研究均指出鱼的生长指标与eDNA释放和降解速率间的关系,表明使用eDNA技术评估水生生态物种生物量是可行的。

      除了单一物种可直接检测eDNA浓度与生物量之间的关系,eDNA也可以通过测序方法得到成千上万的OTUs,间接发现物种丰度和序列丰度之间的关系,为生物量评估工作提供参考。Kelly等[30]对在45×105 L中低温水族缸中收集的eDNA进行测序,结果虽然未能建立生物量与eDNA丰度之间的定量关系,但发现eDNA的丰度与该生态系统中相应物种生物量的丰度相关。Evans等[31]设计了一个206 L的中生态系统实验,并使用eDNA metabarcoding方法检测出8种鱼类和1种两栖动物,发现物种丰度和序列丰度之间存在一定的相关关系。这些研究均表明在实验室条件下开展水生生态生物量评估工作是可行的。

    • 有研究表明eDNA技术在野外条件下开展生物量评估工作也是可行的。Pilliod等[32]应用eDNA技术检测野外两栖动物,发现随着水中eDNA浓度和重复样本数量有所增加,所检测到的两栖动物概率也有增加。Baldigo等[33]结合电鱼等传统调查与eDNA技术方法的数据相比较,证实了在阿迪朗达克山脉西部40个河流地点中,溪红点鲑 (Salvelinus fontinalis) 的种群密度变化了44%、生物量变化了24%。Yamamoto等[34]同时使用eDNA技术和回声测深技术监测日本竹䇲鱼 (Trachurus japonicus) 的生物量,得出地表水样品eDNA浓度估计值与回波强度呈显著正相关,通过一个最佳拟合模型在一定范围内获得回声强度,表明eDNA浓度很可能反映了海湾150 m范围内的鱼类生物量。

      水生生态系统的复杂性导致了环境因素和水体流动影响生物量评估工作[35]。这是因为生物脱落的eDNA暴露于水体环境中,而eDNA降解会导致浓度变化。生物释放的eDNA具有实时性,流动的水体会导致eDNA时间和空间的不确定性,这为生物量评估工作的开展带来了一定的困难。Tillotson等[36]研究得出河流内的位置、活/死比、水温等会影响eDNA和生物量在空间或时间上的相关性,还得出eDNA在流水中短距离 (数十米) 内似乎是守恒的,但在较大尺度 (约1.5 km) 内降解较快。除了环境影响,人为过度捕捞也会影响eDNA浓度的变化。Lacoursière-Roussel等[37]将eDNA数据与湖红点鲑的刺网数据进行比较,得出eDNA浓度与水温、溶解氧、pH和浑浊度的变化不显著,但与单位努力渔获量 (Catch per unit effort, CPUE) 的相对丰度呈显著正相关,与单位努力生物量 (Biomass per unit effort, BPUE) 的关系不显著。总而言之,在野外环境评估水生生态系统生物量存在一定困难,只有掌握eDNA在流水生态系统中的运作机制,才能为管理水生生态系统提供战略措施。

    • eDNA技术相较于传统调查方法具有一定的劣势。例如无法直接观察标本,不能进行生物学测量;无法评估鱼的个体状况,不能判断种群结构的各个生命阶段;无法直接判断时间和空间的具体情况,不能获得关于精细尺度栖息地利用的信息。然而,传统调查方法可以弥补这些劣势,因此eDNA技术与传统调查方法的优势和局限需要根据具体研究目的进行权衡,二者相辅相成,才能为水生生态系统渔业评估相关工作提供有力的技术支撑。

    • eDNA的生态过程包含eDNA的来源、迁移、降解3个部分。

      eDNA的来源多种多样,可能来自皮肤、黏液、唾液、精子、分泌物、卵子、粪便、尿液、血液、根、叶、果实、花粉和较大生物体的腐烂体[12]。eDNA的产生取决于物种的生物量、年龄和摄食活动,及生物的生理学、生活史和生态空间利用情况[38]。不同生物类群释放的eDNA总量和速度各不相同,个体eDNA产生率的差异也很大[25-26]

      eDNA的迁移导致了eDNA浓度的时间和空间不确定性。相关研究表明,eDNA浓度反映了一定范围内的生物量[34],而另外有研究表明,流动的水可能导致数百米内eDNA浓度与当地物种的存在无关[32],例如Tillotson等[36]研究了eDNA浓度和产卵红鲑 (Oncorhynchus nerka) 的丰度之间的定量关系,得出在鲑产卵季节动态生物事件的背景下,eDNA浓度可能在极短时间内发生显著变化。这些研究表明,eDNA浓度在其起源地的局部距离里是相对恒定的,随着相隔起源距离的增加,所能检测到的浓度值下降[39]。虽然eDNA技术无法像传统调查技术一样具有实时性,但其省时、省力、灵敏等特点在资源评估工作应被重视。

      eDNA释放到水中,通过水流波动迁移也同时暴露于环境中,受到多种因素的影响使其在水中的持久性不同。总体来说,eDNA释放到水中的浓度呈迅速下降趋势,直至趋近于零。Pilliod等[40]研究表明,eDNA的可检测性和浓度取决于个体的生产速率、环境条件、生物密度和其停留时间。Strickler等[25]通过一系列研究发现在高温、高pH和UV-B强光的条件下,eDNA降解更快。由此可以得出eDNA降解速率可能是非生物环境 [ 即光、氧 (O2)、pH、盐度和基质的丰度和组成等 ]以及生物环境 (即微生物群落和胞外酶的组成和活性等) 相互作用的结果[41]

      总体来说,eDNA生物量评估更应该关注于eDNA本身的释放、迁移、降解等方面,理解这些因素所造成的时间和空间差异,揭示各因素间的相互关系,才能更好地为开展生物量评估等相关工作提供理论基础。

    • 除上述挑战之外,应用eDNA技术开展生物量评估工作还面临一个不容忽视的挑战,即假阳性和假阴性,也称为Ⅰ型错误和Ⅱ型错误。当检测到非目标物种或死亡生物体时称为假阳性,当目标物种存在而未被检测出称为假阴性[5, 7]

      在实验室和野外环境等条件下,可以采取多种措施避免假阳性和假阴性的产生。1) 避免样品污染源。严格防止人员、仪器、样品等交叉污染是所有实验开展的前提[42]。2) 重视引物设计。不同的引物在类群间覆盖、分辨率和偏向性方面存在差异[19]。3) 增加重复次数。研究者常常采取增加采样重复和PCR重复的方法,来避免假阳性和假阴性错误。4) 认识到完善数据库的重要性。例如Lacoursière-Roussel等[16]在加拿大北极地区的2个港口Churchill和Iqaluit进行eDNA多样性分析,将历史北极调查数据与eDNA样品结果进行比较,虽然得出两者高度一致性的结果 (74.0%),但由于数据库的不完善仍有大部分物种未能得到明确分类。

      在野外环境中,设计有质量的采样方案是实验成功的关键前提,可根据实际情况从采样的方法、地点、次数等方面进行设计。许多研究都通过过滤从水样中浓缩eDNA,而使用该方法捕获eDNA的量则取决于过滤的材料和孔径大小。不同的生物所释放的eDNA粒子直径不同,所选择的材料和孔径也不同,Turner等[11]研究得出大部分大型生物所释放的eDNA粒子可以被直径范围为1~10 μm的滤膜捕获。过滤水样的体积与eDNA捕获量呈正相关,采样的次数和位置也与eDNA捕获量相关,因此可以权衡各方面的成本,在允许的条件下过滤尽可能多的水样,从而获得更多的目标eDNA捕获量。另外,掌握eDNA生态过程的运作机制是开展实验的关键环节。由于野外环境的特殊性,许多不可控的因素会导致错误的发生,例如在水流或者其他介质的传播下,死亡个体会造成假阳性错误。Lodge等[43]发现鲤的eDNA传播介质有人类排放的生活污水、鸟类误食鲤产生的粪便、丢弃入河的鲤残尸、船舶运输的间接富集。为避免eDNA技术中出现假阴性和假阳性的结果,实验室和野外工作中都应设置阴性和阳性对照。

    • 近几十年来,从第一代到第三代测序技术的突破揭示了分子技术的广阔应用前景。eDNA技术既可以采用普通PCR方法检测生物的存在情况,亦可以利用qPCR和dPCR定量物种的丰富度,还可以结合eDNA metabarcoding分析生物的多样性,应用前景广阔。在生物量评估的研究工作中,传统的声学和网具等调查方法虽可以直接观察生物群落和个体情况,但其耗时长、成本高、伤害大的局限性不容忽视。虽然eDNA技术无法直接观测生物个体的年龄和发育阶段等数据,但其具有的高效、经济、安全等特点可以很好地弥补传统调查方法的缺陷。eDNA技术正在成为评价多物种和多生态的一个强有力的工具。综上,传统方法和eDNA技术都不能绝对取代彼此,只有将两者相互交融、取长补短,才能为生物量评估工作提供技术支持。

参考文献 (43)

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