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光倒刺鲃mc5r基因的克隆及对饥饿的响应

周惠强 陈凯棱 舒琥 杨扬 钟东明 张明清

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光倒刺鲃mc5r基因的克隆及对饥饿的响应

    作者简介: 周惠强(1993—),男,硕士研究生,从事鱼类生理与分子生物学研究。E-mail: 852167088@qq.com;
    通讯作者: 舒琥, shuhu001@126.com
  • 中图分类号: S 917.4

Cloning and starvation response of mc5r gene in Spinibarbus hollandi

    Corresponding author: Hu SHU, shuhu001@126.com ;
  • CLC number: S 917.4

  • 摘要: 通过同源克隆和染色体步移对光倒刺鲃 (Spinibarbus hollandi)黑素皮质素受体-5 (melanocortin receptor-5,mc5r)基因进行了克隆,应用生物信息学方法对mc5r基因序列和推测的氨基酸序列进行分析,采用荧光定量PCR技术研究其mRNA的组织分布、日周期变化以及饥饿再投喂的表达情况。结果表明mc5r基因长度为1 947 bp,含有1个987 bp的外显子,编码329个氨基酸。通过序列同源比对及系统发育进化分析,光倒刺鲃mc5r的氨基酸序列与鲤 (Cyprinus carpio)、犀角金线鲅 (Sinocyclocheilus rhinocerous)的mc5r同源性达到98%。光倒刺鲃mc5r在大脑中显著表达,在间脑、心脏的表达量次之,在中脑、小脑表达量较少,在肾脏、胃、肌肉、脾、肠、性腺、肝脏、延脑、眼中微量表达。光倒刺鲃mc5r mRNA的日周期表达量随昼夜节律而变化,饥饿再投喂实验发现饥饿再投喂组鱼其脑中表达量会显著升高,随后会有下降趋势,表明mc5r可能与光倒刺鲃的摄食调控有关。
  • 图 1  光倒刺鲃mc5r基因组扩增序列结果

    Figure 1.  Sequence results of S. hollandi mc5r genome DNA

    图 2  光倒刺鲃mc5r核苷酸序列以及推测的氨基酸序列

    Figure 2.  mc5r nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of S. hollandi

    图 3  光倒刺鲃与其他物种mc5r氨基酸序列构建的系统发育树

    Figure 3.  Phylogenetic tree constructed from mc5r amino acid sequence of S. hollandi and other species

    图 4  光倒刺鲃mc5r在不同组织中的表达

    Figure 4.  Expression of S. hollandi mc5r in different tissues

    图 5  光倒刺鲃大脑mc5r的日周期表达

    Figure 5.  Daily periodicitye expression of mc5r in brain of S. hollandi

    图 6  光倒刺鲃mc5r mRNA饥饿再投喂的表达情况

    Figure 6.  Expression profiles of mc5r at starvation and refeeding condition in S. hollandi

    表 1  光倒刺鲃mc5r基因克隆和表达分析的引物

    Table 1.  Primers for cloning and expression analysis of mc5r gene in S. hollandi

    引物
    primer
    引物序列 (5'−3')
    primer sequence
    用途
    application
    产物大小/bp
    product size
    F1AAGATGCCCTGTCTACCAACCC克隆850
    R1GGTCCAAATCCCTCCAATGATG克隆
    F2GGAGGGAAAACAACAGCACAAGC克隆750
    R2GGTCCAAATCCCTCCAATGATG克隆800
    F3GGTTAAAGATGCCCAACCCACC克隆800
    R3GGATGAGGTGGAGAAAGAACGG克隆800
    F4CTACTTACTCACCAACCGCCAG克隆850
    R4CTTTGATCGACAGCGTGTCCC克隆900
    FAACACTTCAGAGGCCACCCTGqRT-PCR150
    RTGAGCTGCTCGCATGCTTTGGqRT-PCR
    18sFTGATCGTCTTCGAGCCTCTGAC内参150
    18sRAATTCTTGGACCGGCGCAAGAC内参
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出版历程
  • 收稿日期:  2019-01-28
  • 录用日期:  2019-04-19
  • 网络出版日期:  2019-07-25
  • 刊出日期:  2019-08-01

光倒刺鲃mc5r基因的克隆及对饥饿的响应

    作者简介:周惠强(1993—),男,硕士研究生,从事鱼类生理与分子生物学研究。E-mail: 852167088@qq.com
    通讯作者: 舒琥, shuhu001@126.com
  • 广州大学生命科学学院,广东 广州 510006

摘要: 通过同源克隆和染色体步移对光倒刺鲃 (Spinibarbus hollandi)黑素皮质素受体-5 (melanocortin receptor-5,mc5r)基因进行了克隆,应用生物信息学方法对mc5r基因序列和推测的氨基酸序列进行分析,采用荧光定量PCR技术研究其mRNA的组织分布、日周期变化以及饥饿再投喂的表达情况。结果表明mc5r基因长度为1 947 bp,含有1个987 bp的外显子,编码329个氨基酸。通过序列同源比对及系统发育进化分析,光倒刺鲃mc5r的氨基酸序列与鲤 (Cyprinus carpio)、犀角金线鲅 (Sinocyclocheilus rhinocerous)的mc5r同源性达到98%。光倒刺鲃mc5r在大脑中显著表达,在间脑、心脏的表达量次之,在中脑、小脑表达量较少,在肾脏、胃、肌肉、脾、肠、性腺、肝脏、延脑、眼中微量表达。光倒刺鲃mc5r mRNA的日周期表达量随昼夜节律而变化,饥饿再投喂实验发现饥饿再投喂组鱼其脑中表达量会显著升高,随后会有下降趋势,表明mc5r可能与光倒刺鲃的摄食调控有关。

English Abstract

  • 黑素皮质素受体(melanocortin receptors, mcrs)是黑素细胞皮质激素(melanocortin, mc)参与多种调控和发挥功能的重要受体[1-2]。该受体家族属于G蛋白偶联受体 (GPCR),含有7个跨膜α螺旋结构[3],该家族包含了5种类型的基因,分别是MC1RMC2RMC3RMC4RMC5R[4]。Mcrs功能多样,在色素沉淀[5]、脂质和能量代谢[6]、摄食[7-9]等方面均起到重要作用。MC5R参与脂质代谢和外分泌功能等过程,MC5R基因在人体内普遍存在,在卵巢、乳腺、肾脏、脂肪细胞、肝脏和骨髓中均有表达,但MC5R在皮肤中的表达最高[10-11]。研究表明MC5R对肌肉和肝脏中的脂质代谢有调节作用[12],在人的皮脂细胞开始分化的时候表达较高,因此也可以作为人类皮脂细胞分化的标志性物质[13]MC5R不仅调节脂质代谢,而且对分泌腺的分泌也有调节作用,例如泪腺和皮脂腺等[14]。目前对MC5R的研究,多集中于人 (Homo sapiens)、猪 (Sus domesticus)[15]、家鼠 (Mus musculus)[16]等物种。在鱼类中尚未发现有关mc5r对摄食影响的报道。

    在自然环境中,鱼类经常会受到饥饿胁迫,恢复摄食后其摄食量增加,会出现饲料转化效率升高、生长速率显著加快等现象,此现象被称为生长补偿[17-19]。另外,哺乳动物基因组中存在5%~10%的生物钟基因,该类基因能够表现出以24 h为一个周期的昼夜节律性波动[20],与细胞增殖、凋亡、免疫应答、激素分泌和能量代谢等生命活动均有密切联系[21]。但生物钟基因在鱼类中的研究较少,研究与生长相关基因的昼夜节律变化,可以指导正确的投喂,改善鱼体的生长状态。

    光倒刺鲃 (Spinibarbus hollandi) 属于硬骨鱼纲、鲤形目、鲤科、倒刺鲃属 ,主要分布于我国长江、珠江等水系,其生长快且肉质鲜美,是我国重要的经济鱼类[22]。目前有关光倒刺鲃的研究主要集中于繁殖生物学[23]、遗传多样性[24]等方面,有关光倒刺鲃生长、摄食相关基因的功能研究并不多见,笔者已对光倒刺鲃的mc4rmstn基因进行了克隆,并且对这2个基因与生长性状关联的SNPs筛选和验证进行了初步研究,筛选出与生长显著关联的SNPs[25-26],同为Mcrs家族的mc5r基因是否具有相似的功能?本研究对光倒刺鲃mc5r基因进行了同源克隆和功能分析,以期为光倒刺鲃的摄食、生长发育及相关研究提供基础资料和新的思路。

    • 实验用光倒刺鲃120尾,体质量为 (37.45±7.23) g,取自广东省韶关市水产研究所。在广州大学水产养殖室饲养。每天8:00对光倒刺鲃进行足量投喂,适应环境2周后进行实验。

    • 把光倒刺鲃分为2组 (投喂组和非投喂组),每组50尾,置于100 cm×60 cm×60 cm的水族箱中,水温22~26 ℃,实验时间为2017年10月,实验用鱼置于室内自然光照和自然昼夜节律下,水面光照强度为0~430 lx。非投喂组不喂食,投喂组每天8:00投喂。两组分别在实验开始第1天的9:00、11:00、15:00、20:00以及第2天的8:00 (投喂后)对光倒刺鲃进行取样,每次6尾,使用MS-222麻醉后迅速解剖,将脑组织保存于RNA keeper溶液中,取样时间点参考赵建等[27]对鱼类昼夜摄食节律的研究确定。

    • 把光倒刺鲃分为对照组、饥饿4 d组、饥饿7 d组、饥饿7 d再投喂4 d组和饥饿7 d再投喂7 d组,每组10尾,置于100 cm×60 cm×60 cm的水族箱中,每天8:00进行投喂,水温22~26 ℃,实验时间为2017年10月,实验用鱼置于室内自然光照和自然昼夜节律下,水面光照强度为0~430 lx。在实验结束当天11:00取脑组织,每次取6尾用于RNA表达量检测。

    • 取25 mg光倒刺鲃肌肉组织,使用生物工程 (上海)股份有限公司 (简称生工)的Ezup柱式DNA试剂盒提取DNA,使用Prep柱式DNA胶回收试剂盒回收DNA。根据金线鲃 (Sinocyclocheilus grahami)的编码区序列设计引物F1和R1 (表1),以光倒刺鲃基因组DNA为模板进行扩增,根据扩增出的光倒刺鲃mc5r中间序列片段,正向和反向各设计3条特异性染色体步移引物,分别为F2、F3、F4、R2、R3和R4,与Genome Walking Kit (TaKaRa)试剂盒提供的兼并引物进行热不对称PCR反应,反应步骤和反应条件按试剂盒说明书进行操作,送生工测序,得到正向和反向序列片段。

      引物
      primer
      引物序列 (5'−3')
      primer sequence
      用途
      application
      产物大小/bp
      product size
      F1AAGATGCCCTGTCTACCAACCC克隆850
      R1GGTCCAAATCCCTCCAATGATG克隆
      F2GGAGGGAAAACAACAGCACAAGC克隆750
      R2GGTCCAAATCCCTCCAATGATG克隆800
      F3GGTTAAAGATGCCCAACCCACC克隆800
      R3GGATGAGGTGGAGAAAGAACGG克隆800
      F4CTACTTACTCACCAACCGCCAG克隆850
      R4CTTTGATCGACAGCGTGTCCC克隆900
      FAACACTTCAGAGGCCACCCTGqRT-PCR150
      RTGAGCTGCTCGCATGCTTTGGqRT-PCR
      18sFTGATCGTCTTCGAGCCTCTGAC内参150
      18sRAATTCTTGGACCGGCGCAAGAC内参

      表 1  光倒刺鲃mc5r基因克隆和表达分析的引物

      Table 1.  Primers for cloning and expression analysis of mc5r gene in S. hollandi

    • 将测序获得的中间、正向和反向序列片段用SeqMan软件进行拼接比对,把拼接所获得的序列在NCBI的Blast工具上进行比对,确认所获得序列是mc5r基因序列,用软件DNAMAN对光倒刺鲃mc5r序列的CDs区进行翻译,得到其编码的氨基酸序列。利用在线工具TMHMM Service v.2.0对光倒刺鲃mc5r的跨膜蛋白进行预测。使用MEGA 5.0软件中Neighbor-Joining法构建系统发育树,Bootstrap method检测重复1 000次。

    • 取5尾光倒刺鲃的15个组织:大脑、小脑、中脑、间脑、延脑、肝、肾、肠、胃、脾、肌肉、鳃、心脏、性腺、眼,保存于RNA keeper溶液中。使用Trizol法提取RNA,用1%琼脂糖电泳检测RNA质量。根据PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 说明书对所得的RNA进行反转录。按照SYBR® Premix Ex TaqTM II (Tli RNaseH Plus) 试剂盒的要求,使用ABI7000荧光定量PCR仪进行Real-time PCR检测mRNA的表达量,每个组织样品设置3个重复。用18S作为内参基因。实验数据使用2−ΔΔCt方法进行计算分析。

    • 光倒刺鲃mc5r基因的序列长度为1 947 bp,编码区长987 bp,编码329个氨基酸 (图1图2),含有7个跨膜α螺旋结构。

      图  1  光倒刺鲃mc5r基因组扩增序列结果

      Figure 1.  Sequence results of S. hollandi mc5r genome DNA

      图  2  光倒刺鲃mc5r核苷酸序列以及推测的氨基酸序列

      Figure 2.  mc5r nucleotide sequence and deduced amino acid sequence of S. hollandi

      分析该蛋白的理论等电点为8.60;相对分子质量为37 213.62,其中亮氨酸 (Leu)的含量最高 (11.3%);色氨酸 (Trp)的含量最低 (1.2%)。分析显示,该蛋白的不稳定指数为47.09,属于不稳定蛋白。水合性的总平均值 (GRAVY)为0.803,表示该蛋白为疏水蛋白。

    • 在GenBank上和其他物种的mc5r氨基酸序列比对发现,光倒刺鲃与鲤 (Cyprinus carpio)、犀角金线鲅 (S. rhinocerous)的同源性高达98%,与人的同源性仅为70.72%。将所得的光倒刺鲃mc5r基因预测的氨基酸序列与GenBank中的33个已知mc5r氨基酸序列利用MEGA 5.0软件进行比对得出 (图3),光倒刺鲃和斑马鱼 (Danio rerio) 聚为一支,说明其与斑马鱼的亲缘关系最近;然后与鲤科的鲤、武昌鱼 (Megalobrama amblycephala)、犀角金线鲅、金线鲃和鲫 (Carassius auratus)组成的分支聚为一支,说明其与鲤形目鱼类的亲缘关系较近;再与鲶形目斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus)、鲑形目大鳞大麻哈鱼 (Oncorhynchus tshawytscha)和虹鳟 (O. mykiss)、鲀形目红鳍东方鲀 (Takifugu rubripes)、鲈形目大黄鱼 (Larimichthys crocea)等鱼类聚为一大支,光倒刺鲃与鲶形目和鲑形目鱼类亲缘关系较近,与鲀形目和鲈形目鱼类的亲缘关系较远;最后和哺乳类(人等)聚为一支。

      图  3  光倒刺鲃与其他物种mc5r氨基酸序列构建的系统发育树

      Figure 3.  Phylogenetic tree constructed from mc5r amino acid sequence of S. hollandi and other species

    • 通过qRT-PCR对光倒刺鲃mc5r在不同组织中的表达量进行研究。结果显示,光倒刺鲃mc5r在脑中的表达量较高,尤其是在大脑中的表达量最高;间脑与心脏的表达量次之;中脑和小脑的表达量较少,而在胃、肾、肌肉、脾、鳃、肠、性腺、肝、延脑和眼中仅微量表达(图4)。

      图  4  光倒刺鲃mc5r在不同组织中的表达

      Figure 4.  Expression of S. hollandi mc5r in different tissues

    • 光倒刺鲃禁食组和投喂组,在当天11:00 (投喂后3 h)大脑mc5r的表达量最高;15:00 (投喂后7 h)已经呈显著下降趋势,20:00 (投喂后12 h)大脑mc5r的表达量最低;次日8:00 (投喂后24 h)大脑mc5r的表达量有所升高(图5)。此外,在投喂后7 h,光倒刺鲃mc5r投喂组的表达量显著高于禁食组,而在其他时间段禁食组和投喂组大脑mc5r的表达量没有显著差异。

      图  5  光倒刺鲃大脑mc5r的日周期表达

      Figure 5.  Daily periodicitye expression of mc5r in brain of S. hollandi

    • 光倒刺鲃饥饿再投喂实验中,大脑mc5r的表达情况见图6。第0~第7天由于光倒刺鲃处于饥饿状态,大脑mc5r微量表达;在第8天开始投喂后,其大脑mc5r的表达量显著升高;但在第11和第14天,与第8天相比其大脑mc5r的表达量呈下降趋势。

      图  6  光倒刺鲃mc5r mRNA饥饿再投喂的表达情况

      Figure 6.  Expression profiles of mc5r at starvation and refeeding condition in S. hollandi

    • 本研究通过同源克隆和染色体步移得到光倒刺鲃mc5r的基因序列,对所获得的氨基酸序列与其他物种进行同源性和系统进化分析,得出光倒刺鲃与鲤、犀角金线鲅的同源性高达98%,与人的同源性为70.72%,表明其与斑马鱼、武昌鱼和鲤等鲤科鱼类的亲缘关系较近,而与鸟类、两栖类和哺乳类等亲缘关系较远,有着较大差异。

      光倒刺鲃mc5r主要在脑中表达,其中在大脑的表达量最高,中脑、间脑和小脑表达较高,在胃、肾、肌肉、脾、鳃、肠、性腺、肝和眼中仅微量表达。研究表明mc5r对于脂质代谢和分泌腺的分泌有调节作用[10-14]mc5r对能量平衡也有调节作用[28],而在鱼类中,脑与其脂质代谢和能量平衡的调节作用也密切相关,所以光倒刺鲃脑中mc5r的表达量相对较高。mc5r在心脏中表达也较高,这可能与心脏供血需要一定能量,而mc5r在能量稳态中起重要作用[28]有关,也表明光倒刺鲃mc5r可能对能量平衡有一定调节作用。光倒刺鲃mc5r在不同组织的表达结果与其他鱼相似。在团头鲂中,mc5r在大脑的表达最高,其次是表皮、眼等与外分泌相关的组织[29];在金鱼中,mc5r在脑、眼和表皮有较高表达,肠、肝和肌肉中微量表达[30];在斑马鱼中,mc5r在脑、卵巢、胃肠道有较高表达,同时心脏中也有表达[31]。表明mc5r在不同鱼类各组织中的功能相似,在脂质代谢和能量平衡方面有重要作用。

      生物钟能够影响多种生理活动,例如内分泌、食物消化吸收和肝脏新陈代谢等[32]mc5r对于脂质代谢[12-13]和能量平衡[16]有一定调节作用。在光倒刺鲃中,不管投喂与否,光倒刺鲃mc5r的表达量会随着日周期的变化而变化,表明mc5r的表达受昼夜节律影响,同样光倒刺鲃的摄食、代谢等生理活动也可能会受到昼夜节律的影响。在日周期实验中,投喂后7 h光倒刺鲃mc5r的表达量显著高于未投喂组,说明摄食同样能够影响mc5r的表达。

      在光倒刺鲃饥饿再投喂实验中,当光倒刺鲃遭受饥饿时,其大脑中mc5r的表达量较低,而再投喂后大脑中mc5r的表达量显著升高,随后逐渐降低。有研究表明激活mc5r能够促进肌肉对葡萄糖的摄取[16],并与皮脂腺代谢相关[33]。饥饿再投喂后,光倒刺鲃大脑中mc5r的表达量显著升高,推测mc5r基因可能在光倒刺鲃的摄食中有重要调节作用,并在饥饿再投喂后的补偿生长中扮演一定角色。

参考文献 (33)

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