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复合酶法提取石花菜粗多糖工艺的响应面优化

裴若楠 翟红蕾 戚勃 杨贤庆

引用本文:
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复合酶法提取石花菜粗多糖工艺的响应面优化

    作者简介: 裴若楠(1994— ),女,硕士研究生,从事水生生物原料精深加工及利用研究。E-mail: 424007940@qq.com;
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 中图分类号: TS 201.1

Optimization of multi-enzymatic extraction of polysaccharide from Gelidium amansii by response surface methodology

    Corresponding author: Xianqing YANG, yxqgd@163.com
  • CLC number: TS 201.1

  • 摘要: 为优化复合酶法[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]提取石花菜(Gelidium amansii)粗多糖的工艺条件,在单因素实验基础上进行三因素三水平的Box-Benhnken中心组合实验,并根据回归分析确定石花菜粗多糖的复合酶法最佳提取工艺为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32 (g·mL–1)。在此条件下酶解120 min,石花菜粗多糖的提取率可达15.98%。
  • 图 1  不同因素对多糖提取率的影响

    Figure 1.  Effect of different factors on extraction yield of polysaccharide

    图 2  两因素交互作用对多糖提取率的响应面图和等高线图

    Figure 2.  Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharide

    表 1  响应面分析因素水平表

    Table 1.  Factors and levels used in response surface analysis

    水平
    level
    因素 factor
    酶添加量(A)/%
    enzyme addition
    酶解温度(B)/℃
    enzymatic hydrolysis temperature
    料液比(C)/g·mL−1
    solid-liquid ratio
    −1, 0, 11551∶20
    02601∶30
    13651∶40
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    表 2  响应面实验设计方案及结果

    Table 2.  Program and test results of RSM

    编号
    No.
    因素 factor提取率/%
    extraction yield of polysaccharide
    酶添加量/%
    enzymes addition
    酶解温度/℃
    enzymatic hydrolysis temperature
    料液比/g·mL−1
    solid-liquid ratio
    1 2 60 1∶30 15.50
    2 1 60 1∶40 12.18
    3 3 60 1∶20 11.94
    4 1 55 1∶30 8.97
    5 2 60 1∶30 15.27
    6 2 60 1∶30 15.79
    7 2 60 1∶30 16.57
    8 2 60 1∶30 15.76
    9 2 65 1∶40 10.40
    10 3 65 1∶30 11.37
    11 3 60 1∶40 13.94
    12 3 55 1∶30 9.20
    13 2 65 1∶20 8.28
    14 1 65 1∶30 9.01
    15 2 55 1∶20 7.20
    16 2 55 1∶40 8.52
    17 1 60 1∶20 11.34
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    表 3  模型回归方程方差分析

    Table 3.  ANOVA of regression equation

    方差来源
    source
    平方和
    SS
    自由度
    df
    均方
    MS
    FP显著性
    significance
    模型 model 152.86 9 16.98 110.34 < 0.000 1 ***
    A 3.04 1 3.04 19.77 0.003 **
    B 3.34 1 3.34 21.73 0.002 3 **
    C 4.92 1 4.92 31.99 0.000 7 ***
    AB 1.14 1 1.14 7.38 0.029 9 *
    AC 0.33 1 0.33 2.15 0.185 9
    BC 0.16 1 0.16 1.03 0.343 2
    A2 6.01 1 6.01 39.05 0.000 4 ***
    B2 102.88 1 102.88 668.41 < 0.000 1 ***
    C2 21.02 1 21.02 136.59 < 0.000 1 ***
    残差 residual 1.08 7 0.15
    失拟项 lack of fit 0.12 3 0.04 0.17 0.913 5
    绝对误差 pure error 0.96 4 0.24
    总误差 total error 153.93 16
    注:*. 差异显著(P<0.05);**. 差异极显著(P<0.01);***. 差异极极显著(P<0.001) Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01); ***. extremely significant difference (P<0.001)
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  • [1] 于广利, 赵峡. 糖药物学[M]. 青岛: 中国海洋大学出版社, 2012: 231-235.
    [2] 朱丰, 刘施琳, 李天骄, 等. 响应面法优化石花菜酸奶发酵工艺研究[J]. 中国酿造, 2017, 36(4): 103-108. doi: 10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.022
    [3] 孙杰, 王艳杰, 朱路英, 等. 石花菜醇提物抑菌活性和抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2007, 28(10): 53-56. doi: 10.3321/j.issn:1002-6630.2007.10.007
    [4] KANG M C, KANG N, KIM S Y, et al. Popular edible seaweed, Gelidium amansii prevents against diet-induced obesity[J]. Food Chem Toxicol, 2016, 90: 181-187. doi: 10.1016/j.fct.2016.02.014
    [5] YANG T H, YAO H T, CHANG M T. Red algae (Gelidium amansii) hot-water extract ameliorates lipid metabolism in hamsters fed a high-fat diet[J]. J Food Drug Anal, 2017, 25(4): 931-938. doi: 10.1016/j.jfda.2016.12.008
    [6] LIU H C, CHANG C J, YANG T H, et al. Long-term feeding of red algae (Gelidium amansii) ameliorates glucose and lipid metabolism in a high fructose diet-impaired glucose tolerance rat model[J]. J Food Drug Anal, 2017, 25(3): 543-549. doi: 10.1016/j.jfda.2016.06.005
    [7] 王慧, 周星, 唐菲, 等. 石花菜多糖对糖尿病大鼠降血糖作用的实验研究[J]. 保健医学研究与实践, 2011, 8(4): 8-10.
    [8] 林雄平, 周逢芳, 陈晓清, 等. 石花菜和海蒿子提取物抗菌活性初步研究[J]. 亚热带植物科学, 2011, 40(1): 28-30. doi: 10.3969/j.issn.1009-7791.2011.01.007
    [9] LIU X X, YAN Y Y, LIU H M, et al. Emulsifying and structural properties of polysaccharides extracted from Chinese yam by an enzyme-assisted method[J]. LWT-Food Sci Technol, 2019, 111: 242-251. doi: 10.1016/j.lwt.2019.05.016
    [10] SHANG H, CHEN S, LI R, et al. Influences of extraction methods on physicochemical characteristics and activities of Astragalus cicer L. polysaccharides[J]. Process Biochem, 2018, 73: 220-227. doi: 10.1016/j.procbio.2018.07.016
    [11] 邱博韬, 张鸿宇, 许志茹, 等. 多糖分析方法研究进展[J]. 食品工业科技, 2018, 39(6): 327-333.
    [12] KULSHRESHTHA G, BURLOT A S, MARTY C, et al. Enzyme-assisted extraction of bioactive material from Chondrus crispus and Codium fragile and its effect on herpes simplex virus (HSV-1)[J]. Mar Drug, 2015, 13(1): 558-580. doi: 10.3390/md13010558
    [13] NADAR S S, RAO P, RATHOD V K. Enzyme assisted extraction of biomolecules as an approach to novel extraction technology: a review[J]. Food Res Int, 2018, 108: 309-330. doi: 10.1016/j.foodres.2018.03.006
    [14] 郑朝阳, 肖兰华, 覃军. 响应面分析法优化酶提取土茯苓多糖工艺[J]. 中国中医药现代远程教育, 2018, 16(6): 99-102. doi: 10.3969/j.issn.1672-2779.2018.06.040
    [15] PRASAD K N, JING H, SHI J, et al. Antioxidant and anticancer activities of high pressure-assisted extract of longan (Dimocarpus longan Lour.) fruit pericarp[J]. Innov Food Sci Emerg, 2009, 10(4): 413-419. doi: 10.1016/j.ifset.2009.04.003
    [16] 于淑娟; 高大维; 李国基. 超声波酶法提取灵芝多糖的机理研究[J]. 华南理工大学学报(自然科学版), 1999, 26(4): 122-124. doi: 10.3321/j.issn:1000-565X.1999.04.022
    [17] 赵强, 覃杰, 王静宇, 等. 枸杞多糖提取工艺研究进展[J]. 中国林副特产, 2018(2): 78-80.
    [18] 邹东恢, 梁敏, 杨勇, 等. 香菇多糖复合酶法提取及其脱色工艺优化[J]. 农业机械学报, 2009, 40(3): 135-138, 134.
    [19] 薛燕, 敢小双, 黄开丽, 等. 铁皮石斛多糖复合酶法提取工艺及其抗氧化性[J]. 食品工业科技, 2018, 39(3): 215-219, 225.
    [20] DUBOIS M, GILLES K A, HAMILTON J K, et al. Colorimetric method for determination of sugars and related substances[J]. Anal Chem, 1956, 28(3): 350-356. doi: 10.1021/ac60111a017
    [21] 慕运动. 响应面方法及其在食品工业中的应用[J]. 河南工业大学学报, 2001, 22(3): 91-94. doi: 10.3969/j.issn.1673-2383.2001.03.023
    [22] 李莉, 张赛, 何强, 等. 响应面法在试验设计与优化中的应用[J]. 实验室研究与探索, 2015, 34(8): 41-45. doi: 10.3969/j.issn.1006-7167.2015.08.011
    [23] 黄森, 查学强, 罗建平, 等. Box-Behnken法优化提取霍山石斛活性多糖的研究[J]. 中药材, 2007, 30(5): 591-594. doi: 10.3321/j.issn:1001-4454.2007.05.033
    [24] 吴金松, 陈光静, 马志伟, 等. 酶法辅助提取甘蔗渣中水溶性多糖的工艺优化[J]. 中国调味品, 2019, 44(2): 70-74, 79. doi: 10.3969/j.issn.1000-9973.2019.02.015
    [25] 陈胜军, 刘先进, 杨贤庆, 等. 酶法提取鲍鱼内脏多糖工艺的优化[J]. 南方农业学报, 2018, 49(7): 1389-1395. doi: 10.3969/j.issn.2095-1191.2018.07.20
    [26] 刘焕燕, 杨波, 李琴, 等. 复合酶法优化毛竹笋壳多糖提取工艺及其抗氧化活性研究[J]. 上海理工大学学报, 2018, 40(6): 572-578.
    [27] 贺寅, 王强, 钟葵. 响应面优化酶法提取龙眼多糖工艺[J]. 食品科学, 2011, 32(2): 79-83.
    [28] 张荔菲, 刘莹, 王益, 等. 超声辅助酶法提取柚子皮多糖工艺的响应面优化[J]. 食品工业科技, 2018, 39(5): 146-150.
    [29] 雍成文, 王文玲, 李湘球, 等. 复合酶法提取黄秋葵多糖的响应面优化研究[J]. 中国食品添加剂, 2018, 170(4): 99-105. doi: 10.3969/j.issn.1006-2513.2018.04.017
    [30] 罗凯, 黄秀芳, 周毅峰, 等. 响应面试验优化复合酶法提取碎米荠多糖工艺及其抗氧化活性[J]. 食品科学, 2017, 38(4): 237-242. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201704038
    [31] 张换, 曾艳, 管于平, 等. 响应面法优化海带多糖的酶法提取工艺及其抗氧化研究[J]. 食品科技, 2013, 38(5): 197-202.
    [32] RODRíGUEZ-GONZÁLEZ V M, FEMENIA A, MINJARES-FUENTES R, et al. Functional properties of pasteurized samples of Aloe barbadensis Miller: optimization using response surface methodology[J]. LWT-Food Sci Technol, 2012, 47(2): 225-232. doi: 10.1016/j.lwt.2012.01.004
    [33] 许瑞波, 吴琳, 王吉, 等. 石花菜多糖的提取工艺及其抗氧化活性研究[J]. 淮海工学院学报(自然科学版), 2011, 20(2): 38-41. doi: 10.3969/j.issn.1672-6685.2011.02.011
    [34] 刘言炜, 张发宇, 汪家权. 响应面法优化超声波辅助冻融提取蓝藻多糖工艺研究[J]. 食品科技, 2018, 43(5): 198-205.
  • [1] 李莎莎曹煜成胡晓娟李卓佳徐煜杨铿徐创文文国樑 . 响应面法优化芽孢杆菌(Bacillus sp.)A4的培养参数. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.05.012
    [2] 张涛吴燕燕李来好杨贤庆林婉玲杨少玲郝淑贤 . 响应面法优化水产品液体速冻用的载冷剂配比. 南方水产科学, doi: 10.12131/20190038
    [3] 任杰林炜铁罗小春谢明权 . 统计优化硝化菌发酵培养基(英文). 南方水产科学,
    [4] 王小慧戚勃杨贤庆杨少玲马海霞邓建朝 . 响应面法优化末水坛紫菜蛋白酶解工艺及其酶解液抗氧化活性研究. 南方水产科学, doi: 10.12131/20180099
    [5] 陈康戴志远沈清黄耀文 . 响应面法提取南极磷虾磷脂及其分子种组成的测定. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.03.014
    [6] 于福田岑剑伟李来好杨贤庆黄卉郝淑贤魏涯赵永强林织 . 罗非鱼片微酸性电解水杀菌工艺响应面法优化研究. 南方水产科学, doi: 10.12131/20180164
    [7] 郭恒斌曾庆祝 . 酶法提取鱿鱼皮胶原蛋白工艺条件的研究. 南方水产科学,
    [8] 戚勃李来好杨贤庆陈胜军刘刚李占东 , . 响应曲面法优化麒麟菜卡拉胶碱处理工艺. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2011.06.005
    [9] 魏大鹏单洪伟马甡张家松 . 混料设计优化复合菌剂比例的研究. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.01.003
    [10] 王忠良黄建盛张健东陈刚 . 响应面法分析光照强度与盐度对卤虫休眠卵孵化率的联合效应. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.03.012
    [11] 钟志鸿王菲陈永贵邓恒为王世锋孙云陈雪芬郭伟良周永灿 . 基于响应面法分析乌梅和抗生素对哈维氏弧菌的协同抑制作用. 南方水产科学, doi: 10.12131/20180056
    [12] 姜淼杨贤庆李来好岑剑伟郝淑贤章超桦 . 内源酶辅助提取虾壳虾青素的研究. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2011.02.009
    [13] 曾少葵刘坤吴艺堂吴文龙殷娟娟施雯 . 脱钙罗非鱼鱼鳞明胶提取工艺优化及其理化性质. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.02.007
    [14] 张婉吴燕燕李来好王锦旭杨少玲荣辉 . 海萝中抗紫外辐射物质的提取工艺优化研究. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2016.02.015
    [15] 徐竞 . 正交试验优化天然虾青素的提取工艺研究. 南方水产科学,
    [16] 徐煜徐武杰文国樑胡晓娟苏浩昌杨铿李卓佳曹煜成 . 颤藻浓度和水温对凡纳滨对虾响应颤藻粗提液毒性的影响. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.004
    [17] 张涛黄建华温为庚杨其彬郭志勋 . WSSV+斑节对虾的血清免疫相关酶对人工感染WSSV粗提液的反应. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.01.006
    [18] 彭军辉程长洪冯娟谢佳伟马红玲郭志勋 . 番石榴叶水提取物对拟穴青蟹免疫相关酶活力的影响. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2018.03.008
    [19] 黄光中胡辉肖克宇罗世民谢培荣欧阳菊英 . 葡萄籽与青蒿提取物对黄鳝肠道消化酶活性及血液生化指标的影响. 南方水产科学, doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2013.02.012
    [20] 吴燕燕李来好岑剑伟周婉君杨贤庆陈胜军刁石强 . 酶法由罗非鱼加工废弃物制取调味料的研究. 南方水产科学,
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-04-08
  • 录用日期:  2019-06-19
  • 网络出版日期:  2019-07-03

复合酶法提取石花菜粗多糖工艺的响应面优化

    作者简介:裴若楠(1994— ),女,硕士研究生,从事水生生物原料精深加工及利用研究。E-mail: 424007940@qq.com
    通讯作者: 杨贤庆, yxqgd@163.com
  • 1. 中国水产科学研究院南海水产研究所,国家水产品加工技术研发中心,农业农村部水产品加工重点实验室,广东 广州 510300
  • 2. 上海海洋大学食品学院,上海 201306

摘要: 为优化复合酶法[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]提取石花菜(Gelidium amansii)粗多糖的工艺条件,在单因素实验基础上进行三因素三水平的Box-Benhnken中心组合实验,并根据回归分析确定石花菜粗多糖的复合酶法最佳提取工艺为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32 (g·mL–1)。在此条件下酶解120 min,石花菜粗多糖的提取率可达15.98%。

English Abstract

  • 石花菜(Gelidium amansii)别名海冻菜、红丝、凤尾,是中国重要的经济红藻之一,生于大干潮线附近及以下6~10 m的海岩上,常见于中国黄海、渤海沿岸,浙江、福建以及台湾沿海也有生长[1]。石花菜是一种利用价值极高的药食两用海藻,不仅营养成分丰富,而且具有降血脂、降血糖、清热解暑、清肺化痰等药用功效[2-3]。Kang等[4]对石花菜提取物的抗肥胖生物活性进行了研究,结果表明石花菜提取物的摄入可大幅降低高脂饮食小鼠(Mus musculus)的体质量,其作用机制可抑制脂肪细胞中脂肪原基因的表达,从而减少脂肪生成;另有多项研究表明,饮食中补充石花菜可有效改善高果糖饮食大鼠的胰岛素抵抗及高脂血症,同时还可降低糖尿病大鼠患慢性炎症和心血管疾病的风险[5-6]。在石花菜所含的多种生物活性物质中,石花菜多糖的含量高、用途广泛、可利用度高,尤其受到研究者的关注,从石花菜中提取分离得到的多糖类物质已被证实具有抑菌、抗氧化、抗凝血等生物活性[3,7-8]

    藻类多糖的提取方法众多,目前常见的主要有热水浸提法、酸碱浸提法,新型提取技术有酶法、微波辅助提取法、超声辅助提取法等。近年来,酶提法作用条件温和、提取率高,在提取多糖的过程中可较好地保留其生物活性,因而逐渐得到广泛应用[9-10]。酶在制备多糖的过程中主要起2种作用:1)利用酶的催化活性和高选择性,在较为温和的条件下特异地降解细胞壁等阻碍多糖溶出的屏障,加速多糖的释放[11-12];2)利用酶来降解粗多糖以制备低分子量多糖[13]。海藻细胞壁主要含纤维素,通过纤维素酶处理,可以高效地破坏细胞壁的组织结构,加快海藻多糖的溶出;而木瓜蛋白酶不仅对多糖的提取起到辅助作用,还可促使原料中蛋白质水解,从而脱除部分蛋白,提升溶出液中多糖的纯度[14]。石花菜虽属中国北方常见红藻,但国内外对其多糖的提取方法的研究有限,目前石花菜多糖的提取仍依赖于传统的水提醇沉方法,此法虽安全简单,但耗时长且温度高,易引起多糖的降解[15],所提多糖质量远不及酶法等新型提取方法[16-17]。因此,本研究以石花菜为实验材料,确定复合酶配比为m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1[18-19],采用复合酶法提取石花菜粗多糖,在单因素实验的基础上运用响应面法优化复合酶法提取石花菜粗多糖的工艺,以期为石花菜天然食品、药品的综合开发利用提供参考依据。

    • 石花菜干品来源于山东省威海市;纤维素酶(酶活性≥30 U·mg−1)、木瓜蛋白酶(酶活性≥2.0×105 U·mg−1)为生物试剂;葡萄糖标准品、无水乙醇、浓硫酸、苯酚、丙酮等均购于广州领驭生物科技有限公司,为分析纯。

      EYELA N-1000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);TDZ5-WS台式低速离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司);SUNRISE吸光酶标仪(瑞士TECAN公司);THZ-82回旋水浴恒温振荡器(常州金坛精达仪器制造有限公司);DHG-9145A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);Alpha 1-4冷冻干燥仪(德国Christ有限责任公司);GB204电子天平[瑞士METTLER仪器(中国)有限公司];79-1磁力加热搅拌器(天津市赛德利斯实验分析仪器制造厂)。

    • 本实验采用复合酶法对石花菜粗多糖进行提取,具体工艺流程为:石花菜(干品)→反复清洗去杂质→50 ℃烘箱干燥→粉碎过筛(40目)→按一定料液比加水→50 ℃预热10 min→加入适量复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]→恒温酶解→沸水浴灭酶15 min→离心(4 000 r·min–1,10 min)→取上清液→测提取率。

    • 本实验采用苯酚-硫酸法[20]测定石花菜粗多糖提取率(定义为苯酚-硫酸法计算得到的多糖质量占藻粉质量的百分比)。以葡萄糖为标准品,于490 nm处测定吸光度并绘制标准曲线。经线性回归得标准曲线方程A=6.395x+0.009 9,相关系数R²=0.999。式中x为多糖质量浓度(mg·mL−1),A为吸光度。用下式转化得石花菜粗多糖溶液中多糖的质量浓度:

      $ {\text{粗多糖提取率}} = \frac{{\left( {A - 0.009\;9} \right) \times V}}{{6.395m}} \times 0.9 \times 100{\text{%}} $

      式中A为苯酚-硫酸法测定的粗多糖溶液吸光度,V为粗多糖溶液体积(mL),m为石花菜藻粉质量(mg);0.9为转化系数。

    • 分别以不同的复合酶添加量、酶解时间、酶解温度和料液比(g·mL–1,下同)进行单因素实验,分析各因素对于酶解提取石花菜粗多糖的影响。

      1)复合酶添加量对粗多糖提取率的影响。分别称取1 g石花菜藻粉,置于5个容量为100 mL的锥形瓶中,按照藻粉质量的1%、1.5%、2%、2.5%、3%加入复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1),在料液比1∶30、酶解温度60 ℃条件下水浴振荡提取120 min,4 000 r·min−1转速下离心10 min,取上清液测定总糖质量分数。

      2)酶解时间对粗多糖提取率的影响。固定复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]添加量为藻粉质量2%、料液比1∶30、酶解温度60 ℃,研究不同酶解时间(60 min、90 min、120 min、150 min、180 min)对粗多糖提取率的影响。

      3)酶解温度对粗多糖提取率的影响。固定复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) = 2∶1]添加量为藻粉质量的2%、料液比1∶30、酶解时间120 min,研究不同酶解温度(45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃)对粗多糖提取率的影响。

      4)料液比对粗多糖提取率的影响。固定复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]添加量为藻粉质量的2%、酶解时间120 min、酶解温度60 ℃,研究不同料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60)对粗多糖提取率的影响。

    • 在单因素实验的基础上,选取酶添加量(A)、酶解温度(B)、料液比(C) 3个主导因素,每个因素设3个水平,以石花菜粗多糖提取率为响应值,采用Design-Expert 10软件进行三因素三水平Box-Behnken实验设计,通过响应面分析对复合酶法提取石花菜粗多糖的工艺进行优化[21-23]。实验因素及水平见表1

      水平
      level
      因素 factor
      酶添加量(A)/%
      enzyme addition
      酶解温度(B)/℃
      enzymatic hydrolysis temperature
      料液比(C)/g·mL−1
      solid-liquid ratio
      −1, 0, 11551∶20
      02601∶30
      13651∶40

      表 1  响应面分析因素水平表

      Table 1.  Factors and levels used in response surface analysis

    • 通过软件Microsoft Excel和IBM SPSS Statistics 23进行实验数据的统计分析以及响应面曲面模型的回归方程和显著性统计分析。采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行多重比较,P<0.05为差异显著。

    • 复合酶添加量为1%~2%时,多糖提取率随着酶量的增加而提高,并在酶量大于2%时呈下降趋势(图1-a),这与吴金松等[24]研究的甘蔗(Saccharum officinarum)渣中水溶多糖的酶法提取最佳工艺中所得结论一致。复合酶作用于石花菜细胞壁结构,使其降解,从而加速了细胞内容物的释放。随着复合酶添加量的增加,酶和底物接触的机会也随之增加,在相同时间内释放出的多糖含量也因此升高。此后若进一步增加酶量,由于酶分子已达饱和状态,部分复合酶不能再与底物结合,不仅不会增加多糖的提取率,还会造成复合酶的浪费。因此,选取复合酶添加量为2%。

      图  1  不同因素对多糖提取率的影响

      Figure 1.  Effect of different factors on extraction yield of polysaccharide

    • 酶解的前120 min,随着反应时间的延长,石花菜粗多糖的提取率呈上升趋势,并在120 min时达到最高(图1-b),此时酶和底物得到充分反应;但在酶解120 min后,随着时间延长多糖的提取率反而下降,可能是由于提出来的多糖再次分解导致提取量降低(图1-b),这可能和复合酶发挥作用的最适反应时间及最适反应温度有关,说明酶解时间越长不一定越能发挥复合酶的活力。陈胜军等[25]通过响应面实验对胰蛋白酶提取鲍鱼(Haliotis sp.)内脏多糖的工艺进行优化,单因素实验中发现酶解时间为1~2 h时多糖提取率逐渐增加,超过2 h后多糖提取率反而下降,推测可能是在酶解2 h时多糖得到最大程度的溶出,而酶解时间过长酶解液易变质,从而导致多糖提取率下降。综上,最佳的石花菜酶解时间为120 min。

    • 当温度低于60 ℃时,随着温度的升高,石花菜粗多糖的提取率不断升高,尤其在60 ℃前提取率升高最为明显(图1-c),该温度可能是木瓜蛋白酶与纤维素酶在实验条件下的最适温度;温度大于60 ℃后,石花菜粗多糖的提取率大幅度下降,推测原因可能是温度过高引起了复合酶活力的下降,从而使得提取率也随之降低。刘焕燕等[26]在利用复合酶提取毛竹(Phyllostachys heterocycla)笋壳多糖时也得出了相似的结论,即其发现在酶解温度为30~50 ℃时多糖的提取率逐渐上升,温度高于50 ℃时多糖得率出现下降,分析可能是温度过高导致酶失活。因此,选择石花菜粗多糖的酶解温度为60 ℃。

    • 石花菜粗多糖的提取率随料液比的增加呈先升高后降低的趋势,且在料液比为1∶30时达到最大(图1-d)。最初提取率的升高可能是因溶剂增多扩大了反应体系中复合酶与石花菜藻粉接触的面积,增加了石花菜粗多糖的浓度梯度从而使得更多的多糖被溶出;后期随着溶剂的进一步增加,反应体系中的酶浓度受到较大影响,可能导致提取率的降低。此外,料液比过高还会导致后续工艺的操作负担[27-28]。雍成文等[29]在复合酶法提取黄秋葵(Abelmoschus esculentus)多糖的研究中发现,在料液比为1∶30时黄秋葵多糖达到最大提取率,超过或低于此比率,多糖的提取率都会有所下降,主要原因在于多糖从植物细胞壁溶出到溶剂中的过程取决于质量浓度差的推动,溶剂越多则质量浓度差越大,因而推动力增强,但溶剂量若超过一定的范围,则会引起复合酶质量浓度的降低,进而降低了复合酶的催化效率。综上,最佳料液比确定为1∶30。

    • 根据单因素实验结果,选取复合酶添加量、酶解温度及料液比这3个主导因素进行三因素三水平的响应面实验分析,响应面实验设计方案及结果见表2

      编号
      No.
      因素 factor提取率/%
      extraction yield of polysaccharide
      酶添加量/%
      enzymes addition
      酶解温度/℃
      enzymatic hydrolysis temperature
      料液比/g·mL−1
      solid-liquid ratio
      1 2 60 1∶30 15.50
      2 1 60 1∶40 12.18
      3 3 60 1∶20 11.94
      4 1 55 1∶30 8.97
      5 2 60 1∶30 15.27
      6 2 60 1∶30 15.79
      7 2 60 1∶30 16.57
      8 2 60 1∶30 15.76
      9 2 65 1∶40 10.40
      10 3 65 1∶30 11.37
      11 3 60 1∶40 13.94
      12 3 55 1∶30 9.20
      13 2 65 1∶20 8.28
      14 1 65 1∶30 9.01
      15 2 55 1∶20 7.20
      16 2 55 1∶40 8.52
      17 1 60 1∶20 11.34

      表 2  响应面实验设计方案及结果

      Table 2.  Program and test results of RSM

      以复合酶添加量、酶解温度和料液比作为研究对象条件,以石花菜粗多糖的提取率为响应值,共得到17个实验点(表2)。利用Design-Expert 10软件对表2中的数据进行多元回归拟合,最终得到石花菜粗多糖提取率(Y)对复合酶添加量(A)、酶解温度(B)、料液比(C)三因素的二次多项回归模型为Y=15.78+0.617A+0.647B+0.785C+0.533AB+0.288AC+0.199BC−1.195A2−4.943B2−2.235C2

    • 对复合酶法提取石花菜粗多糖的响应面数学模型进行方差分析(表3)。结果显示,该实验模型极显著(P<0.000 1),失拟项不显著(P>0.05),表明模型可用;模型的相关系数R2=0.993 0,$ {R}_{adj}^2$=0.984 0,说明该回归模型可对99.3%的结果值变化规律做出解释,基本可用于复合酶提取石花菜粗多糖的分析和预测[30-31]。此外,在此模型中ABAB项均显著(P<0.05),CA2B2C2项均为极显著(P<0.01,表3),分析可知所选3个因素对石花菜粗多糖提取率影响的主次为C (料液比)>B (酶解温度)>A (复合酶添加量)。

      方差来源
      source
      平方和
      SS
      自由度
      df
      均方
      MS
      FP显著性
      significance
      模型 model 152.86 9 16.98 110.34 < 0.000 1 ***
      A 3.04 1 3.04 19.77 0.003 **
      B 3.34 1 3.34 21.73 0.002 3 **
      C 4.92 1 4.92 31.99 0.000 7 ***
      AB 1.14 1 1.14 7.38 0.029 9 *
      AC 0.33 1 0.33 2.15 0.185 9
      BC 0.16 1 0.16 1.03 0.343 2
      A2 6.01 1 6.01 39.05 0.000 4 ***
      B2 102.88 1 102.88 668.41 < 0.000 1 ***
      C2 21.02 1 21.02 136.59 < 0.000 1 ***
      残差 residual 1.08 7 0.15
      失拟项 lack of fit 0.12 3 0.04 0.17 0.913 5
      绝对误差 pure error 0.96 4 0.24
      总误差 total error 153.93 16
      注:*. 差异显著(P<0.05);**. 差异极显著(P<0.01);***. 差异极极显著(P<0.001) Note: *. significant difference (P<0.05); **. very significant difference (P<0.01); ***. extremely significant difference (P<0.001)

      表 3  模型回归方程方差分析

      Table 3.  ANOVA of regression equation

    • 各因素以及因素之间的交互作用对响应值的影响见图2,在等高线图中圆形等高线表示相应变量之间的交互作用不显著,而椭圆形或马鞍形等形状则表明因素之间有较为显著的交互作用[32]

      图  2  两因素交互作用对多糖提取率的响应面图和等高线图

      Figure 2.  Response surface and contour plots of variable parameters on extraction yield of polysaccharide

      通过比较响应曲面图的陡峭程度可发现,料液比对粗多糖得率的影响最大,其次是酶解温度,这与方差分析结果吻合。复合酶添加量(A)和酶解温度(B)交互影响显著(P<0.05,图2)。在复合酶添加量一定的情况下,随着酶解温度的升高,石花菜粗多糖的提取率呈先增加后下降的趋势,这可能是最初随着酶解温度的升高,反应体系的温度逐渐接近复合酶的最适反应温度,酶促反应速度不断加快,因而提取率不断升高;当酶解温度继续升高,高温可能会引起酶蛋白的变性失活,酶活力降低致使提取率下降。当酶解温度一定时,随复合酶添加量的增加,粗多糖提取率亦先不断增加后略有下降,这是因为在底物浓度一定的情况下,随着复合酶添加量的增加,复合酶和石花菜细胞壁的接触机会增加,酶解作用得到加强,使得提取率有所升高;当溶液中复合酶浓度过大时,酶蛋白自身发生水解,反而使提取率有所下降。复合酶添加量与料液比、酶解温度与料液比之间交互影响不显著。

      利用Design-Expert 10软件进行分析,得到石花菜粗多糖的最佳复合酶辅助提取条件为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32。在此条件下,石花菜粗多糖的提取率最高,预测为15.98%。考虑实际操作条件,对此优化后工艺参数进行修正,修正后为复合酶添加量2.30%,酶解温度60.5 ℃,料液比1∶32。以此结果为条件做3组平行实验进行验证,发现该条件下石花菜粗多糖提取率为16.18%,与预测值基本一致,充分证明了该响应面法优化所得的工艺条件准确可靠,说明所得模型具有实用价值。

    • 本实验以石花菜为原料,运用响应面实验设计及分析方法,对复合酶[m (木瓜蛋白酶)∶m (纤维素酶) =2∶1]法提取石花菜粗多糖的工艺参数进行优化,得出复合酶法提取石花菜粗多糖的最佳工艺条件为复合酶添加量2.30%、酶解温度60.43 ℃、料液比1∶32、酶解时间120 min。在此条件下石花菜粗多糖的提取率约15.98%。

      除酶法提取外,目前藻类多糖较常用的提取方法还有热水浸提法及超声波辅助提取法等,许瑞波等[33]对石花菜多糖的热水浸提方法进行了优化,结果显示在其最佳提取工艺条件下石花菜粗多糖的提取率为30.17%,该提取率虽高于复合酶提取法,但需重复提取3次,每次2 h,耗时长且工艺繁琐;刘言炜等[34]采用超声波辅助冻融法提取蓝藻多糖,通过响应面实验确定最佳提取工艺为超声波功率487.20 W、超声温度66.52 ℃、液料比24.72∶1,在此条件下蓝藻多糖提取率为6.17%,此法引入的杂质少,操作简单,但提取率较低。

      综合各种因素分析来看,复合酶法提取石花菜粗多糖可在提取过程中有效破除石花菜细胞壁,在相对温和的提取条件下促使多糖的溶出,同时,木瓜蛋白酶的加入可将部分结合蛋白水解,起到初步的脱蛋白作用,为后续分离纯化提供方便,所得多糖质量高,具有实用价值。经过复合酶提取得到的粗多糖中含有部分非多糖杂质,在后续的实验中将对石花菜粗多糖进行进一步的分离纯化,以及对纯化后多糖进行相关生物活性研究,以期为制备具有良好生物活性的天然多糖提供资源准备。

参考文献 (34)

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