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副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析

魏文娟 赵姝 王元 周俊芳 李新苍 房文红

引用本文:
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副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析

    作者简介: 魏文娟(1994—),女,硕士研究生,从事水生细菌耐药研究。E-mail: wwj07067@126.com;
    通讯作者: 房文红, fwenhong@163.com
  • 中图分类号: S 948

Detection of antibiotics resistance and distribution of resistance genes in Vibrio parahaemolyticus from cultured shrimp

    Corresponding author: Wenhong FANG, fwenhong@163.com
  • CLC number: S 948

  • 摘要: 文章采用琼脂稀释法检测从养殖患病对虾中分离的36株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对16种药物的耐药性,并用PCR法检测喹诺酮类耐药基因qnrAqnrBqnrSqnrVC,酰胺醇类耐药基因catoptrAfloRcfr,四环霉素类耐药基因tetAtetBtetM,磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3,氨基糖苷类耐药基因strAstrBaadAaacA,利福霉素类耐药基因arr,β-内酰胺类耐药基因blaCARB和大环内酯类耐药基因erm的携带状况,分析其耐药表型和基因型之间的相关性。结果显示,36株副溶血弧菌对β-内酰胺类药物氨苄西林耐药率最高(88.9%),其次为磺胺类药物磺胺甲噁唑(66.7%),硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南呈现100%敏感。多重耐药副溶血弧菌比例高达61.1% (22/36),其中1株对6类抗菌药耐药。喹诺酮类耐药基因qnrVC检出率最高达72.2% (26/36);其次为氨基糖苷类耐药基因srtB,检出率58.3% (21/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到。耐药基因检出率与耐药表型没有表现出一一对应的关系,提示副溶血弧菌耐药的复杂性。
  • 图 1  多重耐药菌株统计

    Figure 1.  Strain distribution of multi-drug resistance

    表 1  抗菌药物稀释范围、质控菌株质控范围及药敏试验结果判定标准

    Table 1.  Dilution range of antibacterial drugs, quality control range of quality control strains and criteria for determination of drug susceptibility test results

    抗菌药物
    Antimicrobial
    稀释范围
    Dilution range/(μg·mL−1)
    MIC判定标准
    Judgment standard/(μg·mL−1)
    ATCC25922质控范围
    Quality control range/(μg·mL−1)
    SIR
    环丙沙星 Ciprofloxacin 0.12~64 ≤1 2 ≥4 0.004~0.015
    诺氟沙星 Norfloxacin 0.06~32 ≤4 8 ≥16 0.03~0.12
    恩诺沙星 Enrofloxacin 0.06~32 ≤0.5 1~2 ≥4 0.03~0.12
    氟苯尼考 Florfenicol 0.25~128 ≤2 4 ≥8 2~8
    氯霉素 Chloramphenicol 0.25~128 ≤8 16 ≥32 2~8
    土霉素 Oxytetracycline 0.12~64 ≤4 8 ≥16 0.5~4
    多西环素 Doxycycline 0.12~64 ≤4 8 ≥16 0.5~2
    磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole 5~2 560 ≤256 ≥512 4~32
    复方新诺明 Compound sulfamethoxazole 0.125/2.375~64/1 216 ≤2/38 ≥4/76 ≤0.5/9.5
    硫酸新霉素 Neomycin sulfate 0.06~32 ≤2 4 ≥8 0.5~4
    庆大霉素 Gentamicin 0.06~32 ≤4 8 ≥16 0.25~1
    红霉素 Ergomycin 0.5~512 ≤0.5 1~4 ≥8 2~8
    头孢曲松 Ceftriaxone 0.12~64 ≤1 2 ≥4 0.03~0.12
    氨苄西林 Ampicillin 0.25~128 ≤8 16 ≥32 2~8
    美罗培南 Meropenem 0.125~64 ≤4 8 ≥16 0.008~0.06
    利福平 Rifampin 1~512 ≤1 2 ≥4 4~16
    注:−. 缺少相应的参考数据 Note: −. Lack of corresponding reference data
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    表 2  耐药基因引物序列

    Table 2.  Primers sequences of drug resistance genes

    基因名称
    Gene name
    引物序列 (5'–3')
    Primer sequence
    退火温度
    Annealing temperature/℃
    产物长度
    Length of product/bp
    参考文献
    Reference
    qnrVC136 TTCTCACATCAGGACTTGC
    GGAACAATGATTACCCCT
    55 615 [23]
    qnrVC457 ATAAAACAGACCAGTTATATGT
    ACTATTAAACVCTAATTGCTCTA
    55 630 [23]
    qnrA ATTTCTCACGCCAGGATTTG
    GATCGGCAAAGGTTAGGTCA
    55 516 [24]
    qnrB GATCGTGAAACGCAGAAAGG
    ACGATGCCTGGTAGTTGTCC
    50 469 [25]
    qnrS ACGACATTCGTCAACTGCAA
    TAAATTGGCACCCTGTAGGC
    52 417 [26]
    tetA TTTCGGGTTCGGGATGGT
    CAGGCAGAGCAAGTAGAGG
    55 696 [23]
    tetM GTGGACAAAGGTACAACGAG
    CGGTAAAGTTCGTCACACAC
    55 405 [23]
    tetB GTCGCGGCATCGGTCAT
    TTTTTCGCCCCATTTAGTG
    55 489 [23]
    Sul1 GTGACGGTGTTCGGCATTCT
    TCCGAGAAGGTGATTGCGCT
    63 779 [23]
    Sul2 GCGCAGGCGCGTAAGCTGAT
    CGAAGCGCAGCCGCAATTC
    65 793 [27]
    Sul3 GCAACAGTTGGTGCTAAACGAGA
    AGCAGATGTGATTGATTTGGGAG
    56 578 [23]
    strA TGGCAGGAGGAACAGGAGG
    AGGTCGATCAGACCCGTGC
    54 546 [27]
    strB ATCGTCAAGGGATTGAAACC
    GGATCGTAGAACATATTGGC
    52 509 [23]
    aadA GGAGAATGGCAGCGCAAT
    GTTACTGCGCTGTACCAAT
    55 269 [23]
    aacA CTTGGRTGACCTCGGGATC
    CGATGCTCTATGAGTGGCTAA
    54 344 [23]
    erm CCCGAAAAATACGCAAAATTTCAT
    CCCTGTTTACCCATTTATAAACG
    55 589 [23]
    cat ACAACAGCAACGGTACTAGC
    CAACTTTCACCGATGCCAC
    52 550 [28]
    optrA TTCTCACCCAGATATGCC
    CGGGATCCCGGCAAACT
    60 1395 [29]
    floR CTGCTGATGGCTCCTTTC
    GCCGTGGCGTAACAGAT
    57 650 [30]
    cfr GTGAAGCTCTAGCCAACCGTC
    GCAGCGTCAATATCAATCCC
    55 746 [31]
    blaCARB GCTGAGAGCTCATGAAAAAGTTA
    CGTAGGATCCTTAACTTTATTTGTAGTGC
    55 852 [32]
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    表 3  36株副溶血弧菌耐药状况

    Table 3.  Antibiotics resistance status of 36 strains of V. parahaemolyticus

    抗菌药物
    Antimicrobial
    耐药菌株数
    Number of resistant strains
    抗菌药物
    Antimicrobial
    耐药菌株数
    Number of resistant strains
    恩诺沙星 Enrofloxacin 2 (5.6%) 复方新诺明 Compound sulfamethoxazole 8 (22.2%)
    诺氟沙星 Norfloxacin 6 (16.7%) 硫酸新霉素 Neomycin sulfate 0 (0)
    环丙沙星 Ciprofloxacin 6 (16.7%) 庆大霉素 Gentamicin 0 (0)
    氟苯尼考 Florfenicol 4 (11.1%) 红霉素 Erythromycin 23 (63.9%)
    氯霉素 Chloramphenicol 2 (5.6%) 头孢曲松 Ceftriaxone 0 (0)
    土霉素 Oxytetracycline 17 (47.2%) 氨苄西林 Ampicillin 32 (88.9%)
    多西环素 Doxycycline 4 (11.1%) 美罗培南 Meropenem 0 (0)
    磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole 24 (66.7%) 利福平 Rifampin 9 (25%)
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    表 4  副溶血弧菌耐药基因携带率

    Table 4.  Drug resistance gene carrier rate of V. parahaemolyticus

    耐药基因
    Resistance gene
    检出率
    Detection rate/%
    耐药基因
    Resistance gene
    检出率
    Detection rate/%
    耐药基因
    Resistance gene
    检出率
    Detection rate/%
    qnrVC 72.2 cfr 22.2 strA 44.4
    qnrA 41.7 tetA 16.7 strB 58.3
    qnrB 0 terB 47.2 aadA 33.3
    qnrS 36.1 tetM 13.9 aacA 16.7
    cat 0 sul1 0 erm 0
    optrA 0 sul2 13.9 blaCARB 47.2
    floR 11.1 sul3 0 arr 0
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    表 5  36株副溶血弧菌耐药表型与其携带基因型关系

    Table 5.  Relationship between resistant phenotype of 36 V. parahaemolyticus strains and their carrying genotypes

    菌株
    Strain
    耐药谱型   
    Resistance profile   
    携带耐药基因  
    Resistance gene  
    301 NOR-CIP-SXT-CFR-MER-SMZ-E-AMP blaCARB
    302 NOR-CIP-SMZ-E-AMP qnrVC-blaCARB
    331 NOR-CIP-SMZ-E-AMP blaCARB
    333 SMZ-E-AMP blaCARB
    335 SMZ-E-AMP qnrVC-tetM-blaCARB
    337 OTC-SMZ-E-AMP qnrVC-blaCARB
    338 OTC-SMZ-E-AMP qnrVC-blaCARB
    340 OTC-DOX-SMZ-AMP-RA qnrVC-blaCARB
    361 ENR-NOR-CIP-SMZ-AMP qnrVC-aadA-blaCARB
    362 ENR-NOR-CIP-SMZ-E-AMP aadA-blaCARB
    365 NOR-CIP-OTC-SMZ-E-AMP blaCARB
    371 OTC-SMZ-SXT-E-AMP qnrVC-sul2-strA-strB-aadA-blaCARB
    372 OTC-SMZ-SXT-E-AMP qnrVC-sul2-strA-strB-aadA-blaCARB
    383 OTC-SMZ-SXT-E-AMP floR-sul2-strA-strB-blaCARB
    384 OTC-SMZ-SXT-E-AMP sul2-strA-strB-blaCARB
    388 FFC-OTC-DOX-SMZ-SXT-AMP-RA qnrVC-tetB-tetM-sul2-blaCARB
    389 SMZ-AMP aadA-aacA-blaCARB
    391 SMZ-E qnrS-strB
    392 SMZ-E-AMP qnrVC-tetB-strB
    393 OTC-SMZ-SXT-AMP qnrVC-tetB-tetM-strB
    394 OTC qnrVC-cfr-tetB-strA-strB
    395 AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetB-strB-aadA
    396 OTC-E-AMP-RA tetB-strA-strB
    397 AMP-RA qnrVC-qnrA-tetB-strA
    398 E-AMP qnrVC-qnrA-qnrS-tetA-strA
    399 E qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-strB-aadA-aacA
    400 E-AMP qnrA-qnrS-tetA-tetB-strA-strB-aadA-aacA
    401 E-AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aadA
    402 AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetB-strA-strB-aadA-aacA
    403 OTC-AMP qnrVCqnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aadA-aacA
    404 AMP-RA qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aadA
    405 AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aacA
    406 OTC-SMZ-SXT-E-AMP-RA qnrVC-qnrA-floR-tetB-strA
    407 FFC-C-OTC-DOX-SMZ-SXT-E-AMP-RA qnrVC-qnrA-qnrS-floR-tetB-tetM-strB
    408 FFC-OTC-SMZ-RA qnrVC-qnrA-qnrS-tetB-strA-strB
    409 FFC-C-OTC-DOX-SMZ-E-RA qnrVC-qnrA-qnrS-floR-tetB-tetM-strB
    注:ENR. 恩诺沙星;NOR. 诺氟沙星;CIP. 环丙沙星;FFC. 氟苯尼考;C. 氯霉素;OTC. 土霉素;DOX. 多西环素;SMZ. 磺胺甲噁唑;SXT. 复方新诺明;E. 红霉素;AMP. 氨苄西林;RA. 利福平 Note: ENR. Enrofloxacin;NOR. Norfloxacin;CIP. Ciprofloxacin;FFC. Florfenicol;C. Chloramphenicol;OTC. Oxytetracycline;DOX. Doxycycline;SMZ. Sulfamethoxazole;SXT. Compound Sulfoxime;E. Erythromycin;AMP. Ampicillin;RA. Rifampicin
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-08-22
  • 录用日期:  2019-11-22
  • 网络出版日期:  2019-12-03

副溶血弧菌养殖对虾分离株耐药性及耐药基因分析

    作者简介:魏文娟(1994—),女,硕士研究生,从事水生细菌耐药研究。E-mail: wwj07067@126.com
    通讯作者: 房文红, fwenhong@163.com
  • 1. 上海海洋大学/水产科学国家级实验教学示范中心/国家水生动物病原库,上海 201306
  • 2. 中国水产科学研究院东海水产研究所/农业农村部东海渔业资源开发利用重点实验室,上海 200090

摘要: 文章采用琼脂稀释法检测从养殖患病对虾中分离的36株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)对16种药物的耐药性,并用PCR法检测喹诺酮类耐药基因qnrAqnrBqnrSqnrVC,酰胺醇类耐药基因catoptrAfloRcfr,四环霉素类耐药基因tetAtetBtetM,磺胺类耐药基因sul1、sul2和sul3,氨基糖苷类耐药基因strAstrBaadAaacA,利福霉素类耐药基因arr,β-内酰胺类耐药基因blaCARB和大环内酯类耐药基因erm的携带状况,分析其耐药表型和基因型之间的相关性。结果显示,36株副溶血弧菌对β-内酰胺类药物氨苄西林耐药率最高(88.9%),其次为磺胺类药物磺胺甲噁唑(66.7%),硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南呈现100%敏感。多重耐药副溶血弧菌比例高达61.1% (22/36),其中1株对6类抗菌药耐药。喹诺酮类耐药基因qnrVC检出率最高达72.2% (26/36);其次为氨基糖苷类耐药基因srtB,检出率58.3% (21/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到。耐药基因检出率与耐药表型没有表现出一一对应的关系,提示副溶血弧菌耐药的复杂性。

English Abstract

  • 副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) 是一种革兰阴性菌,具有嗜盐性,常存在于河海交汇处、沿海地区及海底和海产品中[1-2]。副溶血性弧菌作为一种重要的人、畜、渔共患病原菌,已成为全世界重要的公共卫生问题,既能引起食源性中毒和急性腹泻[3],同时也是海水养殖重要的条件致病菌,给水产养殖业造成重大经济损失[4]。为了预防及治疗弧菌病,一些抗生素被应用于水产养殖此类疾病的防治,但滥用抗菌药物导致副溶血弧菌产生耐药性,不仅增大了海水养殖中弧菌病的防控难度,而且给水产动物源食品的质量安全和生态安全带来隐患[5-6]。抗菌药的长期使用导致耐药菌大量出现的同时,也加速了多重耐药 (Multi-drug resistance,MDR) 细菌的产生,及其耐药基因的扩散和通过接合性转移在细菌间传播的风险[7]。对副溶血弧菌耐药性研究的报道主要集中在沿海地区,不同地区副溶血弧菌的耐药程度存在差别[8]。据报道,副溶血弧菌对阿莫西林、磺胺甲噁唑、氨苄西林、青霉素、利福平、万古霉素等耐药,有些在水环境中分离的副溶血弧菌对不属于水产养殖中的常用药的红霉素产生了抗药性。并且各地区分离株均存在不同程度的多重耐药性[9-12]。甚至在一些研究中发现的副溶血弧菌对氯霉素产生了抗药性,而氯霉素已被禁用多年,这将影响临床治疗,对人类健康构成重大威胁[13];我国研究者也对分离自水产养殖中、水产品及不同病症的医院病人的副溶血弧菌耐药性进行了报道[14-17],分离菌普遍对氨苄西林耐药,部分菌株对氟苯尼考、链霉素、头孢曲松耐药率较高,并在一定程度上也具有多重耐药性。由此发现,大多数分离菌株因地域、环境以及宿主情况,耐药谱存在差别,但多重耐药性愈发严重。

    细菌产生耐药性一般是由于染色体介导、整合子或质粒介导产生,大部分都是将整合子或质粒作为载体通过接合转移产生耐药性[18]。副溶血弧菌耐药也是通过染色体基因突变或者通过移动元件携带外源性的耐药基因编码产生药物水解酶。研究发现,副溶血弧菌VPA0095基因与喹诺酮耐药基因qnrA基因相关,其可降低副溶血弧菌对喹诺酮类药物的敏感性[19]。并且副溶血弧菌携带多种接合转移的元件,可以水平转移耐药基因[8]。此外,外排泵的过度表达也是研究较多的耐药机制[20-21]

    本文测定了从养殖患病对虾临床分离的副溶血弧菌对16种抗菌药的耐药性,检测了其耐药基因的携带情况,分析了耐药表型与基因型相关性,旨在掌握对虾源副溶血弧菌的耐药现状,为后续其耐药机制的研究提供基础数据。

    • 36株副溶血弧菌为2017—2018年从上海郊区、江苏、福建及海南等4个地区的不同养殖场患病对虾中分离所得,经鉴定后−80 ℃保存于80%甘油中。药敏试验质控菌株为Escherichia coli ATCC 25922。

    • 2216E培养基和MH培养基购自青岛海博生物技术有限公司,LB培养基由本实验室配制;PCR相关试剂 (Premix Ex TaqTM)、DNA Maker DL2000购于宝生物工程 (大连) 有限公司;PCR扩增引物及基因测序由上海生工生物有限公司进行。16种抗菌药物:环丙沙星 (Ciprofloxacin)、诺氟沙星 (Norfloxacin)、恩诺沙星 (Enrofloxacin)、氟苯尼考 (Florfenicol)、氯霉素 (Chloramphenicol)、土霉素 (Oxytetracycline)、多西环素 (Doxycycline)、磺胺甲噁唑 (Sulfamethoxazole)、复方新诺明 (Compound Sulfamethoxazol)、庆大霉素 (Gentamicin)、硫酸新霉素(Neomycinsulphate)、红霉素 (Erythromycin)、氨苄西林 (Ampicillin)、头孢曲松 (Ceftriaxone)、美罗培南 (Meropenem)、利福平 (Rifampicin)均购自生工生物(上海)工程有限公司。

    • 副溶血弧菌对9类16种药物的药敏试验采用CLSI推荐的琼脂稀释法[22]

    • 参照CLSI中抗菌药物的配制方法,先将抗菌药物配制成高浓度的母液,并用0.22 μm滤膜过滤除菌200 μL分装洁净的离心管中,−20 ℃保存。

    • 将−80 ℃冻存的副溶血弧菌菌株用2216E固体培养基在28 ℃恒温复苏培养18 h。同时,用LB固体培养基,37 ℃恒温培养大肠杆菌质控菌株 (ATCC25922) 18 h。挑取单菌落接种于MH液体培养基中,28 ℃ (大肠杆菌37 ℃) 恒温摇床中,200 r·min−1增菌至浓度约为0.5麦氏比浊度 (相当于105 CFU·mL−1) 备用。

    • 根据表1中各药物的稀释范围,倍比稀释法稀释抗菌药,并用移液枪快速加入到约60 ℃的MH琼脂培养基,迅速混匀,即配成相应浓度的琼脂药敏平板,同时准备不添加抗菌药的MH培养基作为空白对照。

      抗菌药物
      Antimicrobial
      稀释范围
      Dilution range/(μg·mL−1)
      MIC判定标准
      Judgment standard/(μg·mL−1)
      ATCC25922质控范围
      Quality control range/(μg·mL−1)
      SIR
      环丙沙星 Ciprofloxacin 0.12~64 ≤1 2 ≥4 0.004~0.015
      诺氟沙星 Norfloxacin 0.06~32 ≤4 8 ≥16 0.03~0.12
      恩诺沙星 Enrofloxacin 0.06~32 ≤0.5 1~2 ≥4 0.03~0.12
      氟苯尼考 Florfenicol 0.25~128 ≤2 4 ≥8 2~8
      氯霉素 Chloramphenicol 0.25~128 ≤8 16 ≥32 2~8
      土霉素 Oxytetracycline 0.12~64 ≤4 8 ≥16 0.5~4
      多西环素 Doxycycline 0.12~64 ≤4 8 ≥16 0.5~2
      磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole 5~2 560 ≤256 ≥512 4~32
      复方新诺明 Compound sulfamethoxazole 0.125/2.375~64/1 216 ≤2/38 ≥4/76 ≤0.5/9.5
      硫酸新霉素 Neomycin sulfate 0.06~32 ≤2 4 ≥8 0.5~4
      庆大霉素 Gentamicin 0.06~32 ≤4 8 ≥16 0.25~1
      红霉素 Ergomycin 0.5~512 ≤0.5 1~4 ≥8 2~8
      头孢曲松 Ceftriaxone 0.12~64 ≤1 2 ≥4 0.03~0.12
      氨苄西林 Ampicillin 0.25~128 ≤8 16 ≥32 2~8
      美罗培南 Meropenem 0.125~64 ≤4 8 ≥16 0.008~0.06
      利福平 Rifampin 1~512 ≤1 2 ≥4 4~16
      注:−. 缺少相应的参考数据 Note: −. Lack of corresponding reference data

      表 1  抗菌药物稀释范围、质控菌株质控范围及药敏试验结果判定标准

      Table 1.  Dilution range of antibacterial drugs, quality control range of quality control strains and criteria for determination of drug susceptibility test results

    • 将已稀释好的菌液按编号顺次加入96孔板中,用自制钉板蘸取菌液,按在已凝固的药敏平板上,正面向上放置,每种药物做3个平行,置于28 ℃培养箱培养16~20 h[23]

    • 按照表1中CLSI中质控菌株的药敏测试范围,读取试验中测试的最小抑菌浓度 (Minimum inhibitory concentration,MIC) 结果,观察结果是否符合范围则再读取其他测试菌株的MIC结果,若有偏差则需要重新进行测试。在Excel 2010表格中记录药敏结果MIC值。

    • DNA提取采用TIANGEN细菌基因组试剂盒进行提取后对耐药基因进行PCR扩增。扩增体系一致,即DNA模板、正向引物 (F)、反向引物 (R) 各1 μL,Taq聚合酶12.5 μL,无菌水定容至25 μL。耐药基因引物参照文献,具体见表1。反应条件为95 ℃预变性5 min,95 ℃变性1 min、退火40 s (退火温度见表2),72 ℃延伸 (延伸时间视产物长度而定),35个循环后72 ℃延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶120 V电泳30 min后,用凝胶成像仪器观察结果,并将目的产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,测序结果经BLAST与已知序列比对以验证其基因型。

      基因名称
      Gene name
      引物序列 (5'–3')
      Primer sequence
      退火温度
      Annealing temperature/℃
      产物长度
      Length of product/bp
      参考文献
      Reference
      qnrVC136 TTCTCACATCAGGACTTGC
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      qnrB GATCGTGAAACGCAGAAAGG
      ACGATGCCTGGTAGTTGTCC
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      qnrS ACGACATTCGTCAACTGCAA
      TAAATTGGCACCCTGTAGGC
      52 417 [26]
      tetA TTTCGGGTTCGGGATGGT
      CAGGCAGAGCAAGTAGAGG
      55 696 [23]
      tetM GTGGACAAAGGTACAACGAG
      CGGTAAAGTTCGTCACACAC
      55 405 [23]
      tetB GTCGCGGCATCGGTCAT
      TTTTTCGCCCCATTTAGTG
      55 489 [23]
      Sul1 GTGACGGTGTTCGGCATTCT
      TCCGAGAAGGTGATTGCGCT
      63 779 [23]
      Sul2 GCGCAGGCGCGTAAGCTGAT
      CGAAGCGCAGCCGCAATTC
      65 793 [27]
      Sul3 GCAACAGTTGGTGCTAAACGAGA
      AGCAGATGTGATTGATTTGGGAG
      56 578 [23]
      strA TGGCAGGAGGAACAGGAGG
      AGGTCGATCAGACCCGTGC
      54 546 [27]
      strB ATCGTCAAGGGATTGAAACC
      GGATCGTAGAACATATTGGC
      52 509 [23]
      aadA GGAGAATGGCAGCGCAAT
      GTTACTGCGCTGTACCAAT
      55 269 [23]
      aacA CTTGGRTGACCTCGGGATC
      CGATGCTCTATGAGTGGCTAA
      54 344 [23]
      erm CCCGAAAAATACGCAAAATTTCAT
      CCCTGTTTACCCATTTATAAACG
      55 589 [23]
      cat ACAACAGCAACGGTACTAGC
      CAACTTTCACCGATGCCAC
      52 550 [28]
      optrA TTCTCACCCAGATATGCC
      CGGGATCCCGGCAAACT
      60 1395 [29]
      floR CTGCTGATGGCTCCTTTC
      GCCGTGGCGTAACAGAT
      57 650 [30]
      cfr GTGAAGCTCTAGCCAACCGTC
      GCAGCGTCAATATCAATCCC
      55 746 [31]
      blaCARB GCTGAGAGCTCATGAAAAAGTTA
      CGTAGGATCCTTAACTTTATTTGTAGTGC
      55 852 [32]

      表 2  耐药基因引物序列

      Table 2.  Primers sequences of drug resistance genes

    • 临床分离的36株副溶血弧菌对16种常见抗菌药物的耐药性见表3。36株副溶血弧菌对氨苄西林的耐药率最高 (88.9%),其次为磺胺甲噁唑 (66.7%) 和红霉素 (63.9%),土霉素的耐药率也较高 (47.2%)。此外,其他抗菌药耐药率多数低于30%,其中对硫酸新霉素、庆大霉素、头孢曲松和美罗培南等均不耐药。我国允许在水产养殖中使用的抗菌药中,除磺胺甲噁唑的耐药率较高外,其他的耐药率均较低。在水产上禁止使用的药物中,诺氟沙星、环丙沙星和氯霉素的耐药率均较低。

      抗菌药物
      Antimicrobial
      耐药菌株数
      Number of resistant strains
      抗菌药物
      Antimicrobial
      耐药菌株数
      Number of resistant strains
      恩诺沙星 Enrofloxacin 2 (5.6%) 复方新诺明 Compound sulfamethoxazole 8 (22.2%)
      诺氟沙星 Norfloxacin 6 (16.7%) 硫酸新霉素 Neomycin sulfate 0 (0)
      环丙沙星 Ciprofloxacin 6 (16.7%) 庆大霉素 Gentamicin 0 (0)
      氟苯尼考 Florfenicol 4 (11.1%) 红霉素 Erythromycin 23 (63.9%)
      氯霉素 Chloramphenicol 2 (5.6%) 头孢曲松 Ceftriaxone 0 (0)
      土霉素 Oxytetracycline 17 (47.2%) 氨苄西林 Ampicillin 32 (88.9%)
      多西环素 Doxycycline 4 (11.1%) 美罗培南 Meropenem 0 (0)
      磺胺甲噁唑 Sulfamethoxazole 24 (66.7%) 利福平 Rifampin 9 (25%)

      表 3  36株副溶血弧菌耐药状况

      Table 3.  Antibiotics resistance status of 36 strains of V. parahaemolyticus

      图1为36株副溶血弧菌对9类 (16种) 抗菌药物的耐药类型分布。结果显示有22株菌表现出多重耐药性 (即对3类或3类以上抗菌药物耐药) 占61.1% (22/36),其中对4类药物耐药的弧菌数占30.6% (11/36),有1株弧菌对6类抗菌药物耐药。

      图  1  多重耐药菌株统计

      Figure 1.  Strain distribution of multi-drug resistance

    • 本试验检测了9大类抗生素相关的部分耐药基因。喹诺酮类耐药基因检出率分别为qnrVC 72.2% (26/36)、qnrA 41.7% (15/36) 和qnrS 36.1% (13/36),qnrB基因未检测到;酰胺醇类耐药基因仅有floRcfr检出,检出率分别为11.1% (4/36)、22.2 (8/36),其他该类基因未检测到;四环素耐药基因中tetAtetBtetM的检出率分别是16.7% (6/36)、47.2% (17/36) 和13.9% (5/36);磺胺类基因仅检出sul2,检出率为13.9% (5/36);氨基糖苷类耐药基因检出率分别是strA 44.4% (16/36)、srtB 58.3% (21/36)、aadA33.3% (12/36)、aacA 16.7% (6/36);利福霉素类耐药基因arr未检出;β-内酰胺类耐药基因blaCARB检出率47.2% (17/36);大环内酯类、利福霉素类耐药基因均未检测到 (表4)。

      耐药基因
      Resistance gene
      检出率
      Detection rate/%
      耐药基因
      Resistance gene
      检出率
      Detection rate/%
      耐药基因
      Resistance gene
      检出率
      Detection rate/%
      qnrVC 72.2 cfr 22.2 strA 44.4
      qnrA 41.7 tetA 16.7 strB 58.3
      qnrB 0 terB 47.2 aadA 33.3
      qnrS 36.1 tetM 13.9 aacA 16.7
      cat 0 sul1 0 erm 0
      optrA 0 sul2 13.9 blaCARB 47.2
      floR 11.1 sul3 0 arr 0

      表 4  副溶血弧菌耐药基因携带率

      Table 4.  Drug resistance gene carrier rate of V. parahaemolyticus

    • 36株副溶血弧菌耐药表型与其携带基因型的关系 (表5) 结果说明,部分菌株表现出了耐药性,但并没有携带相应的耐药基因。同时,部分菌株携带耐药基因,但没有表现出耐药性。耐药表型与耐药基因型没有表现出一一对应的关系。

      菌株
      Strain
      耐药谱型   
      Resistance profile   
      携带耐药基因  
      Resistance gene  
      301 NOR-CIP-SXT-CFR-MER-SMZ-E-AMP blaCARB
      302 NOR-CIP-SMZ-E-AMP qnrVC-blaCARB
      331 NOR-CIP-SMZ-E-AMP blaCARB
      333 SMZ-E-AMP blaCARB
      335 SMZ-E-AMP qnrVC-tetM-blaCARB
      337 OTC-SMZ-E-AMP qnrVC-blaCARB
      338 OTC-SMZ-E-AMP qnrVC-blaCARB
      340 OTC-DOX-SMZ-AMP-RA qnrVC-blaCARB
      361 ENR-NOR-CIP-SMZ-AMP qnrVC-aadA-blaCARB
      362 ENR-NOR-CIP-SMZ-E-AMP aadA-blaCARB
      365 NOR-CIP-OTC-SMZ-E-AMP blaCARB
      371 OTC-SMZ-SXT-E-AMP qnrVC-sul2-strA-strB-aadA-blaCARB
      372 OTC-SMZ-SXT-E-AMP qnrVC-sul2-strA-strB-aadA-blaCARB
      383 OTC-SMZ-SXT-E-AMP floR-sul2-strA-strB-blaCARB
      384 OTC-SMZ-SXT-E-AMP sul2-strA-strB-blaCARB
      388 FFC-OTC-DOX-SMZ-SXT-AMP-RA qnrVC-tetB-tetM-sul2-blaCARB
      389 SMZ-AMP aadA-aacA-blaCARB
      391 SMZ-E qnrS-strB
      392 SMZ-E-AMP qnrVC-tetB-strB
      393 OTC-SMZ-SXT-AMP qnrVC-tetB-tetM-strB
      394 OTC qnrVC-cfr-tetB-strA-strB
      395 AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetB-strB-aadA
      396 OTC-E-AMP-RA tetB-strA-strB
      397 AMP-RA qnrVC-qnrA-tetB-strA
      398 E-AMP qnrVC-qnrA-qnrS-tetA-strA
      399 E qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-strB-aadA-aacA
      400 E-AMP qnrA-qnrS-tetA-tetB-strA-strB-aadA-aacA
      401 E-AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aadA
      402 AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetB-strA-strB-aadA-aacA
      403 OTC-AMP qnrVCqnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aadA-aacA
      404 AMP-RA qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aadA
      405 AMP qnrVC-qnrA-qnrS-cfr-tetA-tetB-strA-strB-aacA
      406 OTC-SMZ-SXT-E-AMP-RA qnrVC-qnrA-floR-tetB-strA
      407 FFC-C-OTC-DOX-SMZ-SXT-E-AMP-RA qnrVC-qnrA-qnrS-floR-tetB-tetM-strB
      408 FFC-OTC-SMZ-RA qnrVC-qnrA-qnrS-tetB-strA-strB
      409 FFC-C-OTC-DOX-SMZ-E-RA qnrVC-qnrA-qnrS-floR-tetB-tetM-strB
      注:ENR. 恩诺沙星;NOR. 诺氟沙星;CIP. 环丙沙星;FFC. 氟苯尼考;C. 氯霉素;OTC. 土霉素;DOX. 多西环素;SMZ. 磺胺甲噁唑;SXT. 复方新诺明;E. 红霉素;AMP. 氨苄西林;RA. 利福平 Note: ENR. Enrofloxacin;NOR. Norfloxacin;CIP. Ciprofloxacin;FFC. Florfenicol;C. Chloramphenicol;OTC. Oxytetracycline;DOX. Doxycycline;SMZ. Sulfamethoxazole;SXT. Compound Sulfoxime;E. Erythromycin;AMP. Ampicillin;RA. Rifampicin

      表 5  36株副溶血弧菌耐药表型与其携带基因型关系

      Table 5.  Relationship between resistant phenotype of 36 V. parahaemolyticus strains and their carrying genotypes

    • 本研究选择了部分人医临床常用药、国标渔药、兽药和个别禁用药等16种抗菌药物进行药敏试验。副溶血弧菌不仅可感染水生动物,还会通过食物链或者环境感染人、畜,是一种人、畜、渔共患病原。本试验中分离自对虾中的36株副溶血弧菌对16种抗菌药物的敏感性检测结果显示,分离株对土霉素、磺胺甲噁唑、红霉素、氨苄西林表现出了明显的耐药性,而对硫酸新霉素、庆大霉素、美罗培南和头孢曲松则表现出100%敏感,对其他药物的耐药率维持在30%以内。

      本试验中磺胺甲噁唑因其抗菌谱广、价格低、药效好等特点,国标渔药药典里指导渔药中使用磺胺类药物居多,已有70年的使用历史,被广泛地应用于水产养殖业中,是抗感染治疗中的重要药物之一[33]。磺胺类药在一定程度上有效抑制了副溶血弧菌引起的病害,但同时也造成了弧菌对磺胺类的耐药趋势逐年增加。弧菌对磺胺类的高耐药率在国际国内的研究报道中很常见,目前在我国环境中磺胺类药物的浓度与检出率远高于其他国家,推测副溶血弧菌对磺胺类药物的耐药程度可能与环境中磺胺类药高浓度的残留量有关[34]。这说明磺胺类药物的使用对于副溶血弧菌病的防控已经不再有良好的治疗效果。土霉素和红霉素耐药率较高,这两种非国标渔药很可能仍在使用或者存在药物或者耐药基因的污染。采集的菌株对氨苄西林耐药率极高 (88.9%),这与从1978年Joseph等[35]在印度分离的及近年来我国刘英超等[16]从急性肠炎病人粪便标本中分离出的副溶血弧菌对氨苄西林的耐药情况一致,在很长时间并没有变化,均表现出高度耐药,根据Chiou等[32]和Joseph等[35]的研究发现,大多数菌株因为blaCARB基因编码产生β-内酰胺酶对氨苄西林耐药,在水产养殖中氨苄西林对治疗弧菌病效果不理想。本试验中多重耐药性弧菌的比重为61.1% (22/36),耐药种类最多达6种,表明采样地区多重耐药的情况相对较严重。研究表明,水产养殖环境中的细菌能够充当抗性基因的贮藏库,并且可能有助于耐药基因的传播[36]

    • 检测的喹诺酮类耐药基因检出率分别为qnrVC 72.2% (26/36)、qnrA 41.7% (15/36) 和qnrS 36.1% (13/36),其耐药率分别为恩诺沙星5.6% (2/36)、环丙沙星16.7% (6/36)、诺氟沙星16.7% (6/36),表明喹诺酮类药物的耐药基因检出率比较高,而耐药率较低。磺胺类耐药基因检出率为sul2 13.9% (5/36),而其耐药率则高达66.7%,说明磺胺类药物具有较高的耐药性,但是耐药基因的携带率不高。本试验结果表明耐药基因的检出率与耐药表型之间不是完全一一对应的关系。这可能与耐药基因种类的多样性及变体多样性有关,并且副溶血弧菌种存在不同的耐药机制,导致耐药表型与耐药基因型之间的关联性不同[22]。本试验结果与Jiang等[37]及Kitiyodom等[27]的研究结果具有相似性,其在耐喹诺酮类药物菌株的gyrAparC基因发现了点突变,并且所有的分离株携带介导抗菌药物产生耐药性的1类整合子。携带耐药基因的菌株不表现出耐药性,可能与环境等的选择压力有关,也可能是因为这些基因是沉默基因,而一些耐药菌株不携带耐药基因可能是存在其他耐药机制导致的结果。耐药性高的菌可能携带大量耐药基因和质粒,会导致耐药性在养殖区域内扩散,危害水产养殖业的健康发展[38]。抗菌药物耐药性的程度、耐药细菌的传播在水产病害防控以及人、畜疾病治疗都是需要关注的问题。

参考文献 (38)

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