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马氏珠母贝肉酶解产物的抗酒精性肝损伤作用

钟佳佳 章超桦 高加龙 秦小明 曹文红 郑惠娜 林海生

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马氏珠母贝肉酶解产物的抗酒精性肝损伤作用

    作者简介: 钟佳佳(1994—),女,硕士研究生,研究方向为水产品加工与贮藏。E-mail: 2430827884@qq.com;
    通讯作者: 章超桦, zhangch2@139.com ; 高加龙, Garonne@126.com
  • 中图分类号: TS 254.9

Anti-hepatic injury effect of enzymatic hydrolysate from soft tissue of Pinctada martensii

    Corresponding author: Chaohua ZHANG, zhangch2@139.com ;Jialong GAO, Garonne@126.com ;
  • CLC number: TS 254.9

  • 摘要: 为探究马氏珠母贝肉酶解产物 (Enzymatic hydrolysate from Pinctada martensii, EP)对酒精性肝损伤 (Alcoholic liver damage, ALD)的保护作用,该研究将EP超滤分级为截留分子量>10 kD (EP-Ⅰ)、3~10 kD (EP-Ⅱ)和<3 kD (EP-Ⅲ) 3个组分,检测其体外抗肝损伤活性及对ALD小鼠肝保护作用的影响。体外试验结果显示,EP-Ⅲ可显著激活体外乙醇脱氢酶 (ADH)活性 (P<0.01),3个超滤组分均具有一定的体外抗氧化能力且EP-Ⅲ>EP-Ⅱ>EP-Ⅰ;动物试验结果显示,与模型对照组相比,各超滤组分均能够显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶 (ALT)和谷草转氨酶 (AST)活力、小鼠肝脏指数及肝脏中丙二醛 (MDA)和甘油三酯 (TG)含量,同时显著增强小鼠肝脏中超氧化物歧化酶 (SOD)、乙醇脱氢酶 (ADH)和乙醛脱氢酶 (ALDH)活力,提高肝脏中的谷胱甘肽 (GSH)含量。综上,马氏珠母贝肉酶解超滤组分对急性ALD具有一定的辅助保护作用,其中EP-Ⅲ的保护作用效果最佳,其机制可能与加快机体乙醇代谢和减缓乙醇对机体造成的氧化损伤相关。
  • 图 1  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分对体外乙醇脱氢酶活性的影响

    Figure 1.  Effect of EP ultrafiltration components on ADH activity in vitro

    图 2  马氏珠母贝肉酶解产物对酒精性肝损伤小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响

    Figure 2.  Effect of EP on ALT and AST in serum of ALD mice

    图 3  马氏珠母贝肉酶解产物对酒精性肝损伤小鼠肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的影响

    Figure 3.  Effects of EP on ALT and ALDH in serum of ALD mice

    表 1  马氏珠母贝肉酶解产物及其超滤组分中蛋白质和小分子肽含量

    Table 1.  Content of protein and small molecule peptide in EP and its ultrafiltration components $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    组别
    Group
    蛋白质质量分数
    Protein mass fraction/(g·kg−1)
    小分子肽质量分数
    Small molecular peptide mass fraction/(g·kg−1)
    小分子肽占比
    Proportion of small molecular peptides/%
    马氏珠母贝肉酶解产物组 EP group 616.65±50.15 451.14±15.39 73.38±4.11
    EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 575.67±36.22 91.91±17.89** 16.08±3.75**
    EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 554.42±39.59 155.33±26.00** 28.13±5.09**
    EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 490.29±24.35* 431.74±16.74 88.22±5.90**
    注:与马氏珠母贝肉酶解产物组相比,*. P<0.05,**. P<0.01;表2同此 Note: Compared with the enzymatic hydrolysate of P. martensii; *. P < 0.05; **. P < 0.01. The same case in Table 2.
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    表 2  马氏珠母贝肉酶解产物及其超滤组分的氨基酸组成

    Table 2.  Amino acid composition of EP and its ultrafiltration components g·kg−1

    氨基酸种类
    Amino acid species
    马氏珠母贝肉酶解产物
    EP group
    EP-Ⅰ组
    EP-Ⅰ group
    EP-Ⅱ组
    EP-Ⅱ group
    EP-Ⅲ组
    EP-Ⅲ group
    天冬氨酸 Asp 49.10±0.35 31.80±0.41** 35.10±0.61** 46.10±0.61**
    苏氨酸 Thr* 22.30±0.65 13.50±0.74** 21.10±0.45 19.10±0.66**
    丝氨酸 Ser 18.10±0.28 11.20±0.31** 11.80±0.74** 10.40±0.54**
    谷氨酸 Glu 55.20±0.71 58.90±0.11** 58.70±0.40** 72.20±0.34**
    脯氨酸 Pro# 20.10±0.55 17.30±0.58 ** 17.90±0.27** 14.10±0.17**
    甘氨酸 Gly# 35.30±0.82 29.00±0.34** 32.10±0.45** 36.00±0.45
    丙氨酸 Ala# 30.00±0.41 26.20±0.62** 31.00±0.69 31.40±0.92
    胱氨酸 Cys 0.70±0.04 0.50±0.07 0.60±0.16 1.50±0.10**
    缬氨酸 Val*# 24.60±0.92 21.20±0.69* 25.20±0.24 24.70±0.75
    蛋氨酸 Met* 11.60±0.54 12.80±0.20** 10.10±0.44** 10.00±0.45**
    异亮氨酸 Ile*# 20.60±0.61 21.80±0.65 21.80±0.25 21.50±0.83
    亮氨酸 Leu*# 31.10±0.44 28.50±0.74** 33.40±0.54** 36.50±0.38**
    酪氨酸 Tyr 5.10±0.17 6.90±0.13** 9.10±0.18** 7.80±0.21**
    苯丙氨酸 Phe*# 17.00±0.96 14.60±0.51** 18.90±0.17** 19.70±0.66**
    赖氨酸 Lys* 37.40±0.83 23.20±0.45** 26.00±0.98** 32.60±0.88**
    组氨酸 His 6.80±0.59 8.30±0.27* 8.90±0.25* 7.70±0.20
    精氨酸 Arg 28.00±0.59 13.60±0.54** 20.10±0.88** 15.20±0.34**
    氨基酸总和 Total amino acid, TAA 413.00±4.53 339.30±3.51 381.80±3.82 406.50±1.80
    必需氨基酸 Essential amino acid, EAA 164.60±2.86 135.60±1.17 156.50±1.68 164.10±0.78
    疏水性氨基酸 Hydrophobic amino acid, HAA 178.70±1.51 158.60±1.73 180.30±1.23 183.90±1.74
    注:*. 必需氨基酸;#. 疏水性氨基酸 Note: *. Essential amino acid; #. Hydrophobic amino acid
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    表 3  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分的体外抗氧化能力

    Table 3.  Antioxidant capacity of EP ultrafiltration components in vitro $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    组别
    Group
    2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)
    二铵盐自由基清除率
    ABTS free radical scavenging activity/%
    2,2-联苯基-1-苦基肼基自由基清除率
    DPPH free radical scavenging activity/%
    还原力A700 nm
    Reducing power
    维生素C组 VC group 89.60±0.23 89.39±0.82 1.878±0.083
    EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 86.68±0.44** 84.54±1.47* 1.568±0.060**
    EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 87.46±0.18** 85.13±2.57* 1.811±0.050
    EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 88.14±0.25** 86.34±1.21 1.811±0.046
    注:与维生素C组相比,*. P < 0.05;**. P < 0.01 Note: Compared with VC group, *. P < 0.05; **. P < 0.01
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    表 4  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分对酒精性肝损伤小鼠体质量及其肝脏指数的影响

    Table 4.  Effects of EP ultrafiltration components on body mass and liver index of ALD mice $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    组别
    Group
    初次灌胃体质量
    Body mass of primary gastric perfusion/g
    末次灌胃体质量
    Body mass of last gastric perfusion/g
    肝脏指数
    Liver index/(mg·g−1)
    空白对照组 Blank control group 23.63±1.05 25.31±0.71 3.55±0.21##
    酒精模型组 Alcohol model group 24.37±0.83 26.35±0.87 4.40±0.26**
    阳性对照组 Positive control group 23.35±1.40 25.40±1.29 3.97±0.37*#
    EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 24.75±0.97 26.23±0.80 4.20±0.38**
    EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 24.31±0.73 26.47±1.44 3.90±0.32##
    EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 23.75±0.76 26.57±1.59 3.78±0.15##
    注:与空白对照组相比,*. P<0.05,**. P<0.01;与酒精模型组相比,#. P<0.05,##. P<0.01;图2图3表5同此 Note: Compared with blank control group, *. P<0.05, **. P< 0.01; compared with alcohol model group, #. P < 0.05, ##. P<0.01. The same case in Figure 23 and Table 5.
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    表 5  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分对酒精性肝损伤小鼠肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛和甘油三酯的影响

    Table 5.  Effects of EP ultrafiltration components on SOD, GSH, MDA and TG in liver of ALD mice $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    组别
    Group
    超氧化物歧化酶活力
    SOD activity/(U·mg−1)
    谷胱甘肽
    GSH/(nmol·mL−1)
    丙二醛
    MDA/(nmol·mg−1)
    甘油三酯
    TG/(nmol·mL−1)
    空白对照组 Blank control group 15.88±0.45## 2.64±0.27## 1.10±0.28## 0.02±0.01##
    酒精模型组 Alcohol model group 14.75±0.40** 1.58±0.13** 1.90±0.60** 0.07±0.02**
    阳性对照组 Positive control group 15.24±0.38 1.92±0.28** 1.19±0.24## 0.02±0.02##
    EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 15.13±0.28** 2.07±0.29**## 1.44±0.28## 0.05±0.03**
    EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 15.20±0.61** 2.14±0.38**## 1.22±0.35## 0.03±0.03##
    EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 15.58±0.61## 2.25±0.45## 1.04±0.17## 0.03±0.01##
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-23
  • 录用日期:  2020-01-17
  • 网络出版日期:  2020-03-13
  • 刊出日期:  2020-04-01

马氏珠母贝肉酶解产物的抗酒精性肝损伤作用

    作者简介:钟佳佳(1994—),女,硕士研究生,研究方向为水产品加工与贮藏。E-mail: 2430827884@qq.com
    通讯作者: 章超桦, zhangch2@139.com
    通讯作者: 高加龙, Garonne@126.com
  • 1. 广东海洋大学食品科技学院/国家贝类加工技术研发分中心 (湛江) /广东省水产品加工与安全重点实验室/广东省海洋生物制品工程实验室/水产品深加工广东普通高等学校重点实验室,广东 湛江 524088
  • 2. 大连工业大学/海洋食品精深加工关键技术省部共建协同创新中心,辽宁 大连 116034

摘要: 为探究马氏珠母贝肉酶解产物 (Enzymatic hydrolysate from Pinctada martensii, EP)对酒精性肝损伤 (Alcoholic liver damage, ALD)的保护作用,该研究将EP超滤分级为截留分子量>10 kD (EP-Ⅰ)、3~10 kD (EP-Ⅱ)和<3 kD (EP-Ⅲ) 3个组分,检测其体外抗肝损伤活性及对ALD小鼠肝保护作用的影响。体外试验结果显示,EP-Ⅲ可显著激活体外乙醇脱氢酶 (ADH)活性 (P<0.01),3个超滤组分均具有一定的体外抗氧化能力且EP-Ⅲ>EP-Ⅱ>EP-Ⅰ;动物试验结果显示,与模型对照组相比,各超滤组分均能够显著降低小鼠血清中谷丙转氨酶 (ALT)和谷草转氨酶 (AST)活力、小鼠肝脏指数及肝脏中丙二醛 (MDA)和甘油三酯 (TG)含量,同时显著增强小鼠肝脏中超氧化物歧化酶 (SOD)、乙醇脱氢酶 (ADH)和乙醛脱氢酶 (ALDH)活力,提高肝脏中的谷胱甘肽 (GSH)含量。综上,马氏珠母贝肉酶解超滤组分对急性ALD具有一定的辅助保护作用,其中EP-Ⅲ的保护作用效果最佳,其机制可能与加快机体乙醇代谢和减缓乙醇对机体造成的氧化损伤相关。

English Abstract

  • 马氏珠母贝 (Pinctada martensii),又称合浦珠母贝,是我国最主要的海水珍珠育珠贝之一,主要产区位于我国广东、广西和海南沿海等地[1]。马氏珠母贝肉营养丰富,含有大量蛋白质、多肽以及人体必需的多种氨基酸等活性物质,是原料大宗且广泛易得的优质蛋白质来源,也是提取生物活性肽的理想来源[2]。研究发现,马氏珠母贝酶解产物在抗氧化[3]、抗菌[4]、抗疲劳[5]、免疫调节[6]、醒酒[7]等方面功效显著,可作为海洋功能食品开发的重要来源之一。

    近年来,随着我国酒精类产品消费量的逐年增长,酒精滥用引发的健康问题日益突出,酒精性肝损伤 (Alcoholic liver damage, ALD) 就是典型之一[8-9]。研究指出,酒精类产品中的乙醇可在机体内产生大量活性氧和乙醛,通过诱导肝脏发生氧化应激、脂质过氧化和炎症反应继而引发ALD,致使肝细胞进一步坏死,最终发生肝纤维化和肝硬化[10-13]。因此,减少肝脏氧化应激反应、加快乙醇分解对抗酒精性肝损伤具有重要意义。笔者课题组前期研究发现,马氏珠母贝肉酶解产物 (Enzymatic hydrolysate from Pinctada martensii, EP)具有显著醒酒功效[7]。为探究EP是否对酒精性肝损伤具有一定的辅助保护作用,本研究将EP超滤分级为不同分子量大小的超滤组分,探究其体外抗ALD活性及其对ALD小鼠的肝保护作用,为EP抗ALD功能食品的研发提供依据。

    • 原料为马氏珠母贝肉,于2018年6月采自广东省湛江雷州市流沙养殖场,200 g分装后于−40 ℃贮藏备用。

      试验试剂有市售海王金樽片 (主要成分为牡蛎提取物,深圳市海王健康科技有限公司);市售56°红星二锅头 (北京红星股份有限公司);乙醇脱氢酶 (300 U·mg−1,购自美国Sigma公司);Bradford蛋白浓度试剂盒 (广州鼎国生物技术有限公司);谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、超氧化物歧化酶 (SOD)、还原型谷胱甘肽 (GSH)、丙二醛 (MDA)、甘油三酯 (TG)、乙醇脱氢酶 (ADH)和乙醛脱氢酶 (ALDH)等测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所)。

      实验动物为4周龄雄性昆明小鼠60只,SPF级,体质量约 (22±2) g,实验动物使用许可证号SCXK (京) 2014-0004,由中国医学科学院医学试验动物研究所提供。饲养条件为温度 (23±2)℃,湿度50%~60%,昼夜交替12 h/12 h。

    • R-1005型旋转蒸发仪 (郑州长城科工贸有限公司);FDU-1100型真空冷冻干燥机 (东京理化器械株式会社);Mini Pellicon超滤装置[默克化工技术 (上海)有限公司];Varioskan Flash全自动酶标仪[赛默飞世尔科技 (中国)有限公司]。

    • 参照笔者团队前期优化的酶解工艺制备EP[7],所得上清液依次通过截留分子量为10 kD和3 kD的超滤膜,分别得到MW>10 kD、MW=3~10 kD和MW<3 kD等3个组分,依次命名为EP-Ⅰ、EP-Ⅱ和EP-Ⅲ,随后蒸发浓缩、冻干成粉,–40 ℃贮存备用。

    • 蛋白质含量参照GB 5009.5—2016的凯氏定氮法测定;小分子肽 (相对分子质量低于1 000 u的低聚肽)得率参照胡滨等[14]方法测定;氨基酸组成参照GB 5009.124—2016测定。

    • 体外ADH激活率参照刘鹏[15]方法测定;体外抗氧化活性ABTS [2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]自由基清除率、DPPH (2,2-联苯基-1-苦基肼基)自由基清除率和还原力参照Cai等[16]方法测定。

    • 1) 动物分组与建模。参照《保健食品检验与评价技术规范 (2003版)》中对“对化学性肝损伤有辅助保护作用检验方法”的要求进行试验。将60只小鼠适应性喂养7 d后,随机分成空白对照组、酒精模型组、阳性对照组、EP干预组 (EP-Ⅰ、EP-Ⅱ和EP-Ⅲ)。其中阳性对照组和EP各干预组按小鼠体质量10 mL·kg−1剂量依次灌胃150 mg·kg−1海王金樽、EP-Ⅰ、EP-Ⅱ和EP-Ⅲ,空白对照组和酒精模型组则给予等体积的生理盐水;30 min后各组按小鼠体质量12 mL·kg−1剂量一次性灌胃56°红星二锅头,空白对照组则给予等体积的生理盐水[7]。按此操作连续灌胃7 d。每天灌胃前,记录小鼠体质量,观察小鼠的神色和形态。

      第7天末次灌胃结束后禁食不禁水16 h,对各组小鼠进行眼球摘除取血,随后立即脱颈处死,低温解剖,取出肝脏,对肝脏进行称重并按下式计算肝脏指数。

      $ {\text{肝脏指数}} = \frac{{{\text{肝脏质量}}({\rm g})}}{{{\text{小鼠最终体质量}}({\rm g})}} \times 100{\text{%}} $

      2)血清生化指标测定。全血静置12 h后,2 000 r·min−1、4 ℃离心5 min取上清液,按照试剂盒说明书测定血清中ALT和AST活力。

      3)肝脏生化指标测定。准确称取100 mg肝组织,加入一定体积的预冷生理盐水,在冰浴条件下匀浆制成10%肝组织匀浆,3 000 r·min−1、4 ℃离心10 min取上清液,按照试剂盒说明书测定肝组织匀浆的蛋白浓度、ADH、ALDH、SOD、GSH、MDA和TG。

    • 试验结果均以“平均值±标准差 ($\overline { X}{ \pm {{\rm SD}}} $)”表示,所有数据采用SPSS 23.0软件进行统计学分析,采用GraphPad Prism 5.0软件进行作图,单因素方差分析 (One-Way ANOVA)判断组间差异。所有分析中,P<0.05表示组间差异显著,P<0.01表示组间差异极显著。

    • EP的蛋白质质量分数为616.65 g·kg−1,其中73.38%为小分子肽 (表1)。与EP相比,超滤组分EP-Ⅰ和EP-Ⅱ中的小分子肽占比分别减少了57.30%和45.25%,EP-Ⅲ则增加了14.84% (P<0.01)。说明超滤对EP中不同分子量大小的肽段实施了有效分离,其中小分子肽主要集中于分子量<3 kD的EP-Ⅲ中 (达80%以上)。

      组别
      Group
      蛋白质质量分数
      Protein mass fraction/(g·kg−1)
      小分子肽质量分数
      Small molecular peptide mass fraction/(g·kg−1)
      小分子肽占比
      Proportion of small molecular peptides/%
      马氏珠母贝肉酶解产物组 EP group 616.65±50.15 451.14±15.39 73.38±4.11
      EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 575.67±36.22 91.91±17.89** 16.08±3.75**
      EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 554.42±39.59 155.33±26.00** 28.13±5.09**
      EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 490.29±24.35* 431.74±16.74 88.22±5.90**
      注:与马氏珠母贝肉酶解产物组相比,*. P<0.05,**. P<0.01;表2同此 Note: Compared with the enzymatic hydrolysate of P. martensii; *. P < 0.05; **. P < 0.01. The same case in Table 2.

      表 1  马氏珠母贝肉酶解产物及其超滤组分中蛋白质和小分子肽含量

      Table 1.  Content of protein and small molecule peptide in EP and its ultrafiltration components $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    • EP的氨基酸组成全面,其必需氨基酸含量为164.60 g·kg−1,占氨基酸总量的39.85%,符合FAO/WHO推荐标准中优质蛋白质源的氨基酸模式 (表2)。EP中的疏水性氨基酸含量也较高 (178.70 g·kg−1),占总量的43.27%,特别是谷氨酸 (Glu)和天冬氨酸 (Asp),分别占总量的13.37%和11.89%,其次是赖氨酸 (Lys, 9.09%)、甘氨酸 (Gly, 8.55%)、亮氨酸 (Leu, 7.53%%)、丙氨酸(Ala, 7.25%)和精氨酸(Arg, 6.78%)。肽的生物活性与其氨基酸组成紧密相关[17],Leu、Ala、脯氨酸(Pro)、Arg等氨基酸已被证实能够在机体的三羧酸循环中产生稳定的NAD+,有利于促进乙醛的分解,对乙醇在肝脏中的代谢有重要促进作用[18]

      氨基酸种类
      Amino acid species
      马氏珠母贝肉酶解产物
      EP group
      EP-Ⅰ组
      EP-Ⅰ group
      EP-Ⅱ组
      EP-Ⅱ group
      EP-Ⅲ组
      EP-Ⅲ group
      天冬氨酸 Asp 49.10±0.35 31.80±0.41** 35.10±0.61** 46.10±0.61**
      苏氨酸 Thr* 22.30±0.65 13.50±0.74** 21.10±0.45 19.10±0.66**
      丝氨酸 Ser 18.10±0.28 11.20±0.31** 11.80±0.74** 10.40±0.54**
      谷氨酸 Glu 55.20±0.71 58.90±0.11** 58.70±0.40** 72.20±0.34**
      脯氨酸 Pro# 20.10±0.55 17.30±0.58 ** 17.90±0.27** 14.10±0.17**
      甘氨酸 Gly# 35.30±0.82 29.00±0.34** 32.10±0.45** 36.00±0.45
      丙氨酸 Ala# 30.00±0.41 26.20±0.62** 31.00±0.69 31.40±0.92
      胱氨酸 Cys 0.70±0.04 0.50±0.07 0.60±0.16 1.50±0.10**
      缬氨酸 Val*# 24.60±0.92 21.20±0.69* 25.20±0.24 24.70±0.75
      蛋氨酸 Met* 11.60±0.54 12.80±0.20** 10.10±0.44** 10.00±0.45**
      异亮氨酸 Ile*# 20.60±0.61 21.80±0.65 21.80±0.25 21.50±0.83
      亮氨酸 Leu*# 31.10±0.44 28.50±0.74** 33.40±0.54** 36.50±0.38**
      酪氨酸 Tyr 5.10±0.17 6.90±0.13** 9.10±0.18** 7.80±0.21**
      苯丙氨酸 Phe*# 17.00±0.96 14.60±0.51** 18.90±0.17** 19.70±0.66**
      赖氨酸 Lys* 37.40±0.83 23.20±0.45** 26.00±0.98** 32.60±0.88**
      组氨酸 His 6.80±0.59 8.30±0.27* 8.90±0.25* 7.70±0.20
      精氨酸 Arg 28.00±0.59 13.60±0.54** 20.10±0.88** 15.20±0.34**
      氨基酸总和 Total amino acid, TAA 413.00±4.53 339.30±3.51 381.80±3.82 406.50±1.80
      必需氨基酸 Essential amino acid, EAA 164.60±2.86 135.60±1.17 156.50±1.68 164.10±0.78
      疏水性氨基酸 Hydrophobic amino acid, HAA 178.70±1.51 158.60±1.73 180.30±1.23 183.90±1.74
      注:*. 必需氨基酸;#. 疏水性氨基酸 Note: *. Essential amino acid; #. Hydrophobic amino acid

      表 2  马氏珠母贝肉酶解产物及其超滤组分的氨基酸组成

      Table 2.  Amino acid composition of EP and its ultrafiltration components g·kg−1

      经超滤,EP-Ⅰ中的Asp和Arg比EP中分别减少了35.23%和51.43%,EP-Ⅲ中的Glu和Leu分别比EP中的含量增加了30.79%和17.36%。而EP-Ⅲ的Glu、Ala、胱氨酸 (Cys)、Leu和酪氨酸 (Tyr)等氨基酸含量比EP-Ⅰ和EP-Ⅱ更高 (表2)。Cai等[16]研究表明,Glu和Asp等酸性氨基酸在自由基链式反应中能够清除过量的自由基起到一定的抗氧化作用。此外,蛋白质经酶解后得到的小分子活性肽,其疏水性氨基酸的增加可以增强肽与脂质标靶之间的相互作用,或与疏水性缔合物结合直接作用于靶器官,均有利于增强肽的抗氧化能力[17, 19-20]

    • ADH是乙醇在肝脏氧化代谢过程中最主要的参与酶及代谢酶,能够提高肝脏中的ADH活力,加快乙醇的代谢分解,对肝脏的保护和ALD的防治具有重要意义[7]。与对照组相比,EP-Ⅰ、EP-Ⅱ和EP-Ⅲ均对体外ADH有明显的激活作用,其中分子量<3 kD的EP-Ⅲ对ADH的激活作用最强,激活率为35.35%,其次是分子量3~10 kD的EP-Ⅱ,激活率为32.19%,而分子量>10 kD的EP-Ⅰ最弱,激活率仅26.7% (图1)。说明EP对ADH的激活作用与其分子量大小有关,其激活作用随分子量的减少而增强。

      图  1  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分对体外乙醇脱氢酶活性的影响

      Figure 1.  Effect of EP ultrafiltration components on ADH activity in vitro

      研究表明,玉米肽的激活ADH和加快乙醇分解作用主要与其富含疏水性短肽或氨基酸有关,可通过提高血液中Ala和Leu浓度,产生稳定的辅酶NAD+促进反应的连续化进行,防止ADH的竞争性失活[18, 21];分子量为500~2 000 D黑豆多肽也被证明其ADH激活作用与Ala和Leu的高含量有关[22]。因此,推测EP-Ⅲ的体外ADH高激活率与其Ala、Leu和Glu等疏水性氨基酸含量高有一定关系。

    • 乙醇介导的氧化应激可诱使机体内氧自由基过剩而出现不可逆转的氧化损伤[19],因此EP的抗氧化能力也可以反映其对肝损伤的辅助保护作用。EP-Ⅲ对ABTS和DPPH自由基清除率分别为88.14%和86.34%,还原力为1.811,与维生素C (VC)组无显著性差异,比蒲月华等[23]报道的马氏珠母贝多肽自由基清除率分别提高了4.99%和15.25% (表3)。在相同浓度下,不同EP超滤组分表现出不同的抗氧化能力:EP-Ⅲ>EP-Ⅱ>EP-Ⅰ,说明EP的抗氧化能力受其分子量大小的影响,分子量越小其抗氧化能力越强[24]

      组别
      Group
      2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)
      二铵盐自由基清除率
      ABTS free radical scavenging activity/%
      2,2-联苯基-1-苦基肼基自由基清除率
      DPPH free radical scavenging activity/%
      还原力A700 nm
      Reducing power
      维生素C组 VC group 89.60±0.23 89.39±0.82 1.878±0.083
      EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 86.68±0.44** 84.54±1.47* 1.568±0.060**
      EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 87.46±0.18** 85.13±2.57* 1.811±0.050
      EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 88.14±0.25** 86.34±1.21 1.811±0.046
      注:与维生素C组相比,*. P < 0.05;**. P < 0.01 Note: Compared with VC group, *. P < 0.05; **. P < 0.01

      表 3  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分的体外抗氧化能力

      Table 3.  Antioxidant capacity of EP ultrafiltration components in vitro $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    • 各组小鼠的初次、末次灌胃体质量均无显著性差异 (P>0.05),表明灌胃EP对小鼠的生长发育和健康状况并没有不良影响 (表4)。与空白对照组相比,酒精模型组的肝脏指数显著升高 (P<0.01),此时小鼠肝脏受损,造模成功。与酒精模型组相比,阳性对照组、EP-Ⅱ组和EP-Ⅲ组中的肝脏指数均显著降低 (P<0.01),说明EP-Ⅱ、EP-Ⅲ均能够缓解小鼠肝脏受损情况,且分子量<3 kD的EP-Ⅲ效果优于阳性对照组。

      组别
      Group
      初次灌胃体质量
      Body mass of primary gastric perfusion/g
      末次灌胃体质量
      Body mass of last gastric perfusion/g
      肝脏指数
      Liver index/(mg·g−1)
      空白对照组 Blank control group 23.63±1.05 25.31±0.71 3.55±0.21##
      酒精模型组 Alcohol model group 24.37±0.83 26.35±0.87 4.40±0.26**
      阳性对照组 Positive control group 23.35±1.40 25.40±1.29 3.97±0.37*#
      EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 24.75±0.97 26.23±0.80 4.20±0.38**
      EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 24.31±0.73 26.47±1.44 3.90±0.32##
      EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 23.75±0.76 26.57±1.59 3.78±0.15##
      注:与空白对照组相比,*. P<0.05,**. P<0.01;与酒精模型组相比,#. P<0.05,##. P<0.01;图2图3表5同此 Note: Compared with blank control group, *. P<0.05, **. P< 0.01; compared with alcohol model group, #. P < 0.05, ##. P<0.01. The same case in Figure 23 and Table 5.

      表 4  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分对酒精性肝损伤小鼠体质量及其肝脏指数的影响

      Table 4.  Effects of EP ultrafiltration components on body mass and liver index of ALD mice $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    • ALT和AST是临床上检验肝损伤的重要指标[25]。与空白对照组相比,酒精模型组中ALT和AST活力均显著升高 (P<0.01),说明小鼠肝细胞受损严重,细胞膜通透性增加,肝细胞中ALT和AST逸出渗入血液,这2种酶活力的升高提示造模成功 (图2)[16]。与酒精模型组相比,EP-Ⅱ和EP-Ⅲ组中ALT和AST活力均显著降低 (P<0.05,P<0.01),且以分子量<3 kD的EP-Ⅲ效果最为显著,分别减少了36.48%和56.98%,与空白对照组无显著差异 (P>0.05)。说明小分子量超滤组分对肝细胞膜的通透性及完整性有较好的修复作用[26]

      图  2  马氏珠母贝肉酶解产物对酒精性肝损伤小鼠血清中谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响

      Figure 2.  Effect of EP on ALT and AST in serum of ALD mice

    • 乙醇介导的氧化应激可造成机体内SOD和GSH的耗竭,致使肝细胞线粒体中的脂肪酸-β氧化发生障碍,细胞膜进一步发生脂质过氧化反应,此过程伴随产生大量的MDA[27]。与空白对照组相比,酒精模型组中小鼠肝脏的SOD活力和GSH水平显著减少、MDA和TG水平显著增加,说明小鼠的肝脏受损严重,抗氧化能力下降,脂质过氧化产物增加,即造模成功 (表5)。与酒精模型组相比,EP-Ⅱ、EP-Ⅲ组均有显著改善 (P<0.01),尤以EP-Ⅲ组的效果最为显著。说明EP超滤组分均能够在一定程度上提高小鼠肝脏中SOD活力、促进GSH的合成,同时调节肝脏中的脂质代谢,减少MDA的产生和脂肪堆积[14, 28]

      组别
      Group
      超氧化物歧化酶活力
      SOD activity/(U·mg−1)
      谷胱甘肽
      GSH/(nmol·mL−1)
      丙二醛
      MDA/(nmol·mg−1)
      甘油三酯
      TG/(nmol·mL−1)
      空白对照组 Blank control group 15.88±0.45## 2.64±0.27## 1.10±0.28## 0.02±0.01##
      酒精模型组 Alcohol model group 14.75±0.40** 1.58±0.13** 1.90±0.60** 0.07±0.02**
      阳性对照组 Positive control group 15.24±0.38 1.92±0.28** 1.19±0.24## 0.02±0.02##
      EP-Ⅰ组 EP-Ⅰ group 15.13±0.28** 2.07±0.29**## 1.44±0.28## 0.05±0.03**
      EP-Ⅱ组 EP-Ⅱ group 15.20±0.61** 2.14±0.38**## 1.22±0.35## 0.03±0.03##
      EP-Ⅲ组 EP-Ⅲ group 15.58±0.61## 2.25±0.45## 1.04±0.17## 0.03±0.01##

      表 5  马氏珠母贝肉酶解产物超滤组分对酒精性肝损伤小鼠肝脏中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、丙二醛和甘油三酯的影响

      Table 5.  Effects of EP ultrafiltration components on SOD, GSH, MDA and TG in liver of ALD mice $\overline { X}{\bf \pm {{SD}}} $

    • 乙醇在肝脏中的氧化代谢主要通过肝脏中ADH系统、细胞色素P450系统 (主要为CYP2E1)、过氧化氢酶 (CAT)系统等三大酶系催化完成,尤以ADH系统最为主要[29-30]。与空白对照组相比,酒精模型组中ADH和ALDH活力略有下降。与酒精模型组相比,EP-Ⅰ组中ADH和ALDH活力无显著性变化 (P>0.05),但EP-Ⅱ组中ADH活力显著升高 (P>0.01),ALDH活力则无显著性变化 (P>0.05),而阳性对照组和EP-Ⅲ组中ADH和ALDH活力均极显著升高 (P>0.01,图3)。乙醇的过量摄入在一定程度上会抑制ADH和ALDH活力[31]。乙醇进入机体后,在ADH和ALDH的催化作用下分别生成乙醛和乙酸,再经过三羧酸循环最终生成水和二氧化碳,当机体内的细胞防御体系不能及时清除乙醛时,其残留的乙醛会导致肝细胞发生损伤或炎症反应、细胞外基质产生和纤维化的形成[32]图3结果说明分子量<3 kD的EP-Ⅲ能够显著激活小鼠肝脏中ADH和ALDH的活力、加快乙醇的代谢分解以减缓肝脏损伤程度。

      图  3  马氏珠母贝肉酶解产物对酒精性肝损伤小鼠肝脏中乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶的影响

      Figure 3.  Effects of EP on ALT and ALDH in serum of ALD mice

    • 本研究较系统地比较了3类不同分子量大小的EP超滤组分在蛋白质、小分子肽和氨基酸组成上存在的差异,并通过体外试验和体内试验进一步研究了其体外抗ALD活性及其对小鼠ALD的保护作用。结果表明,EP-Ⅲ (MW<3 kD)具有显著的抗ALD活性,推测其能够通过抗氧化、清除自由基、激活乙醇代谢酶等多种机制的协同作用,加快机体内乙醇的分解代谢、减轻乙醇对机体造成的氧化损伤,从而对ALD进行干预并起到一定的辅助保护作用。此外,本研究明确了EP中主要的抗ALD活性功能肽段为分子量小于3 kD的组分,为辅助护肝功能营养食品的开发以及护肝活性肽的进一步分离鉴定提供了依据。

参考文献 (32)

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