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基于InDel标记的斑节对虾早期性别鉴定方法的建立

黄智康 江世贵 周发林 黄建华 杨其彬 姜松 李运东 杨丽诗

引用本文:
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基于InDel标记的斑节对虾早期性别鉴定方法的建立

    作者简介: 黄智康 (1993—),男,硕士研究生,研究方向为水产动物遗传育种与繁育。E-mail: hzhzk1993@163.com;
    通讯作者: 杨丽诗, yangls2016@163.com
  • 中图分类号: S 917.4

Establishment of a sex identification method for black tiger shrimp (Penaeus monodon) in embryonic and early postembryonic development based on an InDel molecular marker

    Corresponding author: Lishi YANG, yangls2016@163.com
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 为分辨斑节对虾 (Penaeus monodon) 发育早期的性别,利用改良的插入/缺失 (InDel) 标记追踪了从受精卵、无节幼体、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d (PL1)、仔虾后30 d (PL30)及亚成虾个体的性别,建立了测序和荧光定量PCR熔解曲线的检测方法。结果表明,InDel标记可扩增获得雌雄特异性序列,用测序法判定亚成虾性别的结果与外部观察结果一致,准确率达100%,对受精卵、无节幼体、溞状幼体及糠虾幼体均可得到雌雄特异性序列;进而建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 熔解曲线的快速鉴定斑节对虾性别的方法,其中雄性特异序列的熔解温度 (Melting temperature, Tm)为 (79.10±0.10) ℃,雌性为 (78.45±0.20) ℃,通过特异的熔解曲线可准确区分PL30、亚成虾和无节幼体Ⅵ期个体,准确率可达96.3%以上。
  • 图 1  斑节对虾性别特异基因组序列

    Figure 1.  Sex-specific genome sequence of P. monodon

    图 2  斑节对虾亚成虾雌雄个体测序结果

    Figure 2.  Sequencing results of female and male P. monodon subadult

    图 3  斑节对虾雌、雄亚成虾实时荧光定量熔解曲线及熔解峰

    Figure 3.  Melting curve and melting peak of quantitative real-time PCR of female and male P. monodon subadults

    表 1  InDel标记引物

    Table 1.  Primers of InDel marker

    引物
    Primer
    序列 (5'–3')
    Sequence
    Sex-InDel-F TAAAGATCCTATTTTCAAATGC
    Sex-InDel-R CGAGGGAATGTCACTTTG
    下载: 导出CSV

    表 2  斑节对虾性别鉴定方法的比较

    Table 2.  Comparison of different methods for sex identification of P. monodon %

    鉴定方法
    Identification method
    受精卵
    Zygote
    无节幼体Ⅰ−Ⅴ期
    Nauplii I−V
    无节幼
    体Ⅵ期
    Nauplii
    VI
    溞状
    幼体
    Zoea
    larvae
    糠虾
    幼体
    Mysis
    larvae
    仔虾后
    1 d
    PL1
    仔虾后
    30 d
    PL30
    雌性亚
    成虾
    Female subadult
    雄性亚
    成虾
    Male subadult
    外部观察
    External observation
    吻合率 100 100
    InDel标记测序法
    InDel marker sequencing
    成功率 100 100 100 100 100 100 100 100 100
    InDel标记实时荧光定量熔解曲线分析
    Melting curve of InDel marker by quantitative real-time PCR
    扩增
    成功率
    0 86 100 90 80 90 100 96.7 90
    吻合率 0 63 100 89 63 56 100 96.6 96.3
    注:−. 不能鉴别个体性别 Note: −. The sex can not be identified.
    下载: 导出CSV
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-11-02
  • 录用日期:  2020-02-11
  • 网络出版日期:  2020-09-28
  • 刊出日期:  2020-06-05

基于InDel标记的斑节对虾早期性别鉴定方法的建立

    作者简介:黄智康 (1993—),男,硕士研究生,研究方向为水产动物遗传育种与繁育。E-mail: hzhzk1993@163.com
    通讯作者: 杨丽诗, yangls2016@163.com
  • 1. 上海海洋大学水产与生命学院,上海 201306
  • 2. 中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部南海渔业资源开发利用重点实验室,广东 广州 510300
  • 3. 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地,广东 深圳 518121

摘要: 为分辨斑节对虾 (Penaeus monodon) 发育早期的性别,利用改良的插入/缺失 (InDel) 标记追踪了从受精卵、无节幼体、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d (PL1)、仔虾后30 d (PL30)及亚成虾个体的性别,建立了测序和荧光定量PCR熔解曲线的检测方法。结果表明,InDel标记可扩增获得雌雄特异性序列,用测序法判定亚成虾性别的结果与外部观察结果一致,准确率达100%,对受精卵、无节幼体、溞状幼体及糠虾幼体均可得到雌雄特异性序列;进而建立了基于SYBR Green实时荧光定量PCR (Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR) 熔解曲线的快速鉴定斑节对虾性别的方法,其中雄性特异序列的熔解温度 (Melting temperature, Tm)为 (79.10±0.10) ℃,雌性为 (78.45±0.20) ℃,通过特异的熔解曲线可准确区分PL30、亚成虾和无节幼体Ⅵ期个体,准确率可达96.3%以上。

English Abstract

  • 斑节对虾 (Penaeus monodon) 是我国南部重要的养殖对虾品种,其中相同日龄的雌虾个体生长速度显著大于雄虾[1]。黄建华等[2]统计了46~255日龄斑节对虾的生长数据,结果显示池塘养殖斑节对虾6个月后,雌虾体质量约为雄虾的1.5倍。由此推测,在斑节对虾养殖中,选育雌虾可以提高养殖效益。

    目前生产上判别斑节对虾性别的方法为外部形态观察法[3-4],但幼苗的雌雄判别至今未见报道。虽然其他虾类已有幼体的雌雄判别报道[5-8],但通过外部观察的方法难以准确、快速地鉴别发育早期的个体性别。近年来随着分子生物学的发展,AFLP (Amplified fragment length polymorphism)[9-13]、SCAR (Sequence-characterized amplified region)[14]、EST (Expressed sequence tags)[15]、SSR (Simple sequence repeats)[16]、SNP (Single nucleotide polymorphism)[17-18]等分子标记技术已应用于甲壳动物个体性别快速鉴定。斑节对虾的雌雄特异标记亦有部分报道[15, 19-22],但缺乏快速检测手段的相关报道。

    为此,本研究采集了同一来源不同阶段的斑节对虾,利用优化的InDel标记检测了成体、仔虾、幼体和受精卵的性别,以期建立根据雌雄特异的熔解曲线快速鉴别雌雄的SYBR Green荧光定量PCR的新方法,探索分子标记在甲壳动物性别判定中的应用,为斑节对虾基因组研究中性别相关染色体 (区域) 的解析,以及生产上的雌虾选育策略奠定基础。

    • 同一来源的斑节对虾幼体来自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地,饲养在500 L的玻璃纤维桶中,加入300 L海水。根据幼体的发育阶段,水温从30 ℃逐渐升至33 ℃,采用自然光照,每天投料4次,培育至仔虾后30 d (PL30),幼体变态为仔虾后视水质情况不定时吸污。根据江世贵等[23]和吴勉之等[24]的方法确定斑节对虾幼体发育时期。从受精卵开始,在显微镜下观察确认幼体的发育时期,取受精卵、无节幼体Ⅰ—Ⅵ期、溞状幼体、糠虾幼体、仔虾后1 d (PL1)、PL30保存于75%乙醇溶液,用于提取组织DNA。另取肉眼可鉴别雌、雄的亚成虾各30尾 (体长约8 cm) 保存于无水乙醇中,用于验证分子标记方法的准确性。

    • 上述样品取完整个体或1~2 mg肌肉,根据微量DNA提取试剂盒 (Magen,广州) 提取DNA,用NanoDrop 2000c (Thermo Fisher) 检测DNA浓度和纯度,1.5%琼脂糖凝胶电泳拍照观察,−20 ℃保存备用,后期用于扩增斑节对虾性别特异DNA片段。

    • 在前人研究基础上[20],设计InDel标记引物 (表1),由北京睿博兴科生物技术有限公司广州合成部合成。扩增片段大小为雌性特异序列115 bp、雄性特异序列108 bp。

      引物
      Primer
      序列 (5'–3')
      Sequence
      Sex-InDel-F TAAAGATCCTATTTTCAAATGC
      Sex-InDel-R CGAGGGAATGTCACTTTG

      表 1  InDel标记引物

      Table 1.  Primers of InDel marker

    • 根据2×Master Mix (南京诺唯赞生物科技有限公司) 的说明书操作,反应体系为2×Master Mix 25.0 μL,Forward Primer 2.0 μL,Reverse Primer 2.0 μL,DNA模板 2.0 μL,ddH2O 19.0 μL,共计50.0 μL;反应程序为:95 ℃预变性3 min;95 ℃变性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸5 s,35个循环;72 ℃延伸5 min,4 ℃保存。PCR产物送到北京睿博兴科生物技术有限公司广州测序部测序,测序结果用Sequencher软件分组查看。测序法成功率计算公式为:

      $ \begin{array}{c} {\text{成功率}} = {\text{得到性别特异序列的样品总数}}/\\{\text{测序样品总数}} \times 100 {\text{%}}\end{array} $

    • 根据TB GreenTM Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus,TaKaRa,日本) 的说明书,配制反应体系:TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus) (2×Conc.) 6.25 μL,Forward Primer 0.5 μL,Reverse Primer 0.5 μL,DNA模板1.0 μL,ddH2O 4.25 μL,共计12.5 μL。使用Light Cycler® 480II (Roche) 荧光定量仪运行PCR和熔解曲线分析程序。PCR反应程序 (两步法):95 ℃预变性30 s;95 ℃变性10 s,60 ℃延伸30 s,40个循环。熔解曲线分析程序为:95 ℃保持5 s,60 ℃保持1 min,升温至95 ℃,变温速率0.1 ℃∙s−1。对上述已知性别的亚成虾和未知性别的受精卵、幼体和仔虾进行熔解曲线分析,每个样品设置3个复孔。熔解温度 (Melting temperature, Tm) 可在Light Cycler® 480 II (Roche) 荧光定量仪查看。熔解曲线分析法扩增成功率和吻合率计算公式为:

      $ \begin{array}{c} {\text{扩增成功率}} = 3{\text{个复孔}}{\rm{Tm}}{\text{值相同的样品个数}}/\\{\text{荧光定量检测样品总数}} \times 100 {\text{%}}\\ {\text{吻合率}} = {\rm{Tm}}{\text{值与性别特异序列一致的样品个数}}/\\3{\text{个复孔}}{\rm{Tm}}{\text{值相同的样品个数}} \times 100 {\text{%}} \end{array} $

    • 利用InDel标记扩增获得的性别特异序列见图1图2。其中雌虾序列在48 bp、63 bp处有2个特异性碱基,在54—59 bp处有6 bp的插入片段,而雄虾序列在此处存在6 bp的缺失。

      图  1  斑节对虾性别特异基因组序列

      Figure 1.  Sex-specific genome sequence of P. monodon

      图  2  斑节对虾亚成虾雌雄个体测序结果

      Figure 2.  Sequencing results of female and male P. monodon subadult

    • 构建适宜的Light Cycler® 480 II熔解曲线分析高效检测体系,利用InDel标记扩增特异产物,通过熔解曲线分析可以得到斑节对虾雌雄特异性熔解曲线 (图3)。雌虾扩增产物熔解曲线在77.5 ℃时斜率开始显著增大,在78.45 ℃达到最大,在79 ℃显著减小,Tm值介于 (78.45±0.20) ℃;雄虾扩增产物熔解曲线在78.5 ℃时斜率开始显著增大,在79.10 ℃达到最大,在80 ℃处显著减小,Tm值介于(79.10±0.10) ℃。雌虾和雄虾的熔解曲线可明显区分为两股。

      图  3  斑节对虾雌、雄亚成虾实时荧光定量熔解曲线及熔解峰

      Figure 3.  Melting curve and melting peak of quantitative real-time PCR of female and male P. monodon subadults

    • 利用开发的InDel性别标记对雌、雄各30尾亚成虾个体进行测序法鉴定,在Sequencher软件中雌雄个体对应的测序结果可根据序列差异自动分为两组,雌雄亚成虾鉴定正确率均为100%。在受精卵时期即可检测到该标记,所有样品均可通过对该标记的扩增获得雌雄特异的测序结果。

      利用开发的InDel性别标记对雌、雄各30尾亚成虾个体进行SYBR Green熔解曲线快速鉴定。1尾雌虾和3尾雄虾未得到扩增产物,雌、雄扩增成功率分别为96.7%和90% (表2);26尾雄性个体和28尾雌性个体得到性别特异的熔解曲线,雌、雄各1尾个体的熔解曲线Tm值不在对应性别的Tm值范围内,雌、雄吻合率分别为96.6%和96.3% (表2);在检测的受精卵和各期幼体中,受精卵检测失败,产物Tm值与目的产物的相差较大,不能区分雌雄;无节幼体Ⅵ及PL30期共20个个体均得到性别特异的熔解曲线,吻合率达100%;其他时期的吻合率较低,除了溞状幼体吻合率达89%,无节幼体Ⅰ—Ⅴ期、糠虾幼体和PL1期吻合率仅为63%、56%和63% (表2)。

      鉴定方法
      Identification method
      受精卵
      Zygote
      无节幼体Ⅰ−Ⅴ期
      Nauplii I−V
      无节幼
      体Ⅵ期
      Nauplii
      VI
      溞状
      幼体
      Zoea
      larvae
      糠虾
      幼体
      Mysis
      larvae
      仔虾后
      1 d
      PL1
      仔虾后
      30 d
      PL30
      雌性亚
      成虾
      Female subadult
      雄性亚
      成虾
      Male subadult
      外部观察
      External observation
      吻合率 100 100
      InDel标记测序法
      InDel marker sequencing
      成功率 100 100 100 100 100 100 100 100 100
      InDel标记实时荧光定量熔解曲线分析
      Melting curve of InDel marker by quantitative real-time PCR
      扩增
      成功率
      0 86 100 90 80 90 100 96.7 90
      吻合率 0 63 100 89 63 56 100 96.6 96.3
      注:−. 不能鉴别个体性别 Note: −. The sex can not be identified.

      表 2  斑节对虾性别鉴定方法的比较

      Table 2.  Comparison of different methods for sex identification of P. monodon %

    • 在十足目动物中,成熟的雌雄个体间外部形态差异明显[25],但早期发育个体的差异往往难以通过肉眼观察。黄建华等[3]报道,头胸甲长达1.8~3.0 cm的斑节对虾可通过观察头胸甲腹面第五步足基部是否形成纳精囊判别雌雄;李富花和相建海[5]发现中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)在PL35时可利用电镜观察到雌雄幼苗存在第五步足基部锥形突起的形态差异;冯政夫等[6]在显微镜下观察到中国明对虾在仔虾后16 d (PL16) 时雌虾后锥体开始下陷并逐步发育为纳精囊。本研究前期工作利用解剖镜和电镜观察到斑节对虾幼体在第五步足基部的后锥体存在形态差异,但后续利用分子标记法进行鉴定时无法对应,故认为早于PL30期用解剖镜分辨雌雄的方法不可行,需要采用更为准确快速的分子鉴别方法。

      目前分子鉴别中应用较多的标记有SSR[26-28]、SNP[29-30]、InDel[31-32]等。针对斑节对虾的性别分子标记已有报道[15, 19-22],但有关InDel标记的报道较少。Robinson等[19]检测到fem-1 (Feminization-1) 基因上的3个性别特异的SNP位点,但不同群体中同一位点的雌雄比例有差异,因此不能用于一般群体;Staelens等[20]通过建立斑节对虾高密度遗传连锁图谱获得多个性别相关的AFLP标记,但试验操作较为繁琐;本研究在此基础上开发了InDel分子标记,基于雌性个体具有2个特异性碱基和6 bp的插入片段,而雄性缺失6 bp的基因组序列这一特征,设计引物进行高效扩增,获得较为理想的结果。InDel标记虽然密度低于SNP标记,但远高于SSR标记。据估计,人类的1 000万个多态性分子标记位点中,至少有150万个是InDel[33];水稻基因组中每953 bp就有1个InDel标记[34]。由于InDel标记在基因组相同位置出现相同大小标记的几率非常小,与其他标记相比,能避免由于基因组复杂性及异质性带来的分析不准确性,因此具有良好的开发前景。

      目前对InDel的检测方法有杂交、PCR、分子构象、酶法等,并通过电泳、荧光、芯片、质谱分析等技术进行信号采集。对于单个InDel位点,电泳法和荧光PCR法较为常用。SYBR Green I染料是能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的双链DNA染料,与Taqman探针和饱和染料相比,具有价格低廉、重复性好的优点。SYBR Green I的实时荧光定量PCR检测方法在水产领域已有一定应用[35-36]。本研究前期共设计了9对扩增引物,每对引物均根据其最佳退火温度设置了高、中、低3个温度梯度,在综合考虑了测序和荧光定量结果后选择了该引物。此外,也尝试利用饱和染料进行HRM (High-resolution melting) 分析,但其扩增效果欠佳,而使用SYBR Green I染料能得到良好的扩增效果,故采用后者进行InDel标记的高通量检测。实践证明,本研究选择的InDel标记可以通过SYBR Green I实时荧光定量熔解曲线很好地区分,雌雄个体扩增产物在Tm值上的微小差别反映在熔解曲线上形成不同的熔解峰,其中雌性个体Tm值比雄性低0.65 ℃左右,在峰图上显示提前的熔解峰。在对斑节对虾亚成虾进行熔解曲线分析时,60个个体中有56个得到了可重复的结果,扩增成功率达到93.3%;这56个个体中有54个的判定结果与真实性别相同,吻合率达96.4% (图3),证明该方法的性别特异熔解曲线可以基本反映样品的真实性别。随后将该方法应用于不能通过外部观察分辨雌雄的早期个体 (表2),在无节幼体Ⅵ和PL30期获得100%的扩增成功率和吻合率,说明该方法适用于早期个体的检测。但该方法在受精卵时期的扩增成功率为0,每一个样品的3个复孔均未能得到相同的熔解曲线,原因可能是本文的DNA提取方法不足以提取单个受精卵的DNA,下一步可尝试改进DNA提取方法;对于其他时期,除了溞状幼体的吻合率达89%,其他时期共70个样品,有60个得到可重复的结果,其中37个符合性别特异曲线的特征,吻合率仅61.7%,这可能与DNA提取方法或荧光染料有关,下一步可改进DNA提取方法或优化饱和染料使用条件。此外,本试验所用PL30个体体长为 (1.11±0.09) cm,当个体达2 cm或更大时,即可通过提取游泳足DNA的方法检测个体性别,无需处死个体便可追踪个体的性别发育。本试验方法可对大量的样品进行高通量快速分析,且分析结束后的PCR产物仍可用测序方法验证雌雄,两种鉴别方法可相互印证,提高了检测的准确性。

      综上,本文用分子标记方法追踪了斑节对虾整个早期发育过程中的性别,利用优化的InDel分子标记通过测序法辨别雌雄亚成虾的成功率可达100%,且最早可在受精卵时期得到雌雄特异的测序结果;进一步建立了SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,为雌虾选育提供了分子鉴别的快速检测方法。结合笔者实验室建立的斑节对虾高密度遗传连锁图谱中存在的性别相关区域的结果[21],笔者认为斑节对虾存在性别相关染色体或区域。本研究为证实这一结果和后续的深入研究提供了数据参考。

参考文献 (36)

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